當歸中關鍵氣味活性化合物的鑒定及其在煎煮過程中變化規律研究

李澤仟,顧　歡,康　樂,張　亞,宋煥祿

(北京工商大學 分子感官科學實驗室,北京 100048)

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當歸中關鍵氣味活性化合物的鑒定及其在煎煮過程中變化規律研究

李澤仟,顧歡,康樂,張亞,宋煥祿*

(北京工商大學 分子感官科學實驗室,北京 100048)

通過溶劑輔助風味蒸發制樣(SAFE)和動態頂空制樣(DHS)與氣相色譜-嗅聞儀-質譜聯機法(GC-O-MS)結合,對當歸藥材中的主要氣味活性化合物進行分析,最終分別鑒定出43種和47種氣味活性化合物。此外,采用香氣提取物稀釋分析(AEDA)和動態頂空稀釋分析(DHDA)共同確定了貢獻度較大的6種關鍵氣味活性化合物:6-十一酮(泥土味、中藥味)、藁本內酯(藥草味)、丁烯基苯酞(藥草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。最后,采用固相微萃取法(SPME)提取當歸煎煮液的揮發性成分,并以內標法對關鍵氣味活性化合物進行定量分析。結果表明:上述6種關鍵氣味化合物在煎煮過程中含量發生改變,致使煎煮液清新香韻先增強后減弱,泥土香韻強度減弱,藥草和咖喱香韻整體增強。

溶劑輔助風味蒸發制樣,動態頂空制樣,香氣提取物稀釋分析,動態頂空稀釋分析,氣相色譜-嗅聞儀-質譜

當歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]是傘形科當歸屬的一種多年生草本植物。它是我國一味常用的中藥材,始記于漢代《神農本草經》[1]。現代藥理學研究表明,當歸具有改善血液循環、抗炎和鎮痛、清除自由基和抗脂質氧化、改善動脈硬化、補血、抗腫瘤和增強免疫功能等作用[2-3]。

目前針對當歸揮發性成分的研究主要集中在全揮發油成分的分析上。近年來,一些新的提取技術已應用于樣品制備中,如固相微萃取法(solid-phase micro-extraction,SPME)[4]、頂空無溶劑萃取法(headspace solvent free micro-extraction,HS-SFME)[5]和無溶劑固相注射法(solvent free solid injector,SFSI)[6]等。這些研究表明,當歸全揮發油成分包含40～50種化合物。但在這些化合物中,并非所有分子都對當歸的整體氣味特征有貢獻。所以,有必要采用分子感官科學的研究方法[7],并結合氣相色譜-嗅聞-質譜儀(gas chromatography-olfactromrtry-mass spectrometry,GC-O-MS)確定當歸藥材中的關鍵氣味活性化合物。

本實驗首次將分子感官科學的研究方法應用于中藥研究領域。采用溶劑輔助風味蒸發萃取法(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)和動態頂空制樣法(dynamic headspace sampling,DHS)提取當歸藥材中的香氣成分,然后分別以香氣提取物稀釋分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)和動態頂空稀釋分析(dynamic headspace dilution analysis,DHDA)確定藥材中關鍵氣味化合物。最后,在100 ℃不同煎煮時間下,采用SPME提取煎煮液中的氣味成分并以內標法對關鍵氣味化合物定量,確定它們在煎煮過程中的變化規律。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

當歸藥材中國甘肅岷縣;C7-C30正構烷烴和內標物2-甲基-3庚酮美國Sigma公司;二氯甲烷等其它試劑(分析純)北京化學試劑公司。

氣相色譜-質譜聯用儀(7890A-7000B)美國安捷倫公司;Sniffer 9000嗅聞儀瑞士Brechbuhler公司;DB-Wax(30 m×0.32 mm×0.25 μm)和DB-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)型色譜柱美國J&W公司;溶劑輔助風味蒸發裝置德國Glasbl?serei Bahr公司;EXT75DX型復合渦輪分子真空泵和XDD1型機械泵英國Edwards公司;多功能全自動樣品前處理平臺MPS德國Gerstel公司;4848型高壓反應釜美國Parr公司。

1.2當歸藥材的預處理及其煎煮液的制備

將當歸研碎、過篩,選取過40目的粉末轉移至50 mL離心管中并密封,然后放入溫度為-20 ℃的冰箱內儲藏備用。稱取1.00 g上述當歸粉末于高壓反應釜內,加入30 mL蒸餾水,在溫度100 ℃和不同時間(0～90 min)下煎煮。待煎煮完成后,將煎煮液轉移至50 mL離心管內,并冷卻至室溫。然后,以轉速5000 r/min離心10 min,過濾,濾液備用。

