惡性腫瘤患者益生菌活性與抗菌藥物使用相關性研究

張紅旭　韓　楓　黃金岳　凌　心　劉廣鋒　王　艷.徐州醫學院附屬醫院藥學部，江蘇徐州　00；.江蘇省徐州市腫瘤醫院藥劑科，江蘇徐州　005；.江蘇省徐州市腫瘤醫院檢驗科，江蘇徐州　005

惡性腫瘤患者益生菌活性與抗菌藥物使用相關性研究

張紅旭1,2韓楓2黃金岳2凌心2劉廣鋒3王艷1
1.徐州醫學院附屬醫院藥學部，江蘇徐州221002；2.江蘇省徐州市腫瘤醫院藥劑科，江蘇徐州221005；3.江蘇省徐州市腫瘤醫院檢驗科，江蘇徐州221005

目的 研究惡性腫瘤患者益生菌活性與抗菌藥物使用的相關性。方法 選取2012年6月～2015年12月徐州醫學院附屬醫院（以下簡稱“我院”）首診首治的早期惡性腫瘤患者（惡性腫瘤組）137例以及我院同期健康體檢者（健康對照組）183名作為研究對象，采用平板計數法檢測惡性腫瘤組及健康對照組糞便中細菌總數和乳酸菌數量，分析惡性腫瘤組細菌總數、乳酸菌數量與近三年抗菌藥物累積使用量的相關性。結果 根據抗菌藥物使用史及近三年抗菌藥物使用量，將惡性腫瘤組分為低天數組（1～25 d，72例）、中天數組（＞25～50 d，38例）、高天數組（＞50 d，27例）。惡性腫瘤組細菌總數增加，而乳酸菌數量減少，與健康對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。惡性腫瘤組細菌總數與抗菌藥物累積使用量呈低度正相關（r=0.452，P＜0.05），乳酸菌數量與抗菌藥物累積使用量呈低度負相關（r=-0.476，P＜0.05）。結論 在一定時間段內，抗菌藥物累積使用達到一定量后，惡性腫瘤患者益生菌活性與抗菌藥物使用存在低度負相關。

惡性腫瘤；益生菌；乳酸菌；活性；抗菌藥物；相關性

［Abstract］Objective To study the correlation between the activity of probiotics and antibiotics use in the patients with malignant tumor.Methods One hundred and thirty seventy patients with malignant tumor（malignant tumor group）first diagnosed and treated in the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College（"our hospital"for short）and 183 health persons（healthy control group）for the corresponding period in our hospital from June 2012 to December 2015 were selected as research objects.The total number of bacteria and the number of lactobacillus in the feces of malignant tumor group and healthy control group were detected by using plate count method.The correlation of the total number of bacteria and the number of lactobacillus with cumulative amount of antibiotics use in recent 3 years was analyzed.Results According to the history of antibiotics use and the cumulative amount of antibiotics use in recent three years，the malignant tumor group was divided into the low days group（1-25 days，72 cases），the moderate days group（＞25-50 days，38 cases）and the high days group（＞50 days，27 cases）.The total number of bacteria of the malignant tumor group was increased significantly，while the number of lactobacillus was significantly decreased，compared with the healthy control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.There was a weakly positive correlation between the total number of bacteria and cumulative amount of antibiotics use of the malignant tumor group（r=0.452，P＜0.05）；there was a weakly negative correlation between the number of lactobacillus and cumulative amount of antibiotics use of the malignant tumor group（r=-0.476，P＜0.05）.Conclusion There is a weakly negative correlation between activity of probiotics and antibiotics use in malignant tumor patients after antibiotics cumulative use reaches a certain amount in a certain period of time.

［Key words］Malignant tumor；Probiotics；Lactobacillus；Activity；Antibiotics；Correlation

健康人體腸道存在著大量細菌，形成一個相互制約的微生態系統，具有相對的穩定性，是維持腸道功能、維持腸黏膜屏障完整、拮抗病原微生物的定植、調控人體免疫功能的重要因素，對保證人體健康有重要意義；益生菌指攝入足夠數量后可對宿主的健康產生有益作用的活性微生物，目前國際上公認乳酸菌是最具代表性的腸內益生菌，乳酸菌（尤其是乳桿菌和雙歧桿菌）幾乎成為益生菌的代名詞。益生菌主要通過調節宿主體內的菌群平衡發揮增強機體免疫力和抗腫瘤作用［1-7］。體內益生菌減少與菌群失調可以導致機體免疫力下降，使腫瘤發生成為可能。乳酸菌在生物學上是革蘭陽性、厭氧或兼性厭氧，所以大多數抗細菌藥都對其有殺滅或抑制作用。

