禾谷鐮刀菌發酵液中玉米赤霉烯酮毒素的提取及純化研究

甄玉萍,裴世春,高建偉,王　巖,郝　廣

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

?

禾谷鐮刀菌發酵液中玉米赤霉烯酮毒素的提取及純化研究

甄玉萍,裴世春*,高建偉,王巖,郝廣

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

本研究旨在通過不同萃取劑和層析柱的使用,從禾谷鐮刀菌發酵液中提取、純化玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)毒素,以期獲得較高純度的毒素。采用超高效液相色譜串聯質譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)分析方法對其效果進行檢測。研究結果表明:在單一的萃取劑中,苯的萃取效果最佳,其得率可達到73.20%;采用Daisogel反相層析柱進行純化,得率可達到69.30%,且樣品中的雜峰數目明顯減少,由此證明該方法對毒素純化效果較好。本研究對發展高純度ZEN毒素的制備技術具有一定的指導意義和參考價值。

真菌毒素,玉米赤霉烯酮,禾谷鐮刀菌,提取,純化

玉米、水稻等糧食作物久置及儲存不當易產生玉米赤霉烯酮毒素[1-2],該毒素是一種2,4-二羥基苯甲酸內酯類化合物,其分子式為C18H22O5,該毒素的產毒菌株主要是鐮刀菌屬(Fusarium)的菌株,如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)等,因該毒素具有生殖發育和免疫毒性,潛在威脅人類健康而備受研究者們的關注[3-6]。然而,現階段國內沒有專門的機構用于大量研制生產高純度的玉米赤霉烯酮毒素,現有的玉米赤霉烯酮標準品均來自國外進口,價格相當昂貴,如何獲取高純度的毒素以便進一步研究成為亟待解決的問題。禾谷鐮刀菌是最為常見的產玉米赤霉烯酮毒素的菌株,通過對其進行培養可以大量產玉米赤霉烯酮毒素[7-10]。本研究在前期培養產玉米赤霉烯酮毒素的禾谷鐮刀菌菌液的實驗基礎上[10],對菌液中的毒素進行提取和純化,以期為制備高純度的玉米赤霉烯酮毒素并將其國產化奠定一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚天津市富宇精細化工有限公司;正己烷、乙酸乙酯天津市恒興化學試劑制造有限公司;苯、乙腈(色譜純)天津市凱通化學試劑有限公司;玉米赤霉烯酮標準品美國sigma公司;110250 5B-05-3-3禾谷鐮刀菌標準菌株(Fusariumboothii)荷蘭生物科技公司;柱層層析硅膠青島鼎康硅膠有限公司;Daisogel反相填料DAISO CO.,LTD.;Hopes C18-SPE北京華盛譜信儀器有限責任公司。

Acquity 超高效液相色譜-質譜聯用(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)儀(光電二極管陣列檢測器、Masslynx4.1工作站)美國Waters公司;循環水真空泵予華儀器有限責任公司;RE52-99旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠;KH5200E型超聲波清洗器昆山禾創超聲儀器有限公司;TZ-A臺式振蕩器上海市躍進醫療器械廠;ZHJH-C1109B超凈工作臺上海智城分析儀器制造有限公司;BSZ-100自動部分收集器上海青浦滬西儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1發酵液的培養選用500 mL的搖瓶,按照每升超純水含C6H12O660 g、KNO31.5 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g的配方進行培養基的配制,將標準菌株活化后,在超凈工作臺內用直徑為2 cm的打孔器取活化菌種的外圈菌餅,接種到滅菌后的液體培養基內,放在振蕩培養箱內進行培養,搖動速度為92 r/min,每日進行10 h光照、14 h黑暗的培養,培養時間為20 d,培養溫度為22.9 ℃[7-12]。

