嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）總抗體檢測試劑盒（ELISA）的研制

馬玉英

（寧夏賀蘭縣農牧漁業(yè)局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 賀蘭 750200）

試驗研究

嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）總抗體檢測試劑盒（ELISA）的研制

馬玉英

（寧夏賀蘭縣農牧漁業(yè)局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 賀蘭 750200）

為建立檢測嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）血清總抗體的雙抗原夾心ELISA方法并進行初步試用，通過原核表達得到SFTSV-NP重組蛋白，以該蛋白作為ELISA的包被和酶標記抗原，確定抗原的最佳包被濃度和血清稀釋度，優(yōu)化各項試驗條件，在此基礎上研制試劑盒，并對試劑盒的重復性、特異性等方面進行研究。結果發(fā)現(xiàn)抗原最適包被濃度為4.0 μg/ml，血清的最佳稀釋濃度為1∶40，重復性試驗表明批內和批間的變異性都低于10%。該試劑盒敏感性高、特異性強、重復性良好，可應用于SFTSV的研究和臨床檢測。

嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒；抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗

近幾年來，我國湖北、河南、山東等地相繼發(fā)現(xiàn)一些以發(fā)熱伴血小板減少為主要表現(xiàn)的感染性疾病病例，該病的主要傳播途徑為蜱蟲的叮咬。2010年5月，中國疾病預防控制中心將該病毒引起的病例定義為“嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征”，并開展了病例的主動發(fā)現(xiàn)、搜索等監(jiān)測工作［1-2］。從病人血清中分離到1株病毒，并完成了病毒的全基因序列測定和同源性比較，通過對病毒基因結構和形態(tài)特征的詳細分析，確定該病毒為一種新型布尼亞病毒［3］。2011年3月17日出版的國際權威醫(yī)學刊物《新英格蘭醫(yī)學雜志》刊登了該研究成果，這是國際上首次報道這一布尼亞科病毒。

到目前為止，該病毒的檢測方法還很有限，主要有PCR檢測、免疫熒光檢測（IFA）、血清學檢測、電子顯微鏡檢測等［4］。然而這幾種檢測方法均存在一些缺陷，如病毒核酸檢測程序繁瑣，耗時耗力且對儀器的要求高，電子顯微鏡檢測費用高且檢測靈敏度低，要求檢測者有熟練的技術［5］，不利于SFTSV的快速檢測和診斷。研制操作簡便、敏感性高、特異性好、能快速診斷SFTSV的試劑盒和監(jiān)測方法十分必要。該項目以ELISA雙抗原夾心法，檢測患者血清中是否存在SFTSV抗體，以確定患者是否感染或曾經感染過SFTSV，從而為臨床診斷提供幫助。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒、血清

SFTSV毒株、陽性血清均由江蘇疾病預防控制中心病原微生物研究所保存。

1.1.2引物、原核表達載體

引物、原核表達載體pET28a-NP均由江蘇疾病預防控制中心病原微生物研究所構建。

1.1.3試劑及主要儀器

病毒TRNA提取試劑Trizol、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）、弗氏完全、不完全佐劑購自美國Sigma公司；PCR儀：德國Biometra公司產品；恒溫儀、離心機：德國Eppendorf公司產品；DEM-Ⅱ自動酶標洗板機：北京拓普生產；MODEL 680型酶標儀；96孔可拆式ELISA酶標板：丹麥NUNC公司生產。

1.2方法

1.2.1制備重組抗原

根據Trizol試劑說明書從血清中提取總RNA，通過RT-PCR技術擴增出SFTSV-NP基因，分別用限制性內切酶BamH I、EcoR I酶切上述擴增片段與質粒pMD18-T，回收目的基因和載體片段，進行連接反應。將連接產物轉化感受態(tài)宿主菌E.coli DE3，挑取經酶切鑒定的單個白色菌落，37℃培養(yǎng)至OD600 nm為0.4～0.6時，加ITPG 37℃誘導6 h，收集菌體，純化目的蛋白，具體操作步驟參考文獻［6-8］。

