兒童下呼吸道感染流感嗜血桿菌的分離及耐藥性分析

王萍 強(qiáng)鑫華 周麗華

兒童下呼吸道感染流感嗜血桿菌的分離及耐藥性分析

王萍 強(qiáng)鑫華 周麗華

目的 測(cè)定流感嗜血桿菌（HIN）在痰標(biāo)本的陽(yáng)性率及藥敏分析，為臨床經(jīng)驗(yàn)治療HIN兒童下呼吸道感染提供實(shí)驗(yàn)室的參考依據(jù)。方法 收集小兒肺炎患兒痰標(biāo)本2056份，用API-NH進(jìn)行菌種鑒定，嗜血桿菌和布蘭漢菌藥敏試劑盒ATB-HAEMO藥敏試驗(yàn)，同時(shí)頭孢硝噻吩紙片法檢測(cè)β- 內(nèi)酰胺酶。結(jié)果 2056份痰標(biāo)本鏡下篩查合格標(biāo)本802份，標(biāo)本合格率39.01%。802份合格標(biāo)出中分離到HIN257株，合格痰標(biāo)本分離陽(yáng)性率12.05%，產(chǎn)酶株占52.92%，未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林（BLNAR）和β- 內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性耐阿莫西林/棒酸（BLPACR）的菌株。結(jié)論 HIN耐藥主要集中在氨基青霉素 和氯霉素及磺胺藥物上，頭孢二、三代抗菌藥物、利福平及β-內(nèi)酰胺/酶抑制劑、阿奇霉素具有極佳的抗菌活性，產(chǎn)β- 內(nèi)酰胺酶是流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的主要耐藥機(jī)制。

流感嗜血桿菌 藥敏試驗(yàn) 下呼吸道感染 β一內(nèi)酰胺酶

除肺炎鏈球菌（SP）之外，流感嗜血桿菌（HIN）是引起兒童細(xì)菌性下呼吸道感染的常見的主要致病菌［1］，有研究表明感染流感嗜血桿菌的兒童占全部感染該菌人群的20%。隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的普遍應(yīng)用，HIN的耐藥性也受到廣泛關(guān)注。本文回顧性分析2012年1月至2014年12月下呼吸道感染兒童的臨床資料，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 菌株來(lái)源 2012年1月至2014年12月本院小兒肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)的住院首日患兒送檢的呼吸道痰標(biāo)本中分離的HIN 257株。

1.2 方法 （1）標(biāo)本采集處理及細(xì)菌鑒定：按照《微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第三版）入院當(dāng)天抗生素使用前一次性吸痰管負(fù)壓抽吸采集痰標(biāo)本及時(shí)送檢，送檢的痰標(biāo)本先行涂片鏡檢：以鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)/低倍鏡視野、白細(xì)胞＞25個(gè)/低倍鏡視野的標(biāo)本作為合格標(biāo)本，篩選后的合格痰標(biāo)本接種于哥倫比亞血和含萬(wàn)古霉素巧克力平皿，35℃，CO2孵育18～24h。巧克力平皿可疑菌落用MH平板做V、X、X+V因子需求試驗(yàn)，在MH平板上V因子、x因子紙片周圍不生長(zhǎng)，僅在V+X因子紙片周圍生長(zhǎng)初步鑒定為HIN，再行APINH菌種鑒定。X、V、X+V紙片為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。（2）β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)：用Cefinase紙片（生物梅里埃公司）按說(shuō)明書測(cè)定被試菌株的β-內(nèi)酰胺酶。（3） 藥敏試驗(yàn)：采用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的嗜血桿菌和布蘭漢菌藥敏試劑盒（ATB-HAEMO）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49247。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用wHONET 5.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 流感嗜血桿菌陽(yáng)性檢出率 2056份痰標(biāo)本中，鏡下篩查合格標(biāo)本802份，標(biāo)本合格率39.01%。802份合格標(biāo)出中分離到HIN 257株，合格痰標(biāo)本分離陽(yáng)性率12.50% ，高于肺炎鏈球菌在兒童呼吸道疾病的病原菌中居首位。

