菊芋花盤酚類物質(zhì)提取和體外抗氧化活性研究

王海濤,于　濤

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040)

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菊芋花盤酚類物質(zhì)提取和體外抗氧化活性研究

王海濤,于濤*

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040)

目的:明確不同的提取劑對(duì)菊芋(Helianthustuberosus)花盤中次生代謝物質(zhì)含量和體外抗氧化活性的影響,并探究花盤中的主要的酚類物質(zhì)。方法:以菊芋花盤干粉為實(shí)驗(yàn)材料,使用了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑對(duì)材料進(jìn)行提取,測(cè)定了總酚、總黃酮含量,并使用FRAP、DPPH、ABTS三種抗氧化方法測(cè)定樣品的抗氧化活性。通過(guò)超效液相色譜的方法測(cè)定菊芋花盤中主要的酚類物質(zhì)。結(jié)果:60%乙醇提取的情況下總酚含量最高,70%丙酮提取的情況下總黃酮含量最高,菊芋花盤的抗氧化活性較強(qiáng)并且液相分析結(jié)果表明槲皮素是其最主要酚類物質(zhì)。結(jié)論:不同的提取液對(duì)菊芋花盤的次生代謝物提取含量影響顯著,不同的抗氧化方法均表明菊芋花盤有較強(qiáng)的抗氧化活性,槲皮素作為菊芋花盤的主要酚類物質(zhì)可以進(jìn)一步開發(fā)利用。

菊芋,花,總酚,總黃酮,抗氧化活性,槲皮素

菊芋(Helianthustuberosus)原產(chǎn)于北美洲,當(dāng)?shù)氐耐林用窈茉缰熬蛯?duì)其進(jìn)行了栽培,然后在世界范圍內(nèi)廣泛傳播種植[1]。菊芋是一種菊科向日葵屬的多年生草本被子植物,莖高1～3 m,開黃色花,葉子為橢圓形,具有葉毛,地下根莖系統(tǒng)發(fā)達(dá),能結(jié)出很多塊莖[2-3]。與傳統(tǒng)的農(nóng)作物相比,菊芋擁有一系列的優(yōu)點(diǎn):較高的生長(zhǎng)率,比較強(qiáng)的抗寒、抗旱能力,可以在比較貧瘠的土壤中生長(zhǎng),并且對(duì)害蟲和一些植物類疾病有很強(qiáng)的抵御能力[4]。傳統(tǒng)上,菊芋被當(dāng)作食物或者動(dòng)物飼料,而在過(guò)去的兩個(gè)世紀(jì)里,人們開始開發(fā)利用菊芋中的菊粉、低聚果糖和果糖等作為功能性食品的添加劑[5-6]。

生物體氧化過(guò)程中可以產(chǎn)生以超氧陰離子為代表的活性氧自由基,許多人類疾病包括早衰、癌癥、心血管疾病、神經(jīng)衰弱等都與體內(nèi)過(guò)量的自由基有關(guān),使用抗氧化劑來(lái)治療這些疾病是有效的應(yīng)對(duì)方法。由于使用合成的藥物有一定的風(fēng)險(xiǎn)[7-8],人們把越來(lái)越多的注意力轉(zhuǎn)向了自然界中天然存在的抗氧化物質(zhì),這些物質(zhì)可以清除各種各樣的自由基,例如DPPH、ABTS、FRAP和一些有氧細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧[9-10]。許多研究發(fā)現(xiàn)菊芋葉片中總酚、總黃酮的含量很高,并具有良好的抗氧化活性,說(shuō)明菊芋葉片可以作為一種潛在的天然抗氧化物質(zhì)[11-12]。菊芋的花盤一般在側(cè)枝和主干的末端獨(dú)立或者成群分布,被許多小的黃色管狀圓形花圍在中心。目前對(duì)菊芋花盤的研究還是空白的,本研究旨在對(duì)菊芋花盤的抗氧化物質(zhì)的提取和測(cè)定進(jìn)行探索,并通過(guò)超效液相色譜的方法對(duì)花盤中的主要酚類物質(zhì)種類和含量進(jìn)行研究和鑒定。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菊芋來(lái)自課題組東北林業(yè)大學(xué)種植園,在2014年9月中旬花期旺盛時(shí)采摘,去除花瓣,65 ℃烘干,粉碎,備用。Folin-Ciocalteus試劑、沒(méi)食子酸、蘆丁、ABTS、甲醇Sigma;Trolox、DPPH、TPTZ日本;過(guò)硫酸鉀、冰乙酸、FeCl3、NaOAC·3H2O、濃HCl等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