1.2.2ZEN毒素的提取對培養基滅菌后,采用UPLC法對發酵液中的毒素含量進行測定,經多次測定,結果取其平均值249.8 μg/L,因ZEN不溶于水,易溶于乙醚、氯仿等有機溶劑,故先用正己烷和石油醚進行脫脂和去除小分子雜質,然后選擇乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、二氯甲烷五種有機溶劑分別作為萃取劑對菌液中的毒素進行萃取,按照2∶1的體積配比(即每100 mL 菌液用200 mL萃取劑)進行萃取,萃取后非有機溶劑層按照2∶1的體積配比再次進行萃取。合并兩次萃取液,放入旋蒸瓶中進行旋蒸。待旋蒸完畢后,用乙腈定容至5 mL進行檢測[13-15],測得結果為ZEN的濃度,該濃度乘以體積5 mL即為萃取100 mL菌液所得毒素質量,用該質量與之前測定的100 mL菌液中ZEN的質量做比,即為用萃取劑萃取ZEN的得率[16-19]。

1.2.3ZEN毒素的純化

1.2.3.1柱層層析硅膠柱的制備及毒素的純化稱量一定質量的硅膠放入燒杯內,在燒杯中加入適量的正己烷用玻璃棒充分攪拌均勻裝入柱內,讓硅膠依靠重力和洗脫劑的帶動,在柱內自由沉降,待沉降完全后打開下端活塞,此間要不斷把流出的正己烷加回柱內且保持一定的液面,用洗耳球均勻敲打柱子周圍以保證柱內硅膠壓實無氣泡并保持硅膠面的水平,最后在硅膠上面加少許脫脂棉,關閉下端活塞,待用。

打開下端活塞,當柱內溶劑面降至上層脫脂棉與硅膠層界面時,立即用移液管將旋蒸后洗脫下的液體滴加到層析柱內,用少量氯仿-甲醇淋洗5 mL容量瓶并用移液管滴加到柱內,當頁面再次降至脫脂棉與硅膠層界面時,緩慢加入氯仿-甲醇(9∶1)進行洗脫,共加四次,每次50 mL,洗脫速度控制在0.5 mL/min左右,每50 mL接收至圓底燒瓶內,用旋轉蒸發器進行旋蒸,乙腈定容至5 mL,多次重復該實驗,測定結果取平均值[20-23]。

1.2.3.2Daisogel反相填料的活化及毒素的純化稱量適量填料放入燒杯中,加入填料體積三倍的甲醇,用玻璃棒充分攪拌,之后每兩個小時攪拌一次,共攪拌四次后,放于避光處過夜。裝柱方法同上,將待純化液體緩慢加入層析柱內,依次分別加入50%、70%、90%、100%的甲醇50 mL。洗脫液用自動部分收集器進行收集,設定每20 min自動換一次收集試管,按順序進行標記,對收集的洗脫液分別進行檢測,多次重復該實驗,測定結果取平均值[21-24]。

1.2.3.3Hopes C18-SPE小柱的活化及毒素的純化用5 mL甲醇,10 mL超純水對小柱進行活化,然后放置10 min使之充分平衡。將待純化液體加入到柱內,用小型加壓泵進行加壓,使流速保持在2 mL/min,收集洗脫液,多次重復該實驗,測定結果取平均值[19,25-26]。

1.2.4UPLC-MS法UPLC條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相A為體積分數0.1%甲酸溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫條件為0～2 min,20% B;2～9 min,20%～95% B;9～9.1 min,95%～100% B;9.1～11 min,100% B;11～11.1 min,100%～20% B,11.1～13 min,20% B;流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;柱溫40 ℃;樣品室溫度4 ℃;柱后分離進入質譜儀。

質譜條件:電離方式為電噴霧電離(electron spray ionization,ESI)源;檢測方式為負離子[M-H]-模式;錐孔電壓40 V;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度為100 ℃;脫溶劑氣流速600 L/h;反吹氣流量 10 L/h;質量掃描范圍m/z 50～1200。

2　結果與分析

2.1萃取劑的選擇

5種不同有機溶劑作為萃取劑對毒素的萃取效果如表1所示,從表中可看出,苯作為萃取劑對菌液中ZEN毒素的萃取效果最佳,顯著高于其他各種萃取劑的得率(p<0.05)。當以苯作為萃取劑時,100 mL菌液經過提取濃縮后的體積為5 mL,其濃度為3640.05 μg/L,質量為18.20 μg,其得率可達到73.20%。