以往，對抗菌藥物不合理使用危害的研究和報道主要集中在細菌耐藥性、毒性及過敏反應，近年國外學者通過回顧性研究認為腫瘤的發生、發展、形成與抗菌藥物累積使用具有相關性，但機制尚未揭示［8-11］。本研究擬通過考察腫瘤患者體內益生菌活性與抗菌藥物使用的相關性，揭示抗菌藥物使用作為腫瘤危險因素的機制，為促進抗菌藥物合理使用和腫瘤預防提供理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料

惡性腫瘤組：選取2012年6月～2015年12月徐州醫學院附屬醫院（以下簡稱“我院”）首診首治的早期惡性腫瘤患者137例，其中男64例，女73例；宮頸癌9例，乳腺癌46例，甲狀腺癌34例，腎癌7例，膀胱癌37例，鼻咽癌2例，肝癌2例；年齡24～76歲，平均（54.8±3.8）歲。所有病例均經病理、CT等確診，未經放療或化療。入組條件：①首診首治的惡性腫瘤患者；②腫瘤分級分期較早；③經流行病學調查無腫瘤危險因素史；④有抗菌藥物使用史。排除標準：近期有胃腸疾病史、在調查前2周內使用過抗菌藥物。健康對照組：選取我院健康體檢中心同期健康體檢者183名，其中男86名，女97名，年齡25～72歲，平均（56.4± 5.1）歲。入組條件：①同期健康體檢者；②無抗菌藥物使用史。排除標準：①近三年有免疫系統疾病史；②近期有胃腸疾病史，在調查前2周內均使用過抗菌藥物。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2材料

1.2.1樣品采集糞便：將在醫院現場采集到的新鮮糞便樣品迅速裝于滅菌管中，封好放入冷藏厭氧盒中，立刻帶回實驗室進行分離。

1.2.2培養基TTC營養瓊脂、MRS瓊脂（青島海博生物科技有限公司）。

1.2.3試劑乳酸菌成套鑒定生化管、V-P試劑盒、硝酸鹽還原試劑盒、吲哚試劑盒（青島海博生物科技有限公司）。

1.2.4儀器與設備MJQ70-Ⅰ型壓力蒸汽滅菌器 （徐州四方醫療器械公司）；奧林巴斯CX21BIM-SET5生物顯微鏡 （奧林巴斯公司）；METTLER TOLEDD電子天平［梅特勒-托利多量儀器（上海）有限公司］；超凈工作臺（蘇州市姑蘇空調凈化有限公司）；2.5 L圓底立式厭氧培養袋、2.5 L厭氧產氣包、厭氧指示劑（青島海博生物科技有限公司）；XK97-A菌落計數器（江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

1.3方法

以抗菌藥物使用為研究因素，通過合理配對，減少混雜因素的影響，采用病例對照研究進行惡性腫瘤患者益生菌活性與抗菌藥物使用相關性單因素研究。

1.3.1問卷調查參照國家癌癥中心城市癌癥早診早治項目防癌風險評估問卷表制訂調查表，內容包括年齡、性別、飲食習慣、生活習慣、心理和情緒、既往史、惡性腫瘤家族史、抗菌藥物使用史（近三年累積使用天數）等人口學信息，調查以面談為主，輔以調查病歷記錄。

1.3.2細菌總數的測定取出采集的新鮮糞便樣品中間部分，稱取1.0 g樣品，加入到裝有9.0 mL無菌生理鹽水的試管中，吸取菌液進行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66個稀釋度，按10-6～l0-1的順序分別吸取各稀釋度的供試液1 mL注入直徑9 cm的平皿內，用經滅菌并冷卻到45～50℃的細菌培養基傾倒平板，37℃培養48 h，觀察并記錄細菌數目［12］。

1.3.3乳酸菌的分離、計數取出采集的新鮮糞便樣品中間部分，稱取1.0 g樣品，加入到裝有9.0 mL無菌生理鹽水的試管中，吸取菌液進行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-44個稀釋度，按10-4～l0-1的順序分別吸取各稀釋度的供試液1 mL注入直徑9 cm的平皿內，用經滅菌并冷卻到45～50℃改良MRS固體培養基傾倒平板，37℃厭氧培養48 h，計數［12］。