1.3氣味物質前處理方法

1.3.1SAFE法處理藥材樣品及香氣提取物稀釋分析(AEDA)SAFE裝置的安裝和使用,按照Wolfgang Engel等[8]描述的方法操作。具體步驟如下:稱取6.00 g當歸粉末,加入100 mL二氯甲烷,在搖床中充分混合8 h。靜置后,將混合體系進行過濾,所得萃取液在30 min內緩慢、均勻地滴入SAFE體系中的500 mL蒸餾瓶內,并將其置于50 ℃的恒溫水浴中。另取250 mL圓底燒瓶作為接收瓶連接至SAFE體系上。為保證接收瓶處于低溫環境,在瓶外裝配保溫套,并向保溫套內持續灌入液氮。此外,在整個操作過程中使裝置的冷阱中充滿液氮。SAFE裝置中的夾層循環水浴溫度為50 ℃,分子渦輪泵使體系壓力保持在10-4Pa。將接收瓶內提取液經無水硫酸鈉干燥。然后,通過Vigreux柱濃縮至約2 mL,再采用氮氣吹掃濃縮至0.5 mL。最終所得濃縮液供GC-O-MS分析使用。

香氣提取物稀釋分析(AEDA)采用SAFE提取液系列稀釋(1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243),并將1 μL稀釋樣品注入GC-O-MS分析。每個稀釋樣品經3名有經驗的評價員在儀器嗅聞口進行嗅聞評價。隨著稀釋倍數的增大,評價員不能再聞到某種香氣化合物的氣味為止,此時的稀釋濃度比值為該化合物的FD因子(flavor dilution factor,FD)。一般來說,FD因子越高的化合物,對整體氣味輪廓貢獻越大。

1.3.2DHS法處理藥材樣品及動態頂空稀釋分析(DHDA)稱取1.00 g當歸藥粉,放于吹掃捕集玻璃容器中,并將體系密封。循環水浴溫度為55 ℃平衡30 min。然后,將體系一端插入Tenax TA吸附管,另一端通入氮氣。以氮氣流速為100 mL/min吸附香氣40、8、1.6和0.32 min,分別對應的FD因子為1、5、25和125。

1.3.3SPME法處理煎煮液樣品當歸粉末在不同條件煎煮后,采用SPME法對煎煮液的氣味活性化合物進行分析。量取10 mL過濾后的煎煮液并置于40 mL萃取瓶內,加蓋密封置于55 ℃水浴中,平衡時間為20 min,萃取針吸附時間為40 min。然后,插入氣相色譜進樣口解吸5 min。

1.4儀器條件

經GC分離后,分離餾分,分別進入質譜檢測器和嗅聞檢測器,實驗人員在嗅聞口記錄所聞到的香味特征和強度。餾分分離分別采用DB-Wax和DB-5毛細管柱。升溫程序:初始溫度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升溫到200 ℃,保持0 min,再以10 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min,共43 min。氣相色譜使用的載氣為氦氣,流速為1.2 mL/min,分流比10∶1。質譜條件:電子轟擊(Electron Impact,EI)離子源,電子能量70 eV,傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度為230 ℃,四級桿溫度為150 ℃,質量掃描范圍55～500 m/z。

1.5香氣化合物的鑒定與定量

化合物的鑒定主要采用NIST 2.0譜庫、標準化合物保留指數(RI)和評價員嗅聞到的氣味與標準化合物芳香特性相對比等方法。

化合物采用內標法定量,內標物在樣品中的濃度為0.0816 μg/mL。每種化合物的濃度計算公式為:

ci=cis×Aj/Ais

式中:ci為化合物濃度;cis為內標濃度;Aj為化合物的色譜峰面積;Ais為內標物峰色譜面積。

2　結果與討論

2.1當歸中主要氣味活性化合物的確定

表1和表2中鑒定的化合物主要包括萜烯類、醛類、酮類和芳香族化合物等,其中以萜烯類化合物為主。這與文獻報道結果相同,如胡長鷹[9]對當歸揮發油的不同提取方法進行探討,并通過GC-MS分析得到β-羅勒烯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、藁本內酯和花側柏烯等50種化合物;Hong-Sheng Tan等[6]采用SPME法對我國不同產地當歸的揮發油成分進行分析,鑒定了51種揮發性成分。其中β-羅勒烯、α-蒎烯、3-甲基丁醛、庚烷和丁醛可作為潛在的指標化合物,用于評價道地和非道地的當歸;盧森華等[10]研究了當歸根、莖、葉不同部位的揮發油成分。然而,這些報道只針對當歸的揮發油成分進行分析,既沒有確定各種氣味分子所體現的氣味特征,也沒有確定當歸中的關鍵氣味活性化合物。此外,本實驗采用SAFE和DHS法提取揮發性成分,這對于感官嗅覺易辨別的低沸點組分有很好的提取效果[11]。

