一種深海微生物脂肪酶在非水介質中催化合成乙酸肉桂酯的應用研究

王召賀,張　云,孫愛君,楊再昌,胡云峰,*

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.中國科學院南海海洋研究所,熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室,廣東廣州 510301;3.中國科學院南海海洋研究所,廣東省海洋藥物重點實驗室,廣東廣州 510301)

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一種深海微生物脂肪酶在非水介質中催化合成乙酸肉桂酯的應用研究

王召賀1,張云2,3,孫愛君2,3,楊再昌1,胡云峰2,3,*

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.中國科學院南海海洋研究所,熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室,廣東廣州 510301;3.中國科學院南海海洋研究所,廣東省海洋藥物重點實驗室,廣東廣州 510301)

從一株深海來源微生物Streptomycessp.SCSIO 13580的基因組中克隆了1個序列新穎的脂肪酶編碼基因,含有1005個堿基,編碼334個氨基酸,與最相近的蛋白有51%相似。在大腸桿菌中異源表達了這個脂肪酶,發現其具有在非水介質中催化合成乙酸肉桂酯的活性。在單因素實驗的基礎上,考察了酰基供體、溶劑、肉桂醇/乙酸乙烯酯摩爾濃度之比、溫度等因素對該酶合成乙酸肉桂酯的活性的影響,得到的最佳反應條件是:以乙酸乙烯酯為酰基供體,以正己烷為溶劑,肉桂醇/乙酸乙烯酯的摩爾濃度之比為1∶6,反應溫度為40 ℃,優化后的轉化率達到48.3%,酶粉的酶活力為5.59 U/g。

脂肪酶,轉酯反應,乙酸肉桂酯,肉桂醇,乙酸乙烯酯

乙酸肉桂酯是我國規定可使用的香料之一,可從肉桂精油中提取,是一種重要的食用香料,可用于配制果味香精[1]。目前乙酸肉桂酯可從天然植物中提取,由化學法通過酯化或轉酯反應合成[2]以及生物催化法合成[3]。但從天然植物中提取的量極少,不能滿足需要;化學法的副反應復雜,反應條件劇烈,后續提取工藝繁瑣,對設備要求高,環境污染大[4]。生物催化法的反應條件溫和、效率高、專一性強、對環境友好,可以克服化學法的上述缺點[5]。

表1　PCR擴增體系Table 1　PCR amplification system

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又稱甘油酯水解酶,是一類特殊的酯鍵水解酶,能夠催化酯化、酯水解、醇解、轉酯等多種反應[6],在油水界面可催化脂肪分解為甘油和脂肪酸,在非水介質中則催化甘油和脂肪酸合成脂肪[7]。脂肪酶具有界面活化現象,在油水界面的催化活性會得到顯著提高[8]。1984年,Zaks發現酶在有機相中也具有催化活性,改變了“酶只能在水相中進行催化”的傳統觀念,開啟了非水相酶學的時代,酶的應用范圍也得到了極大擴展[9]。

本研究用基因工程手段克隆出來自深海鏈霉菌Streptomycessp.13580基因組中的脂肪酶L-1基因,并實現了該酶在大腸桿菌中的異源表達。利用脂肪酶L-1的酶粉在非水介質中合成乙酸肉桂酯,并對非水介質中合成乙酸肉桂酯的反應條件進行優化。使用深海微生物來源的脂肪酶催化制備香料產品乙酸肉桂酯是綠色的生產過程,具有反應條件溫和、對環境污染小、產品質量高等優勢。本研究為采用深海微生物脂肪酶進一步催化制備乙酸肉桂酯等重要工業香料的應用奠定了較好的工作基礎,為有效利用海洋微生物酶資源提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株Streptomyces sp.SCSIO 13580由中國科學院南海海洋研究所實驗船從南海采集;基因組測序由上海美吉生物科技有限公司完成。

LB發酵培養基含有10% NaCl、10%胰蛋白胨、5%酵母提取粉;固體培養基除上述成分外,還有15%的瓊脂,兩種培養基在使用前均在高溫滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min。