2.2 HIN的季節(jié)分布 HIN全年均可能導(dǎo)致兒童感染，春、夏、秋、冬四季分離率分別為：46.30%、13.23%、10.12%、30.35%。其中以每年2～4月份冬春交替季節(jié)間檢出率最高占51.75%，與其它季度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 2012-2014年間不同月份兒童下呼吸道HIN的分離株數(shù)

2.3 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果 257株HIN共檢測(cè)到136株β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株，產(chǎn)酶株占52.92%。未發(fā)現(xiàn)BLNAR（β-內(nèi)酰胺酶陰性而氨芐西林耐藥）和BLPACR（β- 內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性而阿莫西林/棒酸耐藥）的HIN。

2.4 HINβ-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酶株和非產(chǎn)酶株的藥敏結(jié)果 HIN產(chǎn)酶株和非產(chǎn)酶株的藥敏結(jié)果除氨基青霉素之外，耐藥主要集中在氯霉素和磺胺藥物上，阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢噻肟、利福平、氧氟沙星及四環(huán)素對(duì)流感嗜血桿菌均表現(xiàn)為高度敏感，見表2。

表2 產(chǎn)酶與非產(chǎn)酶HIN對(duì)9種抗菌藥物的藥敏結(jié)果（%）

3 討論

小兒呼吸系統(tǒng)發(fā)育不完善，氣管、支氣管管腔狹窄，纖毛運(yùn)動(dòng)差、清除能力弱，加之免疫系統(tǒng)發(fā)育未健全，對(duì)攜帶的HIN缺乏抵抗力，是嬰幼兒HIN引起呼吸道感染率高的原因［2］。此外，本資料顯示，不同季節(jié)呼吸道感染患兒HIN的分離率不同，以每年2～4月份冬春交替季節(jié)間檢出率最高，與地域江南春夏之交氣候變化大，易發(fā)生HIN呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，可為流行病學(xué)調(diào)查及臨床抗感染治療提供有用信息。

HIN是“HACEK”菌群成員，屬于苛養(yǎng)性細(xì)菌，生長(zhǎng)需要V X 特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平有特定要求，加上痰標(biāo)本受上呼吸道正常菌群的干擾，其分離培養(yǎng)較為困難，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)漏檢，因此，對(duì)嗜血桿菌苛氧菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)不僅是臨床迫切的需要，同時(shí)也是衡量微生物實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平的重要標(biāo)志［3］。

作者認(rèn)為提高HIN檢出率應(yīng)：（1）盡量在使用抗菌藥物前留取合格的痰標(biāo)本。（2）痰涂片革蘭染色鏡檢，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)前質(zhì)量篩查，合格標(biāo)本尋找WBC內(nèi)吞噬的革蘭陰性球菌、球桿菌，是對(duì)病原菌進(jìn)行快速診斷的簡(jiǎn)易手段。（3）選擇適合的含萬(wàn)古霉素的巧克力培養(yǎng)基，其富含x、V因子，且能抑制革蘭陽(yáng)性球菌生長(zhǎng)，接種后置于含5% ～10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，箱內(nèi)需保持一定的濕度。（4）對(duì)照痰格蘭染色涂片，識(shí)別可疑菌落為巧克力平皿上濕潤(rùn)、1～2mm、圓形、光滑、半透明、無(wú)色至灰白色、有光澤、易乳化，散發(fā)出類似“鼠穴”氣味。菌落識(shí)別時(shí)檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)非常重要，必要時(shí)，進(jìn)行革蘭染色，其對(duì)確認(rèn)菌落有幫助。（5）衛(wèi)星試驗(yàn)，血平皿衛(wèi)星生長(zhǎng)，MH上不生長(zhǎng)或MH平板做V、X、X+V因子需求試驗(yàn)，在MH平板上V因子、x因子紙片周圍不生長(zhǎng)，僅在V+X因子紙片周圍生長(zhǎng)是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室推薦初步篩查HIN的簡(jiǎn)易方法［4］。HIN的痰涂片、巧克力平皿生長(zhǎng)菌落和因子需求試驗(yàn)結(jié)果。見圖1。