超效液相色譜系統(tǒng)UPLC-PAD,Waters,USA,ACQUITY UPLC H-Class;液質(zhì)聯(lián)用儀系統(tǒng)LC-MS,Waters-AB,USA,AB SCIEX QTRAP 5500;色譜柱Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 Column(2.1×50 mm,1.8 μm);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Eppendorf Concentrator Plus;高速萬(wàn)能粉碎儀泰斯特;恒溫水浴鍋SY21-KP4;電熱鼓風(fēng)干燥箱賽多利斯101-2AB等。

1.2提取

稱取0.l g菊芋花盤的干粉作為一個(gè)樣品,進(jìn)行不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮等提取試劑的比較,每個(gè)樣品加入提取試劑2 mL?；旌虾蟮臉悠吩陬l率100 kHz、功率120 W、溫度45 ℃的條件下超聲1 h,過(guò)夜靜置。離心10 min,取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥,然后向管中加入1 mL甲醇∶水(1∶1)溶液進(jìn)行溶解,離心30 min,上清轉(zhuǎn)移至新管備用,每種提取試劑重復(fù)3次。

1.3總酚含量的測(cè)定

總酚含量的測(cè)定使用福林酚試劑法,選取沒(méi)食子酸作為標(biāo)品[13]。吸取50 μL的樣品加入5 mL離心管中,加入450 μL甲醇∶水(1∶1)溶液補(bǔ)齊到0.5 mL,然后加入0.5 mL福林酚試劑,混勻后加入1.5 mL 10%碳酸鈉溶液,把混合液放在75 ℃水浴中反應(yīng)10 min,760 nm測(cè)定吸光光度值。總酚含量以mg GAE/g DW表示。

1.4總黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)曲的測(cè)定,選取蘆丁作為標(biāo)品[14]。吸取125 μL的樣品加入到5 mL離心管中,然后加入5%亞硝酸鈉溶液搖勻,放置6 min;加入10%硝酸鋁溶液125 μL,放置6 min;加入4%氫氧化鈉溶液1.0 mL,再加入1.125 mL乙醇定容到2.5 mL。總黃酮含量以mg QE/g DW表示。

1.5FRAP抗氧化實(shí)驗(yàn)

FRAP抗氧化實(shí)驗(yàn)根據(jù)以前的方法報(bào)道,選取Trolox作為標(biāo)品[15]。30 μL的樣品加入到3 mL配制好的FRAP溶液,混合后在黑暗下反應(yīng)5 min,595 nm測(cè)定吸光光度值,每個(gè)樣品重復(fù)3次。FRAP總還原力以mg TE/g DW表示。

1.6DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)

DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)根據(jù)以前的方法報(bào)道,選取Trolox作為標(biāo)品[16]。30 μL的樣品加入到3 mL配制好的DPPH溶液,混合后在黑暗下反應(yīng)30 min,517 nm測(cè)定吸光光度值,每個(gè)樣品重復(fù)3次。自由基清除能力以X%來(lái)表示,清除率按以下公式計(jì)算。

X(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai為30 μL樣品溶液+3 mL DPPH試劑混合液的吸光度;Aj為30 μL樣品溶液+3 mL空白溶劑(無(wú)水甲醇)混合液的吸光度;Ac為3 mL DPPH溶液+30 μL空白溶劑混合液的吸光度。