表1　不同萃取劑對菌液中ZEN毒素的萃取效果及其得率Table 1　Different extraction solvent for the extraction effect of ZEN and its yield

注:原菌液中ZEN的濃度為249.8 μg/L;同列小寫字母不同表示不同萃取劑對ZEN毒素萃取效果的差異顯著性(p<0.05)。

表2　不同體積分數的甲醇洗脫ZEN毒素的效果(μg)Table 2　Different volume fraction of methanol elution of ZEN(μg )

注:同行大寫字母不同表示甲醇體積分數對ZEN毒素洗脫效果的差異顯著性(p<0.05);同列小寫字母不同表示洗脫次數對ZEN毒素洗脫效果的差異顯著性(p<0.05)。

2.2柱層層析硅膠柱純化毒素效果的研究

按照1.2.3.1中方法所做實驗結果如圖1所示,隨著洗脫液的增加,ZEN的產量先增加,后保持不變,表明當洗脫液達到200 mL時,已達到洗脫的最大值,從圖中可看出柱層層析硅膠柱純化后毒素的含量為9.01 μg,與純化前毒素的質量做比,其得率為49.52%。

圖1　柱層層析硅膠柱純化毒素的效果Fig.1　The effect of the mycotoxin purification for layer chromatography silica gel column

2.3Daisogel反相層析柱純化毒素效果的研究

將Daisogel反相填料活化后裝柱,用不同體積分數的甲醇對萃取后的溶液進行洗脫,洗脫結果如表2所示。

將表2中用不同體積分數下的甲醇所洗脫下的ZEN毒素的測定值全部相加,得到的數據為12.45 μg,由此可知,采用Daisogel反相層析柱純化的毒素質量為12.45 μg,經計算,其得率為68.39%。

分析表中數據可知,90%的甲醇其洗脫效果最好,占總得率的54.14%,故改用90%的甲醇200 mL重復進行純化實驗,調整自動部分收集器,每40 min轉動一次,收集洗脫液按順序編號進行檢測,檢測結果如圖2所示。

圖2　90%甲醇洗脫ZEN毒素的效果Fig.2　The effect of 90% methanol elution of ZEN注:編號1為第一個40 min后收集的洗脫液所測得的 ZEN產量,編號2為第二個40 min后收集的洗脫液 所測得的ZEN產量,后續編號所代表的含義依此類推。

經過對圖2中所得結果進行分析可知,用90%的甲醇洗脫ZEN毒素,其產量為12.61 μg,得率為69.30%,該結果與用不同體積分數的甲醇洗脫毒素的效果相比有所提高。且從圖2中可以看出,第9次收集的純化液中,毒素含量已經極少,到第10次,已不能檢測到毒素,因此,選擇前8次的90%的甲醇作為洗脫劑,即將洗脫劑的體積減小至160 mL。

2.4Hopes C18-SPE純化毒素效果的研究

按照1.3.3.3中方法將收集得到的洗脫液進行檢測,可測知ZEN毒素的質量為12.64 μg,得率為69.45%,雖然該得率與Filipe O M S[27]和Raquel M[28]等人采用C18-SPE小柱所得得率相比較低,但由于前者所純化物質與本實驗的毒素性質差異極大,故該得率在可接受范圍之內。

2.5三種純化效果的比較

以ZEN毒素的質量和得率為衡量標準,衡量以上三種純化方法可知,Hopes C18-SPE的純化效果最佳,但考慮到實際因素,由于Hopes C18-SPE的價格昂貴,且體積過小,無法用于大量毒素的純化,故采用Daisogel反相層析柱進行ZEN毒素的純化效果較好。

2.6UPLC-MS檢測

采用UPLC-MS和Masslynx4.1工作站對苯萃取旋蒸液和Daisogel反相層析柱純化后的毒素進行定性定量測定與分析,其結果如圖3、4所示。

圖3　苯萃取旋蒸液中ZEN的離子色譜Fig.3　Ion current chromatograms of ZEN in Benzene extraction and evaporated fluid