圖2 HIN的痰涂片（A）、巧克力平皿生長(zhǎng)菌落（B）和因子需求試驗(yàn)（C）結(jié)果

本資料結(jié)果顯示，HIN耐藥主要集中在氨基青霉素和氯霉素及磺胺藥物上。HIN對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制主要是：（1）菌株產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1型或其他少見的ROB型β- 內(nèi)酰胺酶，可以通過(guò)頭孢硝噻吩紙片法來(lái)檢測(cè)，若陰性氨芐西林和阿莫西林及其他β- 內(nèi)酰胺類抗菌藥物敏感，若陽(yáng)性則報(bào)告氨芐西林和阿莫西林耐藥。（2）產(chǎn)生染色體介導(dǎo)的菌株細(xì)胞壁上一種或多種青霉素結(jié)合蛋白PBP發(fā)生改變，引起青霉素結(jié)合蛋白與靶位親和力的降低，其次是由于外膜蛋白改變導(dǎo)致對(duì)氨芐西林耐藥，稱為BLNAR菌株，此時(shí)頭孢硝噻吩紙片法β- 內(nèi)酰胺酶檢測(cè)陰性，無(wú)論體外藥敏結(jié)果如何，對(duì)阿莫西林/棒酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他巴唑、頭孢尼西、頭孢孟多、頭孢克羅、頭孢呋辛、頭孢丙烯等β- 內(nèi)酰胺類抗生素均報(bào)道耐藥。本組監(jiān)測(cè)中，HIN產(chǎn)酶株占52.92%，未發(fā)現(xiàn)BLNAR和BLPACR罕見菌株，顯示產(chǎn)TEM-I型β-內(nèi)酰胺酶是HIN對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制，與相關(guān)報(bào)道一致［5］，但產(chǎn)酶率有地區(qū)差異［6］。本資料結(jié)果顯示，HIN耐藥率較高的藥物除復(fù)方新諾明和氯霉素外對(duì)頭孢二、三代抗菌藥物、利福平及β-內(nèi)酰胺/酶抑制劑具有極佳的抗菌活性可為臨床治療兒童感染HIN的一線藥物［7，8］，特別是阿奇霉素兼有抗非典型病原體（肺炎支原體、肺炎衣原體和軍團(tuán)菌屬等）活性，以及對(duì)流感嗜血桿菌的抗菌活性，被推薦為社區(qū)獲得性肺炎及其他呼吸道感染經(jīng)驗(yàn)治療的首選經(jīng)驗(yàn)用藥，無(wú)需報(bào)告常規(guī)藥敏結(jié)果。

1 Shen，XZ，Lu，Q，Deng，L et a1.Resistance of Haemophi1us—inf1uenzae iso1ates in chi1dren under 5 years o1d with acute respira—tory infections in China between 2000 and 2002.The Journa1 of Internationa1 Medica1 Research，2007，35（4）：554.

2 胡亞美，江載芳，諸福棠，等.實(shí)用兒科學(xué).第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1167～1195.

3 張秀珍，朱德妹.臨床微生物檢驗(yàn)問(wèn)答.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：194～200.

4 陳東科，孫常貴. 實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：469～478.

5 桂和翠，王中新，沈繼錄.48株流感嗜血桿菌耐藥性分析及B-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè). 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，（47）：56～59.

6 楊曉華， 譚 南，林愛心，等.兒童呼吸道流感嗜血桿菌的耐藥性分析中國(guó)感染與化療雜志. 2014（14）：436～439.

7 馬越，李景云，金少鴻，等.細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)分析中應(yīng)注意的問(wèn)題.中國(guó)抗生素雜志，2005，30（12）：762～69.

8 程薇，錢利強(qiáng)，華春珍，等.兒童呼吸道標(biāo)本分離的流感嗜血桿菌耐藥模式研究.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25（3）：192～194.

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