1.7ABTS抗氧化實(shí)驗(yàn)

ABTS抗氧化實(shí)驗(yàn)根據(jù)以前的方法報(bào)道,選取Trolox作為標(biāo)品[17]。30 μL的樣品加入到3 mL配制好的ABTS溶液,混合后在黑暗下反應(yīng)6 min,734 nm測(cè)定吸光光度值,每個(gè)樣品重復(fù)3次。自由基清除能力以X%來(lái)表示,清除率按以下公式計(jì)算。

X(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100

試中:Ai為30 μL空白溶劑(無(wú)水甲醇)+3 mL混合液的吸光度;Aj為30 μL樣品溶液+3 mL DPPH試劑混合液的吸光度。

1.8使用UPLC和LC-MS技術(shù)進(jìn)行酚的定量分析

選擇60%的乙醇花盤提取物,進(jìn)行酚類物質(zhì)的定量分析。選取了14種酚類物質(zhì)標(biāo)品,進(jìn)行LC-MS分析,質(zhì)譜檢測(cè)方式為正離子檢測(cè),掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)。通過(guò)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品酚類物質(zhì)的離子對(duì)、CE及保留時(shí)間等信息的比對(duì)來(lái)鑒定和測(cè)定菊芋花盤的酚類物質(zhì)種類和含量。

1.9數(shù)據(jù)分析

采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同濃度有機(jī)溶劑提取得到的總酚、總黃酮和不同的抗氧化結(jié)果分別進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著水平為p<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度種類有機(jī)溶劑提取得到的總酚結(jié)果

表1　不同濃度有機(jī)溶劑提取得到的總酚含量(mg GAE/g DW)Table 1　The total phenolic content of different concentration solvents extract(mg GAE/g DW)

注:不同大寫字母表示同一有機(jī)溶劑不同濃度間差異顯著(p<0.05)。ND代表沒(méi)有對(duì)相應(yīng)濃度進(jìn)行測(cè)定,表2～表5同。

表2　不同濃度有機(jī)溶劑提取得到的總黃酮含量(mg QE/g DW)Table 2　The total flavonoids content of different concentration solvents extract(mg QE/g DW)

表3　不同濃度有機(jī)溶劑提取物的FRAP抗氧化活性(mg TE/g DW)Table 3　The FRAP antioxidant performance of different concentration solvents extract(mg TE/g DW)

表4　不同濃度有機(jī)溶劑提取物的DPPH抗氧化活性(%)Table 4　The DPPH antioxidant performance of different concentration solvents extract(%)

乙醇、甲醇和丙酮是次生代謝物質(zhì)提取過(guò)程中常用的有機(jī)溶劑,選取了這幾種有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取,并探索相應(yīng)的最佳提取濃度,并且有研究發(fā)現(xiàn)在菊芋葉片總酚提取的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯提取部位的酚含量最高[18],因此也選擇了乙酸乙酯∶水(1∶1)溶劑進(jìn)行了提取。由表1可知,當(dāng)選擇60%的乙醇進(jìn)行提取時(shí),提取得到的酚類物質(zhì)含量最高,為5.54 mg GAE/g DW,60%的甲醇、丙酮的提取效果也較好,提取劑濃度較高時(shí)提取量顯著降低,可能是因?yàn)橹参锒喾蛹扔兴苄缘挠钟兄苄缘?因此中等濃度的有機(jī)溶劑更適合選取。使用甲醇∶乙酸乙酯(1∶1)進(jìn)行提取時(shí),得到總酚含量較低,為1.71 mg GAE/g DW,說(shuō)明不適合直接使用乙酸乙酯對(duì)菊芋花盤進(jìn)行提取,而選取別的有機(jī)溶劑粗提取后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取的效果有待進(jìn)一步探索。