1.3.4乳酸菌的初步鑒定形態學鑒定：對分離得到的乳酸菌進行菌落形態觀察，進行革蘭染色；生理生化鑒定：按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》中乳酸菌的生化特性，分別進行觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、硫化氫試驗、吲哚試驗、葡萄糖產酸產氣試驗、碳水化合物發酵產酸試驗、運動性實驗，檢測在pH 4.5，溫度15、45℃，6.5%NaCl條件下的生長情況［12］。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。數據正態性檢驗采用矩法檢驗，正態分布計量資料采用均數±標準差（±s）表示，方差齊性檢驗采用Bartlett檢驗，兩組計量資料比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1問卷調查結果

調查惡性腫瘤組及健康對照組以往抗菌藥物使用史及近三年抗菌藥物使用量（以抗菌藥物累積使用天數為指標），根據文獻及預實驗結果將惡性腫瘤組分為低天數組、中天數組、高天數組，見表1。

表1　惡性腫瘤患者抗菌藥物使用量調查結果

2.2乳酸菌的鑒定結果

2.2.1形態學鑒定乳酸菌在厭氧條件下生長良好，菌落呈乳白色、表面光滑，涂片鏡下觀察革蘭染色為陽性，見圖1～2。

圖1　乳酸菌在MRS平板上的菌落形態

圖2　乳酸菌的光學顯微鏡下形態學（革蘭染色，10×100）

2.2.2菌類鑒定符合乳酸菌的性質：已分離的乳酸菌均為革蘭染色陽性，不運動，在H2O2酶實驗、H2S實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產氣實驗呈陰性，都能在15℃、45℃、pH 4.5、6.5% NaCl條件下生長良好，不發酵蔗糖和木糖，能發酵葡萄糖和乳糖。

2.2.3乳酸菌在光學顯微鏡下的形態學特性乳酸菌細胞形態為多形性，呈細長桿狀、較粗桿狀、球桿狀等，排列呈柵欄狀、鏈狀等，見圖2。

2.3細菌及乳酸菌檢測結果

2.3.1兩組細菌、乳酸菌數量檢測結果比較惡性腫瘤組與健康對照組細菌、乳酸菌數量檢測結果比較顯示，惡性腫瘤組細菌總數明顯增加，而乳酸菌數量明顯減少，與健康對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；低天數組與健康對照組在細菌總數和乳酸菌數量差異無統計學意義（P＞0.05）；中、高天數組與健康對照組在細菌總數和乳酸菌數量差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表2　兩組細菌、乳酸菌數量檢測結果比較（±s）

表2　兩組細菌、乳酸菌數量檢測結果比較（±s）

注：“*”代表各組與健康對照組比較的統計結果；“-”代表無數據

組別　例數　細菌總數（×106cfu/g）*t值　P值　乳酸菌數量（×103cfu/g）*t值　P值健康對照組惡性腫瘤組低天數組中天數組高天數組183 137 72 38 27 7.8±2.6 10.2±3.8 8.2±4.3 11.6±3.1 13.7±3.5 ----2.106 1.667 2.345 2.742 0.036 0.146 0.033 0.008 7.2±0.7 4.4±0.4 6.3±0.6 2.9±0.5 1.4±0.3 2.715 1.567 2.726 3.329 0.028 0.152 0.027 0.007

2.3.2惡性腫瘤組細菌總數、乳酸菌數量檢測結果組間比較惡性腫瘤組細菌總數、乳酸菌數量組間比較分析顯示，低天數組細菌總數、乳酸菌數量與中天數組、高天數組比較差異均有統計學意義 （均P＜0.05），中天數組細菌總數、乳酸菌數量與高天數組比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　惡性腫瘤組細菌、乳酸菌數量檢測結果組間比較（±s）

表3　惡性腫瘤組細菌、乳酸菌數量檢測結果組間比較（±s）

注：P1代表低天數組與中天數組比較，P2代表低天數組與高天數組比較，P3代表中天數組與高天數組比較

組別　例數 年齡（歲）細菌總數（×106cfu/g）乳酸菌數量（×103cfu/g）低天數組中天數組高天數組F值P值P1值P2值P3值72 38 27 53.5±16.3 52.3±12.6 62.4±11.2 8.2±4.3 11.6±3.1 13.7±3.5 4.751 0.037 0.035 0.026 0.041 6.3±0.6 2.9±0.5 1.4±0.3 5.254 0.024 0.021 0.014 0.028

