野葛藤地上部分葛根素的提取及穩定性研究

李　玲,全沁果,沈艷欣,何福林,邵金華,閆旭宇,*

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院,湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室,湖南永州 425199;2.浙江大學農業與生物技術學院,浙江杭州 310058;3.中國農業科學院農產品加工研究所,農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室,北京 100193)

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野葛藤地上部分葛根素的提取及穩定性研究

李玲1,2,全沁果3,沈艷欣1,何福林1,邵金華1,閆旭宇1,*

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院,湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室,湖南永州 425199;2.浙江大學農業與生物技術學院,浙江杭州 310058;3.中國農業科學院農產品加工研究所,農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室,北京 100193)

以野葛藤地上部分為研究對象,采用乙醇回流法提取其葛根素,在單因素實驗基礎上選取影響得率的主要因素:提取溫度、提取時間、料液比,通過響應面設計,對野葛藤中的葛根素提取條件進行優化,并研究氧化還原劑和金屬離子對野葛藤中的葛根素穩定性的影響。結果表明,野葛藤中的葛根素最佳提取工藝條件為:提取溫度為79 ℃,提取時間為87 min,料液比為1∶14 g/mL;葛根素得率為2.2515%。葛根素的穩定性實驗結果表明:氧化劑H2O2不影響葛根素穩定性,而還原劑Na2SO3導致葛根素吸光度值變化;在金屬離子中,Na+、K+兩種離子不影響葛根素的穩定性,而Cu2+會改變葛根素吸光度值,對葛根素的穩定性有一定影響。因此,葛根素在生產、貯存及使用過程中應注意避免與還原劑和Cu2+離子存在的環境接觸。

野葛藤,葛根素,提取優化,穩定性

野葛為豆科葛屬多年生落葉草質藤本植物,在我國分布廣泛,為湖南省永州市地區的優勢植物資源之一,具有良好的食用與藥用價值[1-2]。野葛對湘南地區的地形與氣候適應力強,葛藤可迅速蔓延,并與當地植物纏繞[3]。這種定殖擴散能力使其迅速建立起了種群優勢,對當地的生態平衡造成了較明顯的負面作用[4-6]。葛根素是野葛異黃酮類化合物的主要成分,藥用價值突出,市場需求量大[7-8],但葛根素產品的來源多局限于野葛地下塊根部位[9-10]。近年來,有關野葛藤中有效成分的研究工作已初步展開,但目前仍將其列為破壞性較強的入侵植物,研究多集中于采用人為方法進行防控,而缺乏有效的后續利用[4-6]。因此,對野葛藤進行功能性成分開發可促進其從生態危害物向植物藥用資源轉型。目前,葛根的藥用范圍多集中于地下部分,而較為發達的地上藤莖的利用率很低,除部分葛藤作為飼料外,大都將其作為廢棄物丟棄,造成了環境污染與資源浪費。研究地上部分野葛藤的葛根素提取工藝,并針對葛根素提取物進行穩定性研究以探究合適的儲存環境,對合理開發野葛產業具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野葛藤采摘于湖南省永州市零陵區朝陽巖公園,經學校葛根課題組鑒定為野生葛藤。

葛根素標準品(≥98%)上海源葉生物科技有限公司;超純水;乙醇為分析純。

電子天平上海玉博生物科技有限公司;紫外可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱北京科偉永興儀器有限公司;臺式低速離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋金壇市億通電子有限公司;小型粉碎機天津奈斯特儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理把葛根藤用超純水洗凈,干燥粉碎后過篩(100目)備用。

1.2.2葛根素吸光度標準曲線的制作稱取約2.0 mg干燥恒重的葛根素對照品,并用溶液濃度為95%的乙醇溶解于50 mL容量瓶中,定容至50 mL,并搖勻,分別精確吸取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標準溶液至10 mL容量瓶中,并用超純水定容;另以1 mL濃度為95%乙醇加水至10 mL的溶液做空白對照,將配制好的溶液在250 nm下進行比色測定,以對葛根素質量濃度與吸光度作線性回歸[11],得葛根素標準曲線回歸方程為Y=0.0268X+0.0662,R2=0.9990。