圖4　ZEN純化后的離子色譜圖及質譜圖Fig.4　ZEN after purification of ion current chromatograms and mass spectra

從圖3、4中可看出,ZEN的流出時間為5.66 min,對應的其定性分子[M-H]-為m/z 317.15,與ZEN毒素標準品[13-14]的數據一致,證明經過提取和純化所得的真菌毒素是ZEN。比較圖3與圖4可知,純化后樣品中的雜峰數目明顯減少,由此證明Daisogel反相層析柱對毒素純化效果較好。

3　結論

本實驗在培養產ZEN毒素的禾谷鐮刀菌發酵液的基礎上,首先采用不同的有機溶劑作為萃取劑對ZEN毒素進行提取,運用UPLC對不同的萃取液進行比較分析得出苯作為萃取劑對毒素的提取效果最佳,其得率可達到73.20%;然后在純化柱的選擇方面進行綜合考慮,最終選用Daisogel做為純化毒素層析柱的填料,自行填充后的Daisogel反相層析柱純化毒素的得率為69.30%;用UPLC-MS對純化前后的ZEN毒素做比較,可明顯看出,純化后的毒素雜峰少,證明層析柱確實起到了純化ZEN毒素的作用。

本實驗結果為提取高純度的ZEN毒素的方法工藝化、擴大化提供一些基礎性理論依據。在后續的研究中,將會選用多種萃取劑混合的方式對菌液進行萃取,加大層析柱選擇范圍,改變多種填充料,研究柱高柱徑、填充高度、流速等對純化效果的影響[16,19],運用質譜等方法比較得率高低與純化效果之間的聯系,向實現ZEN毒素生產國產化的目標推進。

[1]姜淑貞,楊維仁,楊在賓.玉米赤霉烯酮的代謝、毒性及其預防措施[J].動物營養學報,2011,23(2):196-202.

[2]徐新慧,晏猛,符鋒,等.鄭州某糧庫小麥中玉米赤霉烯酮含量的檢測[J].動物醫學進展,2011,33(4):59-62.

[3]Wang Y,Liu SL,Zheng H,et al.T-2 toxin,zearalenone and fumonisin B1 in feedstuffs from China[J].Food Additives & Contaminants:Part B:Surveillance,2013,6(2):116-122.

[4]張東升,王虎,蔡建榮,等.玉米副產物中玉米赤霉烯酮的ELISA 測定[J].飼料工業,2008,29(1):38-40.

[5]尹青崗,王鋒,趙國華,等.谷物中玉米赤霉烯酮去毒方法的研究進展[J].糧食與飼料工業,2008,8(10):42-44.

[6]龍淼,李鵬,朱連勤,等.微生物降解玉米赤霉烯酮毒素及其機制[J].動物醫學進展,2011,32(11):116-119.

[7]Judith M,Johannes K,Alexander P.Invitrocompetitive interactions of Fusarium graminearum with Aspergillus ochraceus and Penicillium verrucosum with regard to mycotoxin production[J].Journal of Food,Agriculture and Science,2007,5(3):384-388.

[8]徐得月,王偉,陳西平,等.禾谷鐮刀菌產毒影響因子預測微生物學篩選[J].中國公共衛生,2013,29(1):72-76.

[9]張楓,張蕾,張重陽,等.一株產T-2 毒素鐮孢菌的分離、鑒定及其產毒條件的研究[J].微生物學通報,2015,42(2):340-348.

[10]甄玉萍,裴世春,高建偉,等.不同培養條件對禾谷鐮刀菌產玉米赤霉烯酮的影響[J].食品科學,2015,36(21):168-174.

[11]王濱,張簏,李季倫.玉米赤霉烯酮生物合成條件的研究[J].北京農業大學學報,1985,11(1):5-13.

[12]李漢卿,謝勝學,王雪,等.鐮刀菌毒素的研究-(Ι)玉米赤霉烯酮的分離提純及測定[J].黑龍江大學自然科學學報,1991,8(3):17-23.

[13]甄玉萍,裴世春,王巖,等.玉米樣品前處理方法和掩蔽劑對ELISA檢測玉米赤霉烯酮的影響[J].食品科學,2015,36(16):255-260.

