lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的作用研究

李培磊 展洋洋 張銘健 劉芳 殷鵬 傅志仁★

lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的作用研究

李培磊 展洋洋 張銘健 劉芳 殷鵬 傅志仁★

目的 研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA SPRY4-IT1（lncRNA SPRY4-IT1）在肝細(xì)胞肝癌（HCC）中的表達(dá)，及其對(duì)肝癌細(xì)胞系Hep G2惡性生物學(xué)表型的調(diào)控作用。方法 收集2013年9月至2014年12月60例肝癌及癌旁組織樣本，利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)lncRNA SPRY4-IT1在肝癌組織中的表達(dá)，并檢測(cè)lncRNA SPRY4-IT1在人源性肝癌細(xì)胞系Hep G2、HHCC、SK-HEP-1中的表達(dá)；利用小干擾RNA沉默Hep G2細(xì)胞內(nèi)lncRNA SPRY4-IT1表達(dá)，分別進(jìn)行Transwell 細(xì)胞遷移、侵襲及CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；建立肝癌裸鼠成瘤模型，觀(guān)察干擾lncRNA SPRY4-IT1表達(dá)后荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的情況。結(jié)果 比較癌旁組織，lncRNA SPRY4-IT1肝癌組織中的表達(dá)顯著上升（P=0.0109）；比較正常人肝細(xì)胞系L02，lncRNA SPRY4-IT1在肝癌細(xì)胞系Hep G2、HHCC、SK-HEP-1中表達(dá)明顯升高（P均＜0.01），且在Hep G2中上調(diào)尤為顯著。干擾lncRNA SPRY4-IT1表達(dá)后，Hep G2細(xì)胞的遷移和侵襲并未受到明顯影響（P＞0.05），然而其體外增殖活性受到顯著抑制（P＜0.01）；荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)也明顯受到抑制（P＜0.01）。結(jié)論 長(zhǎng)鏈非編碼RNA SPRY4-IT1在HCC中高表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)肝癌的增殖而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，可能是HCC潛在的治療靶點(diǎn)。

肝細(xì)胞肝癌 長(zhǎng)鏈非編碼RNA SPRY4-IT1 增殖 遷移 侵襲

肝癌是世界上最為常見(jiàn)的腫瘤之一，在我國(guó)的惡性腫瘤中位居第三［1］。肝癌根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型分為肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝膽管細(xì)胞肝癌，其中HCC所占比例高達(dá)90%［2］。HCC是一種多基因突變的疾病，其發(fā)生發(fā)展中伴隨復(fù)雜的分子機(jī)制。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長(zhǎng)度約為200nt的非編碼RNA，是基因轉(zhuǎn)錄的“垃圾產(chǎn)物”［3］。多項(xiàng)研究表明lncRNA SPRY4-IT1在黑色素瘤、胃癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌中高表達(dá)，且與惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等具有緊密相關(guān)性［4～7］。而關(guān)于lncRNA SPRY4-IT1在HCC中所發(fā)揮的生物學(xué)功能研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本文將對(duì)lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的表達(dá)情況及其所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)做進(jìn)一步研究，以期為HCC治療尋找新的分子靶點(diǎn)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 經(jīng)患者知情同意，收集2013年9月至2014年12月本中心60例HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本（癌旁及癌組織）。其中男43例，女17例；年齡40～75歲，平均（53.02±2.3）歲。所有患者術(shù)前未行放化療及介入等干預(yù)措施，手術(shù)均為根治性切除術(shù)，留取腫瘤組織及距離腫瘤組織＞5cm的癌旁組織。腫瘤基本情況：腫瘤直徑1.3～7.1cm，平均（4.6±1.7）cm。術(shù)后病理結(jié)果顯示均為HCC。腫瘤標(biāo)本取下后立即放入液氮中凍存。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。lncRNA SPRY4-IT1干擾序列（siSPRY4-IT1）、陰性對(duì)照序列（siNC）及GAPDH引物序列由上海吉瑪公司合成。RNA轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin購(gòu)自美國(guó)Polyplus-tansfection公司。in vivo-JetPEI購(gòu)自法國(guó)Polyplus Transfection公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。相對(duì)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒購(gòu)自日本Takra公司。Transwell細(xì)胞遷移檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Yeasen公司。ABI-7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司、5424R冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。Epoch96孔板微量分光光度儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。BX53 奧林巴斯顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。Tissuelyser-192全自動(dòng)樣品快速研磨儀購(gòu)自上海凈信科技有限公司。