1.2.3野葛藤中葛根素得率的計算

式中:x-葛根素得率(%);A-測量的吸光度;B-稀釋的倍數;V-過濾液體的總體積(mL);m-實驗原料所稱量的質量(g)。

1.3單因素實驗

1.3.1提取時間對葛根素得率的影響保持其它浸提條件不變(70%乙醇,在70 ℃水浴下加熱,料液比1∶10 g/mL),設置40、60、80、100、120 min 5個水平,平行實驗3次,研究浸提時間對野葛藤中葛根素得率的影響。

1.3.2乙醇濃度對葛根素得率的影響在浸提時間2 h、70 ℃水浴溫度、料液比1∶10 g/mL下,分別設置10%、30%、50%、70%、90% 5個水平,平行實驗3次,考察乙醇濃度對野葛藤中葛根素得率的影響。

1.3.3提取溫度對葛根素得率的影響其他工藝條件不變(70%乙醇,浸提時間2 h,料液比1∶10 g/mL),平行實驗3次,研究40、50、60、70、80 ℃不同溫度下對野葛藤中葛根素得率的影響。

1.3.4料液比對葛根素得率的影響在70%乙醇,浸提時間2 h,水浴溫度70 ℃條件下,分別設置浸提料液比1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18 g/mL,平行實驗3次,研究不同的料液比對野葛藤中葛根素得率的影響。

1.4響應面實驗

在單因素實驗的基礎上,采用響應面法中的Box-Behnken設計對野葛藤中葛根素的提取工藝進行優化,選取提取時間、提取溫度、料液比為考察因素,分別以X1、X2和X3代表,以得率為響應值(Y),實驗因素與水平設計如表1所示。

表1　響應面實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of RAS test

1.5穩定性實驗

以吸光度的變化為指標,研究氧化還原劑和金屬離子的存在下,野葛藤中葛根素提取物穩定性的變化。分別配制3%、6%、9%、12%、15% H2O2溶液與2.5 mg/mL葛根素1∶1混合,靜置3 h,采用紫外分光光度計在250 nm處測定吸光值,檢測不同濃度H2O2溶液對葛根素穩定性的影響;分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L Na2SO3溶液,與2.5 mg/mL葛根素溶液1∶1混合,靜置3 h,采用紫外分光光度計在250 nm處測定吸光度值,檢測不同濃度Na2SO3溶液對葛根素穩定性的影響;分別配制0.2 mol/L的Na+、K+、Cu2+溶液,與2.5 mg/mL葛根素溶液以1∶1比例混合,在3 h內,每隔0.5 h采用紫外分光光度計在250 nm處測定吸光值的變化,評價不同金屬鹽對葛根素穩定性的影響[12]。

1.6數據統計分析

所得數據用Excel 2007作圖,并用Design-expert 8.0.5b軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1提取時間對葛根素得率的影響如圖1所示,提取時間對野葛藤中葛根素得率有較大影響。80 min以前,隨著提取時間的延長,葛根素的得率逐漸提升;在80 min處得率達到最大值,隨后逐漸降低,可能是隨著提取時間的延長,葛根素的氧化分解速率大于其提取效率,故控制提取時間在80 min左右時,提取效果較好。

圖1　提取時間對野葛藤中葛根素得率的影響Fig.1　Effect of extraction time on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.2乙醇濃度對葛根素得率的影響如圖2所示,乙醇濃度對野葛藤中葛根素得率影響相對其它三個因素表現較弱。低濃度乙醇梯度下,葛根素得率的增長較為緩慢;當乙醇濃度超過50%后,提取效率迅速提高;當濃度為70%時得率最大,繼續提高乙醇濃度時,葛根素得率開始降低,表明適當增大乙醇比例會促進這種作用,過高則對反應體系無益,且增加了投料成本。最終確定乙醇的適宜濃度為70%。

圖2　乙醇濃度對野葛藤中葛根素得率的影響Fig.2　Effect of ethanol concentration on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.3提取溫度對葛根素得率的影響如圖3所示,可以看出,提取溫度對葛根素得率的影響機制較為復雜,在50 ℃和80 ℃處出現了兩個極大值點,相對而言,在80 ℃范圍內提取結果較為理想。表明在較低溫度下,溫度的變化與葛根素得率之間存在非線性關系,故應考察溫度較高環境下葛根素得率的變化。