2.3.3相關性分析惡性腫瘤患者體內細菌總數、乳酸菌數量與患者近三年抗菌藥物累積使用量相關性分析結果顯示，惡性腫瘤組細菌總數與抗菌藥物累積使用量呈低度正相關（r=0.452，P＜0.05）；惡性腫瘤組乳酸菌數量與抗菌藥物累積使用量呈低度負相關（r= -0.476，P＜0.05）；低天數組細菌總數與抗菌藥物累積使用量無相關性（r=0.165，P＞0.05），乳酸菌數量與抗菌藥物累積使用量無相關性 （r=-0.138，P＞0.05）；中天數組、高天數組細菌總數與抗菌藥物累積使用量呈正相關（r=0.503、0.577，均P＜0.05），乳酸菌數量與抗菌藥物累積使用量呈負相關（r=-0.494、-0.568，均P＜0.05）。

3　討論

益生菌主要通過調節宿主體內的菌群平衡發揮增強機體免疫力和抗腫瘤作用［13-14］。體內益生菌減少與菌群失調可以導致機體免疫力下降［15-16］。乳酸菌具有革蘭陽性、厭氧或兼性厭氧的生物學特性，所以大多數抗菌藥都對其有抑制或殺滅作用［17-19］。

長期以來，中國是世界上抗菌藥物濫用情況最嚴重的國家之一，在現實生活當中，一方面，患者無處方自行購買使用抗菌藥物現象日益嚴重，而對濫用抗生素產生的危害卻知之甚少；另一方面，醫務人員由于利益驅動，經常超量、不規范使用抗菌藥物。世界衛生組織資料顯示，我國住院患者抗菌藥物的實際使用率高達80%，其中使用廣譜抗菌藥物和聯合使用兩種以上抗菌藥物的占58%，遠遠高于30%這一國際水平，而在英美發達國家的使用率僅為22%～25%。另據不完全統計，目前我國使用量、銷售量列在前15位的藥品中，有10種是抗菌藥物，而且我國住院患者抗菌藥物的費用占總費用的50%以上，遠高于國外的水平（15%～30%）［20］。在我國，超范圍、無針對性地使用抗生素的現象越來越普遍。

本研究結果提示，在一定時間段內，抗菌藥物累積使用達到一定量后，抗菌藥物對腸道益生菌的殺滅作用存在劑量相關性，抗菌藥物累積使用量越大，殺滅作用越明顯；提示抗菌藥物不合理使用殺滅了腸道益生菌，破壞了腸道正常的菌群平衡，引起淋巴細胞等免疫細胞活性下降，導致機體免疫力下降，使腫瘤發生成為可能。

本課題研究的意義在于警示抗菌藥物不合理使用殺滅了腸道益生菌，破壞了腸道正常的菌群平衡，腸道菌群失調，引起腸道消化功能障礙、機體免疫力下降及誘發腫瘤發生、發展、形成；通過合理使用抗菌藥物，可以保護機體益生菌及淋巴細胞等免疫細胞活性，維護機體正常免疫細胞功能，在一定程度上降低腫瘤發生的風險。

本研究是以抗菌藥物使用為研究因素的單因素研究，通過合理設計處理，降低了混雜因素的影響，但由于本研究為小樣本量的回顧性研究，故其可靠性有待進一步的大樣本研究來證實。

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Study on the correlation between the activity of probiotic and antibiotics use in the patients with malignant tumor

ZHANG Hongxu1,2HAN Feng2HUANG Jinyue2LING Xin2LIU Guangfeng3WANG Yan1
1.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu Province，Xuzhou221002，China；2.Department of Pharmacy，Xuzhou Tumor Hospital，Jiangsu Province，Xuzhou221005，China；3.Department of Clinical Laboratory，Xuzhou Tumor Hospital，Jiangsu Province，Xuzhou221005，China

R733

A

1673-7210（2016）05（b）-0129-04

江蘇省徐州市社會發展科技計劃項目（XZZDY 1405）。

張紅旭（1980-），男，碩士研究生，副主任藥師；研究方向：醫院藥學。

王艷（1970-），女，副教授，主任藥師，碩士研究生導師；研究方向：臨床藥學。

2016-01-22本文編輯：張瑜杰）