1.3 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)及RNAi干擾：所有細(xì)胞均使用含10%濃度胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃、相對(duì)濕度90%條件下進(jìn)行培養(yǎng)。Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)采用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑并按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行l(wèi)ncRNA SPRY4-IT1干擾序列（siSPRY4-IT1）及陰性對(duì)照序列（siNC）的轉(zhuǎn)染。siSPRY4-IT1序列為：5'-CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT-3'，以無(wú)義序列siNC作為陰性對(duì)照。（2）RNA提取以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：取100mg凍存的組織，采用全自動(dòng)樣品快速研磨儀充分研磨，加入1ml Trizol試劑進(jìn)行RNA的提取。取1×107個(gè)細(xì)胞，加入1ml Trizol試劑進(jìn)行RNA提取。抽提后的RNA采用96孔板微量分光光度儀在波長(zhǎng)260nm及280nm下進(jìn)行濃度及純度的檢測(cè)，A260/A280為1.8～2.1說(shuō)明樣品純度合格。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR按照SYBR Green試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列如下：lncRNA SPRY4-IT1：Forward：5'-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3'；Reverse：5'-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3'；GAPDH：Forward：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'；Reverse：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'。（3）Transwell檢測(cè)Hep G2細(xì)胞遷移和侵襲：在遷移分析中，各組細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種于24空Transwell小室，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，上室加入100μl DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液，下室加入600μl含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出上室，吸取下室中培養(yǎng)液，加入結(jié)晶紫染色液100μl/孔，染色15min，PBS洗滌2遍，100倍顯微鏡下選取5個(gè)視野觀(guān)察細(xì)胞并計(jì)算平均值。在侵襲分析中，小室以基質(zhì)膜包被，后續(xù)步驟同遷移分析。（4）CCK8檢測(cè)Hep G2細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep G2細(xì)胞，以2×105/孔接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液200μl/孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。加入CCK8試劑1次/d 37℃孵育30min后，于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光光度值。連續(xù)測(cè)定72h。（5）肝癌裸鼠移植瘤模型的建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2細(xì)胞，消化細(xì)胞后采用DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ ml。取16只裸鼠，于每只裸鼠右后肢外側(cè)皮下注射100μl Hep G2細(xì)胞懸液成瘤。自第2周開(kāi)始使用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并計(jì)算瘤體體積，公式為：瘤體體積=4/3×π×r3［r=（a+b）/4］。（6）動(dòng)物分組及處理：Hep G2細(xì)胞接種1周后，將16只裸鼠隨機(jī)平均分為siNC對(duì)照組和siSPRY4-IT1處理組。siNC對(duì)照組：瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射jetPEI/siNC復(fù)合物（15μg siNC及 2.4μl JetPEI）；siSPRY4-IT1處理組：瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射jetPEI/siSPRY4-IT1復(fù)合物（15μg siSPRY4-IT及 2.4μl JetPEI）。復(fù)合物均采用0.9%生理鹽水稀釋至20μl。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SPRY4-IT1在HCC中的表達(dá)及RNAi干擾效果 采用qRT-PCR對(duì)60例肝癌及相對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織中l(wèi)ncRNA SPRY4-IT1的內(nèi)源性表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。與相應(yīng)正常癌旁組織比較，肝癌組織中l(wèi)ncRNA SPRY4-IT1相對(duì)表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)（P=0.0109）。同樣采用qRT-PCR對(duì)lncRNA SPRY4-IT1在人來(lái)源的肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，與L02人正常肝細(xì)胞系比較，lncRNA SPRY4-IT1在Hep G2、HHCC、SK-HEP-1肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著上升（P＜0.01），且在Hep G2中上調(diào)最為顯著（P=0.0001）。采用lncRNA SPRY4-IT1的干擾小RNA siSPRY4-IT1轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，檢測(cè)siSPRY4-IT1的干擾效率，轉(zhuǎn)染siSPRY4-IT1后，lncRNA SPRY4-IT1的表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)（P＜0.01）。