圖3　提取溫度對野葛藤中葛根素得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.4料液比對葛根素得率的影響由圖4知,隨著料液比的提高,葛根素的得率總體呈先升后降趨勢。料液比為1∶14 g/mL之前,葛根素得率逐漸升高;繼續提高料液比,其得率開始下降。其原因可能是料液比的變化能直接影響葛根素在植物細胞內外的擴散平衡,使得得率上下浮動。

（2）熱處理調質后變形風險大 根據技術條件的性能試料要求編制的粗加工圖如圖2所示，增加性能試料區和粗加工余量后粗加工尺寸變為φ6430mm×350mm。雖然在工藝準備時充分考慮到變形因素并適當增加厚度方向上的余量，力求在源頭上保證熱處理變形后尺寸能夠滿足精加工要求，但管板直徑大、壁厚小、高徑比小，熱處理調質時容易變形，調質后變形風險大。

圖4　料液比對野葛藤中葛根素得率的影響Fig.4　Effect of the solid-liquid ratio on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.2響應面實驗

根據單因素實驗結果,并考慮實際情況,確定乙醇最佳提取濃度為70%,在此基礎上以提取時間、提取溫度、料液比為考察因素,以得率為響應值,設計響應面實驗,方案見表1。

表2　野葛藤中葛根素提取響應面實驗設計及結果Table 2　Design and experiment results of response surface methodology of pueraria extraction in the Vine of Pueraria lobata

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the regression model

注:**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

采用Design expert 8.0.5b軟件對表2中實驗結果進行多項擬合回歸,得到野葛藤中葛根素得率(Y)對提取時間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)的二次多項回歸模型方程:Y=2.23+0.061X1-0.071X2+0.035X3+0.0025X1X2-0.01X1X3-0.01X2X3-0.088X12-0.33X22-0.14X32。

2.2.1響應面實驗模型方差分析為了檢驗回歸方程的有效性,進一步確定各因素對野葛藤中葛根素得率的影響程度,對回歸模型進行了方差分析,結果見表3。模型的p<0.0001,極顯著;失擬項的p值為0.0558,不顯著,決定系數為0.9869,響應值的變化有98.69%來源于所選因素,即來源于提取時間、提取溫度、料液比,說明模型擬合度好,回歸方程能很好的描述各因素與響應值之間的關系,該實驗方法可靠[13]。

回歸模型中一次項的p值均小于0.01,達到極顯著,二次項的p值亦小于0.0001,說明實驗中3個因素的二次項都具有極顯著影響;而其交互項及失擬項顯著性較差。這表明實驗因素對響應值不是簡單的線性關系,而是一種非線性關系[14]。單考察p值大小,可確定各因素的效應關系為:X2(提取溫度)>X1(提取時間)>X3(料液比)。

響應曲面坡度越陡峭,表明響應值對于操作條件的改變越敏感;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對響應值的影響也就越小[15]。圖5直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響,提取時間和提取溫度的陡峭程度相對較高,表明其對野葛藤中葛根素得率的交互作用相對明顯。

圖5　各提取因素之間的交互作用影響Fig.5　Effect of interaction of Extraction factor on the yield of pueraria

2.2.2驗證性實驗用Design-expert 8.0.5b軟件對二次多項式回歸方程進行計算,得到最佳的提取條件為提取溫度78.93 ℃,提取時間為86.77 min,料液比為14.24倍乙醇體積,預測得率為2.25031%。考慮到單因素實驗結果及實際操作的局限性,野葛藤中葛根素的提取工藝最終修正為:提取溫度79 ℃、提取時間87 min、料液比1∶14 g/mL。此條件下進行實驗驗證,設置4次平行實驗,如表4所示,得到野葛藤中葛根素最大得率為2.2515%,幾乎等同于預測值,表明模型可靠。

2.3穩定性實驗

2.3.1氧化劑對葛根素穩定性的影響由圖6知,隨著H2O2處理濃度的提高,葛根素提取物的吸光度的下降幅度很小,說明氧化劑對野葛藤中葛根素的穩定性影響小。

表4　葛根素得率Table 4　Extraction rate of pueraria

圖6　氧化劑對野葛藤中葛根素穩定性的影響Fig.6　Effect of oxidant on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