胰蛋白胨、酵母提取粉廣州環凱微生物科技有限公司;正己烷、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乙腈、NaCl廣州化學試劑廠;DMSO(二甲基亞砜)天津市大茂化學試劑廠;丙酮、甲苯成都市科龍化工試劑廠;乙酸仲丁酯、肉桂醇北京百靈威科技有限公司;乙酸乙烯酯、環己烷、十二烷上海阿拉丁生化科技有限公司;PCR所用試劑上海捷瑞生物工程有限公司;鎳柱、脫鹽柱GE醫療集團。

Aeris型PCR儀新加坡ESCO公司;超低溫冰箱SANYO公司;SCIENTZ-IID型超聲破碎儀;SCIENTZ-10N型冷凍干燥機寧波新芝生物公司;GC-MS-QP2010 Ultra型GC-MS(氣相色譜質譜聯用儀)島津公司;Allegra X-30R Centrifuge型低溫離心機Beckman公司;Microfuge 16型微型離心機Beckman公司;MLS-3781L-PC型高壓滅菌鍋SANYO公司;DJS-2012R型搖床上海世平實驗設備公司。

1.2實驗方法

1.2.1目的基因的擴增和連接菌株的總DNA測序完成后,用生物信息學方法對其中一種脂肪酶L-1編碼基因進行邊界確定和引物設計,引物序列為:

F:5′-CACGGATCCATGAGGATCGATCCGCCCG-3′(下劃線為BamH I酶切位點)

R:5′-CATCTCGAGTTAGGCGGGCTGTGGGGTC-3′(下劃線為XhoI酶切位點)

由上海生工生物技術有限公司來合成所需引物,用合成的引物進行PCR擴增。PCR擴增體系如表1所示:

PCR擴增程序為:①95 ℃變性5 min;②95 ℃變性30 s;③65 ℃退火30 s;④72 ℃延伸2 min,②到④循環30次;⑤72 ℃延伸10 min;⑥降溫至18 ℃。將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中用120 V電壓進行電泳20 min,用凝膠成像系統觀察擴增情況,切膠回收1000 bp左右的片段。

用BamH I和XhoI酶切回收產物和pET-28a(+)載體,按5∶1的比例用T4連接酶催化連接20 min后,轉入DH5α感受態細胞中,冰上放置30 min,42 ℃水浴熱激50 s,冰上放置2 min,加入300 μL液體培養基,37 ℃ 200 r/min條件下培養1 h。4000 r/min離心1 min,棄去大部分上清液,保留100 μL左右,混合均勻,涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上。37 ℃培養16 h后挑取單菌落,經酶切和測序驗證無誤則表明連接成功[10]。

1.2.2目的蛋白的表達和酶粉的制備將1 μL連接好的重組質粒轉入BL21感受態細胞中,轉入方法與轉入DH5α感受態細胞的方法相同。將平板上的單菌落接種到試管中,37 ℃培養,待OD600值達到0.5左右時,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導其表達,25 ℃培養16 h,4 ℃ 4000 r/min離心1 min,收集菌體,加入100 μL非變性蛋白裂解液裂解細胞,用SDS-PAGE凝膠檢驗蛋白表達情況[11]。

驗證表達成功后,將菌種接種到300 mL液體培養基中,用同樣的方法培養并誘導其表達,4 ℃ 8000 r/min離心15 min,收集菌體,用20 mLPBS緩沖液(20 mmol/L,pH7.4)懸浮菌體,超聲破碎15 min,4 ℃ 4000 r/min離心15 min,收集上清液,將一部分上清液冷凍于-80 ℃冰箱中,24 h后凍干制成酶粉[12]。

1.2.3目的蛋白的純化用1.2.2的方法將菌體破碎,收集上清液,加入10 mL至鎳柱中,鎳柱上清液與鎳柱結合后,先用20 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白,再用5 mL 500 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白[13],收集中間的3 mL洗脫液,用脫鹽柱SephadexG25按廠家說明書的方法脫鹽。用SDS-PAGE凝膠電泳檢驗蛋白純化和脫鹽情況。

1.2.4乙酸肉桂酯的合成反應在20 mL反應瓶中進行,將0.1 mol/L的肉桂醇和0.2 mol/L的乙酸乙烯酯溶解到5 mL正己烷中,加入30 mg脂肪酶L-1酶粉,在搖床上以200 r/min轉速,37 ℃反應24 h后取出部分樣品進行檢測[14]。肉桂醇與乙酸乙烯酯的轉酯反應的反應式如下:

圖1　脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯Fig.1　Lipase-catalyzed synthesis of cinnamyl acetate