2.2 lncRNA SPRY4-IT1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 采用Tanswell實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)染siNC以及轉(zhuǎn)染siSPRY4-IT1的Hep G2細(xì)胞遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。如圖1所示，與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染siNC組比較，轉(zhuǎn)染siSPRY4-IT1組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示lncRNA SPRY4-IT1對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移無(wú)影響。

圖1 1ncRNA SPRY4-IT1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖3 采用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾1ncRNA SPRY4-IT1表達(dá)后細(xì)胞增殖情況

圖4 轉(zhuǎn)染siNC以及si SPRY4-IT1的Hepa G2細(xì)胞種植于裸鼠后的瘤體大小

2.3 lncRNA SPRY4-IT1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 為進(jìn)一步探究lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)，采用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了干擾lncRNA SPRY4-IT1表達(dá)后，細(xì)胞增殖的情況。比較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染siNC組，轉(zhuǎn)染siRNA SPRY4-IT1組細(xì)胞增殖數(shù)目顯著降低（P＜0.01），細(xì)胞增殖速度也受到抑制。

2.4 lncRNA SPRY4-IT1對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 將轉(zhuǎn)染siNC以及si SPRY4-IT1的Hep G2細(xì)胞分別種植于裸鼠皮下，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，觀(guān)察裸鼠瘤體的生長(zhǎng)情況。與siNC組小鼠比較，si SPRY4-IT1組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

生物基因組中數(shù)量龐大的非編碼序列的功能一直備受關(guān)注，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，逐漸發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在細(xì)胞正常生理代謝及調(diào)控中所具有的重要作用，并且其表達(dá)的異常與多種疾病，尤其是與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著緊密的關(guān)系［8］。近年來(lái)，多種lncRNA在調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)表型中發(fā)揮著重要的功能，是腫瘤最具潛力的治療靶點(diǎn)。因此探究HCC中異常表達(dá)的lncRNA及其發(fā)揮的生物學(xué)功能，對(duì)于尋找肝癌的分子治療靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后具有重要的科研價(jià)值和臨床意義。

lncSPRY4-IT1是一種706個(gè)堿基序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，研究顯示其位于SPRY4基因序列的內(nèi)含子中，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及作用功能與SPRY4基因相互獨(dú)立［9］。本資料中，lncSPRY4-IT1在肝癌中的表達(dá)上升，進(jìn)一步在細(xì)胞中檢測(cè)lncSPRY4-IT1發(fā)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)也顯著高于正常肝細(xì)胞，提示lncSPRY4-IT1在肝癌中的異常過(guò)表達(dá)可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。有研究報(bào)道，lncSPRY4-IT1在胃癌［4］、膀胱癌［10］以及黑色素瘤［5］中發(fā)生顯著的上調(diào)表達(dá)，干擾其表達(dá)后可以顯著抑制細(xì)胞的遷移。作者在肝癌中干擾lncSPRY4-IT1的表達(dá)后，同樣對(duì)細(xì)胞的遷移進(jìn)行了檢測(cè)，但細(xì)胞的遷移并未受到明顯抑制。因此作者推測(cè)lncSPRY4-IT1雖然在多種類(lèi)型的腫瘤中發(fā)生異常表達(dá)，但在不同類(lèi)型的腫瘤中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。本資料中，干擾lncSPRY4-IT1表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖亦明顯受到抑制。利用肝癌裸鼠移植瘤模型，在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證lncSPRY4-IT1的促腫瘤作用，結(jié)果顯示干擾lncSPRY4-IT1后，裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)也受到顯著抑制。說(shuō)明肝癌中過(guò)表達(dá)的lncSPRY4-IT1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷突破，關(guān)于深入研究lncRNA的作用機(jī)制成為可能。目前推測(cè)lncRNA的作用機(jī)制有：（1）lncRNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。（2）lncRNA可以作用于染色體的空間構(gòu)象或者結(jié)合mRNA從而調(diào)控基因的表達(dá)。（3）lncRNA可以通過(guò)吸附內(nèi)源性microRNA，通過(guò)調(diào)控microRNA的功能而達(dá)到調(diào)控基因的表達(dá)目的等。lncRNA不同于研究比較成熟、作用機(jī)制較為明確的microRNA，其研究尚處于早期階段，作用機(jī)制復(fù)雜，本資料肝癌中l(wèi)ncRNA發(fā)生上調(diào)的分子機(jī)制以及其促進(jìn)腫瘤增殖的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

1 Zuo TT，Zheng RS，Zhang SW，et a1.Incidence and morta1ity of 1iver cancer in China in 2011.Chin J Cancer，2015，34（3）：56.

2 Wanqing Chen，Rongshou Zheng，Hongmei Zeng，et a1.The updated incidences and morta1ities of major cancers in China，2011.Chin J Cancer，2015，34（3）：1～6.