2.3.2還原劑對葛根素穩定性的影響如圖7所示,葛根素溶液中添加還原劑Na2SO3后,吸光度隨著還原劑Na2SO3濃度的增大而逐漸增加。這可能是隨著還原劑的加入使葛根素最大吸收波長發生偏移,導致吸光度增加[15]。因此,葛根素在生產、貯存及使用過程中應注意避免與還原劑接觸。

圖7　還原劑對野葛藤中葛根素穩定性的影響Fig.7　Effect of reducing agent on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

2.3.3金屬離子對葛根素穩定性的影響由圖8可以看出,加入Na+、K+兩種金屬離子后,葛根素的吸光度值基本不變,而加入Cu2+后,吸光度隨著時間的延長而增加,Cu2+或能與葛根素生成某種配合物以致最大吸收波長發生偏移[12],故葛根素應避免與含有Cu2+的溶液接觸。

圖8　金屬離子對野葛藤中葛根素穩定性的影響Fig.8　Effect of mental ion on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

3　結論

在不考慮其他因素的情況下,根據單因素優化及響應面實驗數據分析得到野葛藤中葛根素最佳提取條件:提取溫度為79 ℃,提取時間為87 min,料液比為1∶14 g/mL;葛根素的得率為2.2515%。由方差分析和各因素交互作用可知,野葛藤中葛根素提取條件因素的影響主次順序為:提取溫度>提取時間>料液比。葛根素的穩定性實驗結果表明:氧化劑H2O2不影響葛根素穩定性;還原劑Na2SO3會破壞其穩定性,Na2SO3導致葛根素吸光度值變化。因此,葛根素在生產、貯存及使用過程中應注意避免與還原劑接觸。Na+、K+兩種離子不影響葛根素的穩定性,而Cu2+離子對葛根素穩定性影響較大,會改變其吸光度值,應盡量避免與其接觸。本研究對延長野葛加工的產業鏈有一定的參考價值,為明確葛根素的適宜環境提供了一定的參考,并且為今后開發野葛藤廣泛的保健及藥用價值提供了一定的理論依據。

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Study on the extraction and stability of pueraria in aerial parts of the Vine ofPuerarialobata

LI Ling1,2,QUAN Qin-guo3,SHEN Yan-xin1,HE Fu-lin1,SHAO Jin-hua1,YAN Xu-yu1,*

(1.Department of Chemistry and Biological Engineering,Hunan University of Science and Engineering,Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South,Yongzhou 425199,China;2.College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;3.Institute of Agro-products Processing Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Laboratory of Agro-products Quality Safety Risk Assessment,Ministry of Agriculture,Beijing 100193,China)

In this experiment,pueraria was extracted from the Vine ofPuerarialobatausing ethanol refluxing method.The main influence factors(the extraction temperature,the extraction time,the solid-liquid ratio)of extraction rate were selected from the results of single factor test,the extraction conditions of pueraria were optimized by response surface design,and its stability to oxidizer(reducer)and metal ion was studied.The results showed that the optimum extraction technology was for the extraction temperature 79 ℃,the extraction time was 87 min,and the solid-liquid ratio of 1∶14 g/mL,the extraction rate of pueraria was 2.2515%.The stability results indicated that the pueraria were not affected by H2O2as the oxidizing agent,but the change of the absorbency was caused by Na2SO3as the reducing agent.The stability of pueraria was not affected by Na+and K+,but it was influenced by Cu2+.So the storage and use of the pueraria process should avoid contacting with reducing agent and Cu2+.

Vine ofPuerarialobata;pueraria;extraction and optimization;stability

2015-08-07

李玲(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：植物生物技術，E-mail：liling7826@126.com。

閆旭宇(1979-)，男，碩士，講師，研究方向：植物生物技術，E-mail:yanxuyu1979@163.com。

中國博士后科學基金面上項目(2014M561768)；湖南科技學院湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室開放基金XNZW14C12；湖南省永州市2015年度指導性科技計劃項目2015-10號；永州市科技創新項目(永財企指2015[25]號-9)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.037