2.2不同濃度種類有機(jī)溶劑提取得到的總黃酮結(jié)果

由表2可知,當(dāng)選擇70%的丙酮進(jìn)行提取時(shí),提取得到的黃酮類物質(zhì)含量最高,為2.95 mg QE/g DW,而乙醇和甲醇的最佳提取濃度分別是40%和60%,分別為2.62 mg QE/g DW和2.16 mg QE/g DW,不過(guò)考慮到丙酮的毒性,實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)選擇40%的乙醇。與總酚的提取類似,選取中等濃度的有機(jī)溶劑對(duì)總黃酮提取效果更好,也與黃酮類物質(zhì)的溶解性有關(guān),并且有研究發(fā)現(xiàn)使用不同濃度甲醇對(duì)菊芋葉片黃酮提取時(shí)最佳濃度是70%[12],也進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。使用甲醇∶乙酸乙酯(1∶1)進(jìn)行提取時(shí),提取得到的黃酮類物質(zhì)含量最低,為0.52 mg QE/g DW。

2.3體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了探究菊芋花盤提取物的體外抗氧化能力,選擇了FRAP、DPPH、ABTS三種方法對(duì)提取到的樣品的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。由表3可知,當(dāng)選擇70%的丙酮進(jìn)行提取時(shí),提取物的FRAP抗氧化活性最強(qiáng),達(dá)到3.88 mg TE/g DW,并且這個(gè)濃度的丙酮提取得到的黃酮含量也最高,而甲醇和乙醇的最適提取濃度分別是50%和70%,含量分別為3.66 mg TE/g DW和3.59 mg TE/g DW。由表4可知,當(dāng)選擇60%乙醇進(jìn)行提取時(shí),提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng),清除率達(dá)到42.65%,此時(shí)總酚類物質(zhì)含量也最高,相同濃度(40%、60%、80%)的乙醇和甲醇提取物比較,乙醇提取物的DPPH自由基清除能力顯著高于甲醇。由表5可知,當(dāng)選擇60%丙酮進(jìn)行提取時(shí),提取物的ABTS自由基清除能力最強(qiáng),達(dá)到91.26%,而甲醇和乙醇最佳的提取濃度分別是50%和60%,分別達(dá)到85.79%和81.77%,并且與另外兩種方法相比,同種溶劑不同濃度間的測(cè)定結(jié)果變化幅度較大,可能此方法更靈敏。3種方法中的乙酸乙酯提取物的抗氧化活性都比較弱,可能與其提取得到的次生代謝物質(zhì)較少有關(guān)。綜合來(lái)看中等濃度的甲醇、乙醇和丙酮提取物的體外抗氧化活性比較強(qiáng),可能與其提取到的總酚和總黃酮含量比較高有關(guān),并且前人已經(jīng)做了許多研究證實(shí)植物的體外抗氧化能力主要是由植物中的次生代謝物決定的[19-21]。隨著人們?cè)絹?lái)越重視從天然植物中獲取抗氧化物質(zhì),改善人類的生活質(zhì)量,菊芋花盤可以作為這樣的植物材料被開發(fā)利用。

表5　不同濃度有機(jī)溶劑提取物的ABTS抗氧化活性(%)Table 5　The ABTS antioxidant performance of different concentration solvents extract(%)

表6　花盤中酚類物質(zhì)含量Table 6　The phenolic compound content in the Jerusalem artichoke disk

2.4UPLC法測(cè)定酚類物質(zhì)種類和含量

圖1　14種標(biāo)準(zhǔn)酚類物質(zhì)和菊芋花盤UPLC分離圖譜Fig.1　UPLC chromatogram of the 14 responding standards and Jerusalem artichoke disk 標(biāo)注:峰1～14分別為沒(méi)食子酸、原兒茶酸、 4-羥基苯甲酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、 表兒茶素、水楊酸、東莨菪內(nèi)酯、3-羥基肉桂酸、 阿魏酸、芥子酸、4-羥基香豆素、槲皮素。