1.2.5產物的檢測反應后的液體取出1 mL左右,12000 r/min離心1 min除去酶粉,加入0.1 mmol/L的十二烷作為內標物,混合均勻后,加入無水硫酸鈉除去水分,取出600 μL用于GC-MS檢測[15]。色譜柱RXI-5MS,進樣口溫度220 ℃,進樣方式:分流,柱流量:1.20 mL/min,離子源溫度200 ℃,接口溫度280 ℃。柱箱溫度50 ℃,恒溫保持1 min,以12 ℃/min的速率上升到150 ℃,再以20 ℃/min的速率上升到300 ℃,恒溫保持1 min。底物肉桂醇和產物乙酸肉桂酯的出峰時間分別為8.250 min、9.600 min。

1.2.6轉化率的測定采用十二烷為內標物進行定量計算。反應完成后,加入0.1 mol/L的十二烷,轉化率(%)=肉桂醇的消耗量/肉桂醇的起始物質的量×100[16]。定義每分鐘轉化1 μmol的底物所需要的酶量為1個酶活單位。

1.2.7酰基供體的選擇分別用乙酸、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸仲丁酯作為酰基供體進行反應,其他條件與1.2.4相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應產物,用肉桂醇轉化率最高的酰基供體進行后續實驗。

1.2.8溶劑的選擇分別以正己烷、正庚烷、環己烷、甲苯、丙酮、DMSO、乙酸乙烯酯為溶劑,用1.2.7中選擇的酰基供體進行反應,其他條件與1.2.7相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應產物,用肉桂醇轉化率最高的有機溶劑進行后續實驗。

1.2.9底物濃度比例對轉化率的影響用1.2.8中選擇的有機溶劑為溶劑,分別以肉桂醇與酰基供體摩爾濃度比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例溶解于溶劑中,其他條件與1.2.8相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應產物,考察底物濃度比例對肉桂醇轉化率的影響,選擇適當的比例。

1.2.10溫度對轉化率的影響用1.2.9中選擇的底物濃度比例,分別在25、30、35、40、45、50、55 ℃環境下反應,其他條件與1.2.9相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應產物,以肉桂醇轉化率最高的溫度為最優溫度。

2　結果與討論

2.1目的蛋白的表達和純化

脂肪酶來源廣泛,在微生物中就有65個屬可用于脂肪酶的生產。但對于特定催化反應而言,可用的脂肪酶就很有限,新型脂肪酶的挖掘就成為許多學者研究的熱點[17]。海洋面積遼闊,具有高壓、高鹽、低溫等多種生態環境,蘊藏著豐富的微生物資源,海洋微生物也成為結構、功能新穎的脂肪酶的重要來源[18]。將脂肪酶L-1的氨基酸序列在NCBI的GenBank數據庫中進行對比,發現其與數據庫中的蛋白質的最大相似度為51%,序列較為新穎。生物信息學方法預測,脂肪酶L-1編碼基因由1005個堿基組成,對應著蛋白序列含有334個氨基酸殘基,理論分子量為35.24 ku,pI為5.07。SDS-PAGE凝膠檢測結果如圖2。鎳柱純化、脫鹽柱脫鹽得到的單一條帶與重組蛋白大小一致,條帶清晰,表明脂肪酶L-1具有可溶性,帶有的組氨酸標記能夠與鎳柱特異性結合,可以用親和層析的方法得到純酶[19]。

圖2　脂肪酶L-1純化、 脫鹽的SDS-PAGE凝膠Fig 2　SDS-PAGE gel of purification and desalination of lipase L-1注:1-蛋白分子量標記;2-IPTG誘導前的總蛋白對照; 3-IPTG誘導后的總蛋白對照;4-IPTG誘導后的細胞上清液; 5-鎳柱穿透液;6-鎳柱純化蛋白;7-脫鹽蛋白。

2.2脂肪酶L-1催化合成乙酸肉桂酯

圖3為反應產物的GC-MS檢測的氣相色譜圖,其初步轉化率為23.7%。為獲得更高的轉化率,需對該反應的條件進行優化,提高乙酸肉桂酯的產率。姚俠等[20]用Novozyme435催化合成乙酸肉桂酯,轉化率達到90%以上;Yadav等[3]用同樣的酶催化,也得到了較高的轉化率;劉昱杉等[4]用固定化的熒光假單胞菌脂肪酶催化轉酯反應,也得到了較高的產率。目前的用生物催化的方法制備乙酸肉桂酯具有較好的可行性。