1.2.2酶標記抗原

對表達純化的NP重組蛋白采用過碘酸鈉法標記辣根過氧化物（HRP），經Supperdex 200分子篩分離純化，方法參考文獻［9］。

1.2.3ELISA各項試驗條件的優(yōu)化

1.2.3.1ELISA抗原包被濃度和血清稀釋度確定

以方陣滴定試驗檢測抗原的最佳包被濃度和血清最適稀釋度。橫排為不同稀釋濃度的重組蛋白（8.0 μg/ml、6.0 μg/ml、4.0 μg/ml、2.0 μg/ml、1.0 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml），縱排分別加入1∶20、1∶40、1∶80、1∶160倍比稀釋的SFTSV陽性血清和陰性血清。計算陽性血清孔的平均OD450 nm值（P）和陰性血清孔的平均OD450 nm值（N）之比（P/N），比值最大孔的抗原濃度和血清稀釋倍數即為最佳。

1.2.3.2酶標抗原的最佳使用濃度

將酶標抗原進行不同濃度的稀釋，各取1滴加入系統(tǒng)采用的1 ml底物液中，迅速混勻后觀察顏色變化，在1～1.5 min內出現(xiàn)明顯顏色變化的二抗?jié)舛龋簿褪亲罴训拿笜丝乖褂脻舛取?/p>

1.2.3.3在已確定的各種條件下，選擇適合的封閉液和稀釋液

分別用5%～10%脫脂奶粉、5%～10%馬血清、1%白明膠、1%BSA作封閉液；用1%～5%脫脂乳、3%～5%馬血清、0.1%白明膠、0.1%BSA作稀釋液，測450 nm的OD值，選本底值、P/N值大、OD值最高者為最適。

1.2.3.4各個步驟作用時間的選擇（選擇本底值低、P/N比值最高者為最適作用時間）

包被條件：其他條件不變，選4℃過夜、37℃作用1 h 后4℃過夜、37℃作用2 h，這3個梯度；

封閉時間：設0.5 h、1 h、2 h、4 h，共4個梯度；

血清樣品反應時間：設10 min、20 min、30 min、40 min，共4個梯度；

酶標抗原作用時間：設30min、1h、2h，共3個梯度；

顯色時間：設顯色時間分別為5 min、8 min、10 min、12 min、14 min，共5個梯度。

1.2.3.5臨界值的確定

隨機挑取SFTSV抗體陽性血清20份，抗體陰性血清80份，以優(yōu)化的抗原包被量和血清工作濃度對血清進行ELISA檢測，測定450 nm的OD值，計算陰性血清的平均OD值（）和標準偏差（SD），求得陰陽性判定界限x±3SD。

1.2.4試劑盒總體性能評價

1.2.4.1特異性試驗

用組裝完成的試劑盒對可以引起出血熱的病毒、細菌進行檢測（例：腎綜合征出血熱（HERS）病毒、流感病毒、鉤端螺旋體），同時選20份SFTSV陰性血清，對試劑盒的特異性進行檢測。

1.2.4.2敏感性試驗

其他反應條件均在最適的情況下，將陽性血清1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120稀釋8個梯度進行ELISA檢測。

1.2.4.3重復性試驗

批內重復試驗：在同一批次內隨機挑選5塊ELISA試劑盒檢測已知背景的血清5份（陽性血清3份，陰性血清2份），計算“批內變異系數”。

批間重復試驗：在不同批次隨機抽取5個ELISA試劑盒檢測已知背景的血清5份（陽性血清3份，陰性血清2份），計算“批間變異系數”。

2　結果

2.1重組抗原制備

原核表達質粒pET28a-NP轉化E.coli BL21（DE3）后，經IPTG誘導獲得表達蛋白與預期大小相符。表達產物經試劑盒純化后純化獲得了較高純度的目的蛋白。

2.2ELISA各項試驗條件優(yōu)化結果

從方陣滴定法檢測結果表1可以看到，隨著包被抗原濃度的減少和血清稀釋倍數的增加，血清的OD值不斷降低，當抗原包被濃度在4 μg/ml，血清稀釋倍數為1∶40時，陽性血清的OD值在1.0左右，且陰性血清的OD值低，陽性陰性血清比值（P/N）高。一般情況下，ELISA檢測儀在檢測OD值為1.0左右時誤差最小，反應最靈敏，以此為根據，選擇4 μg/ml的抗原包被量為最適包被濃度，而被檢血清的最佳稀釋為1∶40。

當酶標抗原NP-HRP稀釋到1∶1 000時與底物反應能在1～1.5 min內出現(xiàn)明顯的顏色變化，因此將酶標抗原的工作濃度定為1∶1 000。封閉效果最好的是10%脫脂乳；0.1%BSA為樣品稀釋液；包被時間為37℃水浴2h；4℃封閉過夜；待檢血清在37℃作用30 min及；酶標抗原在37℃作用20 min；5～8 min為最適宜顯色時間。