3 Ponjavic J，Ponting CP，Lunter G.Functiona1ity or transcriptiona1 noise？ Evidence for se1ection within 1ong noncoding RNAs.Genome Res，2007，17（5）：556～565.

4 Wei Peng，Guoqiu Wu，Hong Fan，et a1.Long noncoding RNA SPRY4-IT1 predicts poor patient prognosis and promotes tumorigenesis in gastric cancer.Tumour Bio1，2015，36（9）：1～8.

5 Mazar J，Zhao W，Kha1i1 AM，et a1.The functiona1 characterization of 1ong non-coding RNA SPRY4-IT1 in human me1anoma ce11s.Oncotarget，2014，5（19）：8959～8969.

6 Zhang HM，Yang FQ，Yan Y，et a1.High expression of 1ong non-coding RNA SPRY4-IT1 predicts poor prognosis of c1ear ce11 rena1 ce11 carcinoma.Int J C1in Exp Patho1，2014，7（9）：5801～5809.

7 Shi Y，Li J，Liu Y，Ding J.The 1ong noncoding RNA SPRY4-IT1 increases the pro1iferation of human breast cancer ce11s by upregu1ating ZNF703 expression.Mo1 Cancer，2015，14（1）：1～13.

8 Shi X，Sun M，Liu H，et a1.Long non-coding RNAs： A new frontier in the study of human diseases.Cancer Lett，2013，339（2）：159～166.

9 Divya Khaitan，Marce1 E Dinger，Joseph Mazar1.The Me1anoma-Upregu1ated Long Noncoding RNA SPRY4-IT1 Modu1ates Apoptosis and Invasion.Cancer Res，2011，71（11）：3852～3862.

10 Hai-Wei Xie，Qing-Quan Wu，Bin Zhu，et a1.Long noncoding RNA SPRY4-IT1 is upregu1ated in esophagea squamous ce11 carcinoma and associated with poor prognosis.Tumor Bio1，2014，35（8）：7743～7754.

Objective This research aimed to observe the expression of long non-coding RNA SPRY4-IT1 in hepatocellular carcinoma（HCC）and its regulation on malignant biological functions of HepaG2. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）was used to detect the lncRNA SPRY4-IT1 expression in HCC on 60 paired cancerous and adjacent tissue samples，also we observed the lncRNA SPRY4-IT1 expression in Hep G2、HHCC、SK-HEP-1；Small interfering RNA was used to suppress lncRNA SPRY4-IT1 expression in Hep G2；then we used CCK-8 assays and Transwell experiment to investigate the function of lncRNA SPRY4-IT1 in HCC；nude mice model was performed to observed the tumor size after interfering lncRNA SPRY4-IT1 expression. Results We found remarkable elevated lncRNA SPRY4-IT1 expression in cancerous tissues compared with adjacent non-cancerous tissues（P=0.0109）；lncRNA SPRY4-IT1 expression markedly increase in Hep G2、HHCC、SK-HEP-1 （P＜0.01），especially in Hep G2；the migration and invasion had not been obviously affected（P＞0.05）while the proliferation was significantly inhibited（P＜0.01）after silence the expression of lncRNA SPRY4-IT1 in HepG2 cells；the tumor size of nude mice was also suppressed after interfering lncRNA SPRY4-IT1 expression. Conclusion Long non-coding RNA SPRY4-IT1 is highly expressed in hepatocellular carcinoma.It plays an important role in biological function by promoting the proliferation of hepatocellular carcinoma.Long non-coding RNA SPRY4-IT1 may be an important molecular marker and a potential therapeutic target of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma Long non-coding RNA SPRY4-IT1 Proliferation Migration Invasion

200010 上海市長(zhǎng)征醫(yī)院器官移植中心