采用SAFE-GC-O-MS法提取、分離和鑒定出當歸藥材中43種主要氣味活性化合物,見表1。當歸藥材的氣味輪廓可描述為典型的藥草香氣、松木香、清新氣味等,而鑒定的氣味活性分子的氣味特征很好地反映了這種氣味輪廓。具有藥草香氣的化合物有丁烯基苯酞、藁本內酯、6-十一酮、β-甜沒藥烯、β-羅勒烯、桉油烯醇;呈松木香韻的化合物有月桂烯、檜烯、α-蒎烯、β-蒎烯、花側柏烯;呈清香韻的化合物有己醛、辛醛、2-壬酮、壬醛和6-十一醇;此外,2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)和6-丁基-1,4-環庚二烯(甘草味)等具有其它氣味特征的化合物也在這種方法下鑒定出來。通過AEDA確定了FD因子,FD因子越高對整體氣味輪廓貢獻越大。因此,表中6-十一酮、丁烯基苯酞和藁本內酯等8種Log3FD≥3的化合物是決定當歸藥材氣味輪廓的關鍵氣味活性化合物。

表1　AEDA法鑒定當歸的主要氣味活性化合物Table1　Predominant odorants in Radix Angelica sinensis identified by AEDA

注:a.評價員在嗅聞儀聞到的氣味;b.保留指數RI=100N+100n(tR,a-tR,N)/(tR(N+n)-tR,N);N為標準烷烴的較低碳原子個數;n為標準烷烴之間相差的碳原子個數;tR,a,tR,N和tR(N+n)分別為未知化合物的保留時間,較低碳數的標準烷烴保留時間和較高碳數的標準烷烴保留時間;c.當樣品濃縮液稀釋至3、9、27、81、243和729倍時,對應的Log3FD分別為1,2,3,4,5和6,“-”表示沒有聞到氣味物質的特征氣味;d.鑒定方法RI,O和MS分別表示采用保留指數、氣味特征和質譜信息與標準化合物比對。

表2　DHDA法鑒定當歸中的主要氣味活性化合物Table 2　Predominant odorants in Radix Angelica sinensis identified by DHDA

注:a.評價員在嗅聞儀聞到的氣味;b.保留指數RI=100N+100n(tR,a-tR,N)/(tR(N+n)-tR,N);N為標準烷烴的較低碳原子個數;n為標準烷烴之間相差的碳原子個數;tR,a, tR,N和 tR(N+n)分別為未知化合物的保留時間,較低碳數的標準烷烴保留時間和較高碳數的標準烷烴保留時間;c.當樣品濃縮液稀釋至0(不稀釋)、5、25、125和725倍時,對應的FD因子分別為1、5、25、125和725,“-”表示沒有聞到氣味物質的特征氣味;d.鑒定方法RI,O和MS分別表示采用保留指數、氣味特征和質譜信息與標準化合物比對。

采用DHS-GC-O-MS對當歸藥材的氣味活性化合物分析共鑒定出47種化合物,見表2。通過DHDA確定的關鍵氣味活性化合物(FD≥5)有6-十一酮(泥土味、中藥味)、α-蒎烯(松木味)、藁本內酯(藥草味)、丁烯基苯酞(藥草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)、β-蒎烯(松木味)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。比較AEDA和DHDA法發現,關鍵氣味化合物略有不同,DHDA中體現松木氣味的α-蒎烯和β-蒎烯更容易在頂空制樣中嗅聞得到;AEDA中作為關鍵氣味化合物的Alloaromadendrene并沒有在DHDA中鑒定到。這種差別是由于不同的提取方法或不同吸附材料引起的。

綜合溶劑萃取制樣(SAFE)和動態頂空制樣(DHS)兩種方法,共同確定的關鍵氣味活性化合物有6-十一酮(泥土味、中藥味)、藁本內酯(藥草味)、丁烯基苯酞(藥草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。這些化合物主要貢獻了當歸藥材的氣味輪廓,它們可以作為煎煮過程變化規律的研究對象。

2.2關鍵氣味化合物在煎煮過程中的變化規律

為了探索沸水煎煮過程中當歸煎煮液氣味活性化合物的變化規律,本實驗采用SPME-GC-O-MS法對已確定的關鍵氣味成分進行鑒定和定量,總離子流圖見圖1。圖中有許多色譜峰,隨之對應許多揮發性成分。然而,真正反映整體氣味輪廓的關鍵氣味成分只有少數幾種。