選取了60%乙醇提取條件下的花盤溶液進(jìn)行超效液相色譜液相分析(圖1)。分別以14種標(biāo)品不同梯度濃度混合進(jìn)樣,建立了酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)得11種酚類物質(zhì)的含量如表6,阿魏酸、芥子酸和4-羥基香豆素在樣品中未被測(cè)出。從圖1B中可以看出菊芋花盤中主要的酚類物質(zhì)是槲皮素,峰面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種類的酚類物質(zhì),如表6槲皮素含量為2507.16 μg/g,而鑒定出來(lái)的另外10種酚類物質(zhì)含量都很低,說(shuō)明槲皮素在菊芋花盤中可能是富集的。

3　結(jié)論

選取了甲醇、乙醇和丙酮3種常見的有機(jī)溶劑對(duì)菊芋花盤中的總酚和總黃酮進(jìn)行提取并對(duì)提取效果進(jìn)行分析,結(jié)果表明:60%乙醇提取到的總酚含量最高,達(dá)到5.54 mg GAE/g DW;使用70%的丙酮提取得到的總黃酮含量最高,達(dá)到2.95 mg QE/g DW,不過(guò)考慮到丙酮的毒性,最好選擇40%的乙醇提取總黃酮。為了探究菊芋花盤提取物的體外抗氧化活性,選擇了FRAP、DPPH、ABTS三種方法進(jìn)行抗氧化活性研究,結(jié)果表明:使用70%丙酮提取時(shí),FRAP抗氧化活性最強(qiáng),達(dá)到3.88 mg TE/g DW;使用60%乙醇,此時(shí)DPPH自由基清除能力最強(qiáng),清除率達(dá)到42.65%;使用60%的丙酮得到的提取物ABTS抗氧化活性最強(qiáng),達(dá)到91.26%。使用超效液相色譜技術(shù)測(cè)定出槲皮素是菊芋花盤的主要酚類物質(zhì),含量為2507.16 μg/g,幾乎占到總酚含量的一半。整體來(lái)看,菊芋花盤中酚和黃酮含量比較高,抗氧化活性較強(qiáng),可以作為天然的抗氧化物質(zhì),而槲皮素作為花盤中最主要的酚類物質(zhì)可以進(jìn)一步開發(fā)利用。

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Study on the phenolic extraction andinvitroantioxidant activity of Jerusalem artichoke disk

WANG Hai-tao,YU Tao*

(Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Northeast Forestry University;Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field,Ministry of Education,Harbin 150040,China)

Objective:To study the effect of different extraction agents of Jerusalem artichoke(Helianthustuberosus)disk in secondary metabolism substance content andinvitroantioxidant activity.Methods:Using the disk powder of Jerusalem artichoke as raw material,the different volume fraction of ethanol,methanol,acetone and other organic solvents were used to extract the samples,the total phenolic and flavonoids content was determined,and three different types of radical scavenging capacities including the FRAP,DPPH and ABTS were chosen to determine theinvitroantioxidant activity of the samples.By ultra performance liquid chromatography(UPLC)method,the main phenolics of disk were studied.Results:The highest phenolic content was measured in 60% ethanol extraction.The highest content of total flavonoids was measured in 70% acetone extraction.The Jerusalem artichoke disk showed a stronginvitroantioxidant activity by all three methods and liquid phase analysis results,which showed that the quercerin was the main phenolic in Jerusalem artichoke disk.Conclusion:The different extract had great effect on the secondary metabolics content of Jerusalem artichoke disk and the antioxidant activity of disk was strong.

Jerusalem artichoke;disk;total phenolics;total flavonoids;antioxidant activity;quercetin

2015-11-02

王海濤(1990-)，男，碩士，研究方向：植物次生代謝和生物活性物質(zhì)利用，E-mail：949977257@qq.com。

于濤(1969-)，男，學(xué)士,工程師，研究方向：植物次生代謝和生物活性物質(zhì)利用，E-mail:aisingioro@dlou.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470647)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)09-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.012