表　方陣滴定法確定抗原最適包被濃度和血清最佳稀釋倍數

2.3ELISA判定標準的確定

試驗測得陰性血清OD450 nm均值范圍為0.12±0.03，在此基礎上確定該ELISA試劑盒的判定標準為S/N＞2.1，且陽性血清A450 nm＞0.25時則待檢血清SFTSV總抗體為陽性。

2.4特異性試驗

對其有出血熱癥的陽性血清和20份陰性血清進行檢測，結果均為陰性，沒有出現(xiàn)交叉反應。

2.5敏感性試驗

通過檢測倍比稀釋的陽性血清，結果顯示當血清稀釋濃度達到1∶640時，按以上判定標準判定仍為陽性，說明該試劑盒的靈敏度為1∶640.

2.6重復性試驗

用同一批次和不同批次的ELISA試劑盒對已知背景的5份血清（陽性血清3份，陰性血清2份）作批內和批間重復試驗，計算得出“批內重復系數”在2.53%～5.62%，“批間重復系數”在4.17%～5.89%，重復系數都小于10%，說明試劑盒的重復性良好。

3　討論

嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒簡稱“新布尼亞病毒”，屬于布尼亞（Bunya）病毒科白蛉病毒屬［2］。病毒體呈球形，直徑80～100 nm，外有脂質包膜，表面有棘突。基因組包含3個單股負鏈RNA片段（L、M和S），L片段全長為6 368個核苷酸，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶；M片段全長為3 378個核苷酸，含有單一的讀碼框架，編碼1 073個氨基酸的糖蛋白前體；S片段是一個雙義RNA，基因組以雙向的方式編碼病毒核蛋白和非蛋白結構［10］。病毒基因組末端序列高度保守，與白蛉病毒屬其他病毒成員相同，可形成鍋柄狀結構［1］。

該病毒從2010年9月到2011年3月，在中國湖北、河南、山東、江蘇、安徽和遼寧等6個省份導致至少36名患者死亡。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、消化道癥狀、血小板減少、白細胞減少、肝腎功能損害，部分患者有出血表現(xiàn)。該病主要發(fā)生在丘陵、山區(qū)，患者以從事農業(yè)生產的成年農民為主，部分患者被蜱叮咬。流行期為4～10月，流行高峰為5～7月［11］。

到目前為止SFTSV的研究還處于起步階段，國內外對SFTSV的檢測主要包括兩方面：抗原檢測和抗體檢測。抗原檢測是通過電子顯微鏡和核酸測序；抗體檢測的方法主要有間接免疫熒光法（IFA），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），中和試驗。通常應用最為廣泛的是ELISA法，但是市場內并沒有商品化的SFTSV抗體或試劑盒，要對SFTSV進行檢測就必須經過繁復的試驗過程，且對儀器和檢測員的要求都很高。

該試驗使用重組蛋白NP作為包被抗原和酶標記抗原，建立了雙抗原夾心ELISA法，并對其反應條件進行優(yōu)化，在此基礎上研制出ELISA試劑盒。通過對試劑盒的檢測表明其特異性良好，未于布尼亞其他病毒發(fā)生交叉反應，并且ELISA方法的成功建立克服了其他檢測法存在的缺點，該試劑盒的檢出率高，費用少，對儀器及檢驗員的要求不高，為試劑盒的推廣應用奠定了基礎。

［1］發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南.北京：中國衛(wèi)生部辦公廳，2010.

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［4］張麗敏.發(fā)熱伴血小板減少綜合征實驗室檢測方案［N］.中國社區(qū)醫(yī)師，2010-10-24.

［5］李成，谷守林.快速檢測動物病毒電鏡技術［J］.中國畜禽傳染病，1997，19（6）：14-19.

［6］吳守麗，何似，李世清，等.雙抗原夾心法ELISA在腎綜合征出血熱診斷中的應用［J］.中國媒介生物學及控制雜志，2007，18（6）：492-494.

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美國新技術可通過雞胚檢測分公母

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英國退歐對美元的沖擊在牲畜市場中影響重大

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英國退歐對于美國牲畜生產商來說，最重要的短期可能結果是美元價值所發(fā)生的改變與銷往海外的美國產品相對價格影響。

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