2.3酰基供體的選擇

不同的酰基供體與肉桂醇反應的速率不同,因此酰基供體的選擇對產物乙酸肉桂酯的合成效率有重要影響。耿博[5]以脂肪酶為催化劑,乙酸、乙酸乙酯為酰基供體,劉昱杉等[4]以固定化的脂肪酶為催化劑,乙酸乙烯酯為酰基供體,均得到較高的產率。Wang等[21]用化學法以乙酸仲丁酯為酰基供體,與甲醇通過轉酯反應制備仲丁醇。因此,選擇不同的酰基供體是酶法和化學法通過轉酯反應制備酯類化工產品的重要因素。本研究中,用乙酸、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸仲丁酯作為酰基供體分別和肉桂醇反應,肉桂醇濃度為0.1 mol/L,酰基供體濃度為0.2 mol/L,以正己烷為溶劑,反應24 h后,用GC-MS檢測反應產物,選用轉化率最高的作為酰基供體。結果如圖4所示,用乙酸乙烯酯作為酰基供體時,肉桂醇的轉化率為23.9%,明顯高于其他酰基供體。乙酸仲丁酯可能是由于烷氧基的空間效應而不被催化。姚俠等[20]用脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯時同樣發現,以乙酸乙烯酯作為酰基供體時,肉桂醇的轉化率最高,并且推測這可能是由于乙酸乙烯酯的產物乙醛是氣體,能夠及時分離出反應體系,促使反應向正反應方向進行。

表2　有機溶劑及其LogP值Table 2　Organic solvents and their LogPs

圖3　轉酯反應產物的氣相色譜圖Fig.3　Gas chromatogram of trans-esterification reaction product 注:十二烷,保留時間:8.385 min;肉桂醇,保留時間: 9.799 min;乙酸肉桂酯,保留時間:11.022 min。

圖4　不同酰基供體對轉化率的影響Fig.4　Effects of aclyl donors on the synthesis of cinnamyl acetate

2.4溶劑的選擇

作為酶促反應的介質,有機溶劑對酶的催化活性和穩定性有重要影響。在有機相中,酶的催化活性與溶劑的疏水性(LogP)有很大關系,親水性溶劑易于奪取酶分子表面的水分子,影響酶的活性,而疏水性強的溶劑則相反,對酶活性的影響要小[22]。以乙酸乙烯酯為酰基供體,分別以正己烷、正庚烷、環己烷、甲苯、丙酮、DMSO、乙酸乙烯酯為溶劑進行比較,它們的疏水性如表2所示,LogP值越高,疏水性越高。從表中可以看出,正己烷、正庚烷等烴類的疏水性要高于丙酮、DMSO和乙酸乙烯酯。每種有機溶劑中的轉化率如圖5所示,以正己烷為溶劑時,肉桂醇轉化率達到31.1%,高于其他溶劑。從結果上看,疏水性較高的幾個溶劑的轉化率均比疏水性較低的丙酮和DMSO要高;推測乙酸乙烯酯對該脂肪酶有底物抑制效應,所以用乙酸乙烯酯作為溶劑時的轉化率偏低[23]。

圖5　溶劑對轉化率的影響Fig.5　Effects of solvent on the synthesis of cinnamyl acetate

2.5底物濃度比例對轉化率的影響

底物的濃度比例會影響反應進行的速率和方向,高濃度的乙酸乙烯酯將提高底物與底物之間、底物與酶之間的接觸面積,增加分子碰撞的幾率;但另一方面,肉桂醇濃度減少使反應體系的粘度增加,酶的活性中心被覆蓋,阻礙反應的進行,同時會增加后續提取產物的難度[24],因此有必要通過比較來確定最佳底物摩爾濃度比例。用不同底物濃度比例反應的結果如圖6所示,隨著比例的增加,轉化率提高,當肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾濃度比為1∶6時,肉桂醇的轉化率達到26.4%,提高乙酸乙烯酯的濃度,肉桂醇轉化率增長較小,為了便于后期分離純化,避免不必要的浪費,選用1∶6的比例進行后面的實驗。