[14]謝剛,王松雪,崔華,等.超高效液相色譜法快速檢測糧食中玉米赤霉烯酮的含量[J].糧油食品科技,2014,22(2):71-75.

[15]Choi E H,Kim D M,Chol S W,et al.Analysis of zearalenone andα-zearalenol in animal feed using high-performance liquid chromatography[J].International Journal of Food Science and Technology,2011,46(10):2173-2181.Analytica Chimica Acta,2003,487(2):137-143.

[16]宋范范,張康逸,張薇薇,等.無水乙醇萃取聯合氧化鋁柱層析制備高純磷脂酰膽堿[J].食品科學,2015,36(10):6-10.

[17]Urraca J.L.,Marazuela M.D.,Moreno-Bondi M.C..Analysis for zearalenone andα-zearalenol in cereals and swine feed using accelerated solvent extraction and liquid chromatography with fluorescence detection[J].Analytica Chimica Acta,2004,524(1):175-184.

[18]唐燕文,何衛華,廖霞俐,等.嗎啡有效成分多種提取方法的比較研究[J].食品工業科技,2015,36(5):189-193.

[19]王宏杰,徐劍宏,祭芳,等.飼料中玉米赤霉烯酮的提純與測定[J].江蘇農業學報,2011,27(3):663-667.

[20]胡淼,錢國平,蘇寶根,等.硅膠柱層析純化青蒿素[J].華西藥學雜志,2005,20(4):283-285.

[21]張志強,蘇志國.正相和反相柱層析組合分離純化紫杉醇[J].生物工程學報,2000,16(1):69-73.

[22]尹珺.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)檢測方法的研究[D].南京:南京農業大學,2006:38-49.

[23]徐劍宏,史建榮,祭芳,等.DON毒素的制備純化方法:中國,101914586 A[P].2010-12-15.

[24]Kim H J,Kim S H,Lee J K,et al.A novel mycotoxin

purification system using magnetic nanoparticles for the recovery of aflatoxin B1 and zearalenone from feed[J].Journal of Veterinary Science,2012,13(4),363-369.

[25]鮑蕾,呂寧,吳振興,等.免疫親和柱同時凈化-HPLC法測定植物油中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮[J].食品工業科技,2013,34(9):306-308.

[26]隋凱,李軍,衛鋒,等.免疫親和柱-高效液相色譜法檢測玉米中的玉米赤霉烯酮[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(6):657-690.

[27]Filipe O M S,Vidal M M,Duarte A C,et al.Influence of fulvic acids and copper ions on thiram determination in water[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(16),7347-7354.

[28]Raquel M,José A.G M.Rapid and quantitative extraction method for the determination of chlorophylls and carotenoids in olive oil by high-performance liquid chromatography[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2006,385(7),1247-1254.

Extraction and purification of zearalenone inFusariumgraminearum

ZHEN Yu-ping,PEI Shi-chun*,GAO Jian-wei,WANG Yan,HAO Guang

(College of Food and Biological Engineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)

To obtain highly purified zearalenone,the mycotoxin was extracted and then purified from the fermented liquid ofFusariumgraminearumin this study using different extraction solvents and chromatographic columns. The effects of extraction and purification were evaluated by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS).The results demonstrated that benzene was recognized to be the best one of the single extraction agents,ewhose yield could reach up to 73.20%.Daisogel reverse phase chromatography column was much better chosen to purify zearalenone because its yield was up to 69.30% and the numbers of the impurity peaks significantly decreased.The findings of this study can provide the guidance and reference for the development of highly purity of zearalenone.

mycotoxin;zearalenone;Fusariumgraminearum;extraction;purification

2015-09-21

甄玉萍(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營養與安全，E-mail：zypssf@163.com。

裴世春(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail：1079481030@qq.com。

齊齊哈爾大學研究生創新科研項目(YJSCX2014-015X)；國家科技基礎性工作專項(2013FY113400)；黑龍江省教育廳科學計劃項目(12541871)；齊齊哈爾大學啟動基金(000240)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0155-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.022