當歸煎煮過程中關鍵氣味活性化合物隨時間的變化趨勢,如圖2。在圖2A中,呈現青草香氣的己醛,其含量在煎煮時間為45 min時達到最大,隨時間的延長,其含量逐漸降低;同樣呈現清新氣味的辛醛,其含量隨煎煮時間的延長顯著上升,并在75 min時達到最大值。在75～90 min,辛醛含量急劇下降;呈現泥土味的6-十一酮,隨煎煮時間的延長,其含量逐漸降低。當煎煮時間大于45 min后,已很難檢測到其含量;在圖2B中,右側附坐標軸標識的是呈現咖喱味的2-甲氧基-4乙烯基苯酚的含量。隨著煎煮時間的延長,其含量顯著上升;藁本內酯在60 min內含量略呈上升趨勢,而繼續煎煮含量會明顯上升;對于丁烯基苯酞,隨著煎煮時間的延長,其含量基本保持穩定。出現上述變化規律的原因主要是這些化合物從當歸溶出到水中的速率和本身化學熱穩定性決定的。

圖1　當歸煎煮液GC-O-MS總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of the Radix Angelica sinensis decoction by GC-O-MS

圖2　當歸煎煮過程中煎煮液關鍵氣味化合物的變化趨勢Fig.2　Variation trends of key odorants in the decoction by boiling process 注:圖2b中2-甲氧基-4乙烯基苯酚的 含量由右側坐標軸標識;丁烯基苯酞 和藁本內酯的含量由左側坐標軸標識。

綜上,隨著沸水煎煮時間的延長,煎煮液氣味特征變化如下:清新香韻先增強后顯著減弱;泥土氣味一直在減弱;刺鼻的咖喱氣味一直在增強;整體中藥味(或藥草味)強度穩中增強。同時,這也與煎煮液的整體氣味輪廓相符。

3　結論

通過采用SAFE和DHS兩種風味提取技術,對當歸藥材中氣味成分進行分析,分別鑒定出43種化合物和47種化合物。采用AEDA和DHDA并結合GC-O-MS共同確定6種關鍵氣味,分別是6-十一酮(泥土味、中藥味)、藁本內酯(藥草味)、丁烯基苯酞(藥草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。采用SPME法提取當歸煎煮液的揮發性成分,并以內標法對關鍵氣味化合物進行定量分析。結果表明:這些化合物在煎煮過程中含量發生改變,致使煎煮液清新香韻先增強后減弱,泥土香韻強度整體減弱,藥草和咖喱香韻整體增強。這在分子水平上解釋了當歸煎煮液在煎煮過程中宏觀上的氣味變化原因。

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Identification of key aroma-active compounds in RadixAngelicasinensisand study on its variation during boiling process

LI Ze-qian,GU Huan,KANG Le,ZHANG Ya,SONG Huan-lu*

(Laboratory of Molecular Sensory Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Predominant aroma-active compounds in RadixAngelicasinensiswere analysed by solvent-assisted flavor evaporation(SAFE)and dynamic headspace sampling(DHS),combined with gas chromatography-olfactromrtry-mass spectrometry(GC-O-MS).A total of 43 and 47 odorants were identified,respectively.In addition,aroma extract dilution analysis(AEDA)and dynamic headspace dilution analysis(DHDA)were carried out to screen the key aroma-active compounds in RadixAngelicasinensis.The result showed that 6 key odorants with stronger flavor properties in overall odor profile were identified:6-undecanone(earthy,herbal),ligustilide(herbal),butylidenephthalide(herbal),hexanal(cut-grass),octanal(green)and 2-methoxy-4-vinylphenol(curry-like).At last,the key aroma-active compounds identified above in RadixAngelicasinensisdecoction were extracted by solid-phase micro-extraction(SPME),quantified with internal standard method.The result showed that the contents of the 6 compounds varied during the boiling process so that the enhancement and reduction of green aroma,reduction of earthy aroma and enhancement of herbal and curry aroma were found in the decoction.

solvent-assisted flavor evaporation(SAFE);dynamic headspace sampling(DHS);aroma extract dilution analysis(AEDA);dynamic headspace dilution analysis(DHDA);GC-O-MS

2016-01-12

李澤仟(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品風味化學，E-mail:714512850@qq.com。

宋煥祿(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品風味化學, E-mail:songhl@th.btbu.edu.cn。

TS207.4

A

1002-0306(2016)09-0311-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.052