圖6　肉桂醇/乙酸乙烯酯摩爾濃度比對轉化率的影響Fig.6　Effects of cinnamyl alcohol/vinyl acetate ratio on the synthesis of cinnamyl acetate

2.6溫度對轉化率的影響

溫度是影響反應速率和反應方向的重要因素,適當提高反應溫度能夠提高分子的熱運動,增加底物之間相互反應的機會,降低體系的粘度,提高反應速率,進而提高底物轉化率;但過高的溫度會破壞酶的三級結構,降低酶活性,甚至使酶完全失活,又會降低反應速率和底物轉化率[25],所以反應溫度的選擇就顯得十分必要。用不同溫度進行反應的結果如圖7所示,40 ℃時,肉桂醇轉化率達到48.3%,高于其他溫度,高于40 ℃時,轉化率降低,但趨于穩定。

圖7　溫度對轉化率的影響Fig.7　Effects of temperature on the synthesis of cinnamyl acetate

3　結論

深海微生物是新穎優異脂肪酶的重要來源,對海洋微生物資源的利用已引起了越來越多的重視。本研究從深海微生物的基因組出發,用基因工程手段,克隆并異源表達了一個新穎的脂肪酶基因L-1,用酶粉在有機相中催化轉酯合成乙酸肉桂酯。使用單因素實驗方法對脂肪酶L-1催化合成乙酸肉桂酯的反應條件進行優化。從GC-MS檢測的結果來看,使用脂肪酶L-1催化制備乙酸肉桂酯香料的最優反應條件為:以正己烷為溶劑,乙酸乙烯酯為酰基供體,肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾濃度比為1∶6,反應溫度為40 ℃,肉桂醇的轉化率達到48.3%。脂肪酶L-1序列新穎,有很大的潛力可對其通過定向進化等手段進行改造,或通過對其發酵條件、反應條件的進一步優化來提高其轉化率,使其更適應工業要求。采用深海微生物來源的脂肪酶催化制備乙酸肉桂酯產品是綠色環保的生產工藝,反應條件溫和,制備的乙酸肉桂酯產品質量較高,所采用的深海微生物脂肪酶催化高效制造乙酸肉桂酯等香料產品,有希望替代現有的化學合成工藝,具有較好的工業應用前景,希望能夠為更好地利用海洋微生物酶資源提供一種方法和思路。

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Synthesis of cinnamyl acetate by lipase-catalyzed trans-esterification

WANG Zhao-he1,ZHANG Yun2,3,SUN Ai-jun2,3,YANG Zai-chang1,HU Yun-feng2,3,*

(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy of Guizhou Province,School of Fermentation and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of tropical marine bio-resources and ecology,South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China;3.Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica,South China Sea Institute of Oceanology,Guangzhou 510301,China)

One novel gene encoding a lipase L-1 was cloned from the genome ofStreptomycessp.SCSIO 13580 identified from the deep sea of the South China Sea.L-1 contains 1005 bp and encodes a putative lipase that harbors 334 amino acids and exhibits the highest similarity of 51% with other lipases.The lipase was heterologously expressed inE.coli. The lipase could catalyze the trans-esterification reaction of vinyl acetate and cinnamyl alcohol in non-aqueous medium.The effects including cinnamyl alcohol/vinyl acetate ratio(mol/mol),temperature,solvents and aclyl donors,on the catalytic activities were further investigated.The optimum enzymatic working conditions were obtained as follows:vinyl acetate as the acyl donor,n-hexane as the solvent,ratio of cinnamyl alcohol/vinyl acetate 1∶6,reaction temperature of 40 ℃,the maximum conversion rate could reach 48.3%,the activity of enzyme powder was 5.59 U/g.

lipase;trans-esterification reaction;cinnamyl acetate;cinnamyl alcohol;vinyl acetate

2015-10-16

王召賀(1992-),男,碩士研究生,研究方向:發酵工程,E-mail:wzhaohe@foxmail.com。

胡云峰(1980-),男，博士，從事生物酶催化方面的研究,E-mail:yunfeng.hu@hotmail.com。

國家自然科學基金青年科學基金項目(21302199),中國科學院戰略性先導科技專項(XDA11030404),中國科學院重點部署項目(KGZD-EW-606),廣州市科技計劃項目(201510010012)。

TS264.3

B

1002-0306(2016)09-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.031