雞重組α-干擾素凍干粉劑的凍干保護劑的篩選

姜正軍，康　梅，王少娟，黃　金,2，*

(1.山東華辰生物科技有限公司,山東濰坊 261061;2.浙江工業大學藥學院,浙江杭州 310014)

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雞重組α-干擾素凍干粉劑的凍干保護劑的篩選

姜正軍1，康梅1，王少娟1，黃金1,2，*

(1.山東華辰生物科技有限公司,山東濰坊 261061;2.浙江工業大學藥學院,浙江杭州 310014)

以獲得適宜于制備雞重組α-干擾素凍干粉劑的凍干保護劑為目標,通過凍干保護劑的篩選及凍干保護劑濃度的優化,確定了最優的凍干保護劑配方和裝液量等工藝參數。結果顯示:在最優配方(甘露醇(3%)+PEG(3%))和最佳的裝液量(40%)條件下,凍干粉劑外觀呈海綿狀、表面平整、體積與凍結時的體積基本一致,顏色均勻,無起泡現象,復水迅速而完全。通過生物活性穩定性實驗,證明在最優條件下制備的雞重組α-干擾素凍干粉的生物學效價較為穩定(40 ℃條件下貯藏12個月,生物活性無變化)。最終獲得的凍干保護工藝,對雞重組α-干擾素凍干粉劑工業化生產具有一定的指導和借鑒意義。

雞α-干擾素,凍干保護劑,優化,篩選

干擾素(Interferon)是一類由病毒誘導機體產生的,具有干擾病毒在感染和非感染組織中復制的一類小分子蛋白,具有廣譜、高效和非特異性的作用特點。自從1957年Isaacs等在病毒感染的雞胚中發現了干擾素,到目前為止,干擾素一直是抗腫瘤和非特異性治療和抑制病毒的首選藥[1]。隨著我國畜禽養殖業的發展和獸藥研究的不斷深入,干擾素已普遍應用于畜禽各種疾病感染治療和預防。

研究已經證實:凍干粉劑具備價格低、藥效迅速、使用方便等生物新劑型特點,研制和開發凍干粉劑已成為畜禽用干擾素的發展趨勢[2-4]。不同生物制劑中活性成分的分子結構各不相同,所要求的凍干保護劑種類與濃度也各不相同,保護劑的種類與濃度決定著凍干產品的有效性和穩定性[5-7]。到目前為止,尚未尋找到通用的凍干保護劑,能適用于所有生物制劑的凍干。目前,生物藥品凍干常用的凍干保護劑主要有蛋白質類(人血清蛋白、白明膠)、氨基酸類(甘氨酸、精氨酸、丙氨酸)、醇類(甘露醇、聚乙二醇)、碳水化合物類(單糖、雙糖和多聚糖)和其他(礦物質、表面活性劑、多聚物、緩沖鹽)[8-9]。

表1　單一和復合保護劑的篩選Table 1　Screening of the lyophilized protective

本研究通過凍干保護劑的篩選及凍干保護劑濃度的優化,確定凍干保護劑的最優配方。繼而通過裝液量的優化和生物活性穩定性實驗,最終獲得凍干保護工藝,以期解決制約雞重組α-干擾素凍干粉劑制備的難題,對雞重組α-干擾素凍干粉劑工業化生產具有一定的指導和借鑒意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雞重組α-干擾素原液山東華辰生物科技有限公司;水泡性口炎病毒(VSV)病毒株山東華辰生物科技有限公司研發中心;SPF雞胚山東華辰生物科技有限公司;凍干保護劑蔗糖、甘露醇、右旋糖酐、精氨酸、海藻糖、吐溫80、PEG及其他化學試劑均為化學純國藥集團化學試劑有限公司;脫脂乳蒙牛乳業集團。

LaboGene CoolSafe 110-4冷凍干燥機丹麥LaboGene公司;DNP-9082電熱恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司;BHC-1300IIB2超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2凍干方法

將一定濃度的凍干保護劑加入0.9%的氯化鈉溶液中進行溶解,進行過濾除菌,進行單獨或混合配制成不同成分及含量的保護劑。凍干方法參照參考文獻[2],并有所改進。在超凈工作臺內,將一定量的預先制備的保護劑與干擾素樣品按1∶1比例加入西林瓶中(干擾素的抗病毒活性為1×105IU/mL,初始總體積為1.0 mL/瓶),置-50 ℃預凍4～6 h,-40～-7 ℃自然抽真空干燥24 h,再逐漸升溫至10 ℃,保持3 h。

1.3分析方法

1.3.1溶解度測定每批樣品各取3支,分別向每支制劑中加入1 mL蒸餾水,記錄從開始至透明且無不溶物的時間。

1.3.2生物學活性測定以抗病毒活性為其生物活性測定的目標,所用細胞和病毒由南京農業大學贈送,細胞為雞胚成纖維細胞(CEF),病毒為水泡性口炎病毒(VSV)。測定方法參照參考文獻[10]的抗病毒活性測定方法。

2　結果與討論

2.1凍干保護劑的篩選

在已有報道的凍干保護劑中選取蔗糖、甘露醇、右旋糖酐、精氨酸、海藻糖、脫脂乳作為單一保護劑,選取蔗糖、甘露醇、右旋糖酐與PEG或吐溫進行復配制成復合保護劑,進行了凍干保護劑的篩選,結果如表1所示。經凍干后,從外觀來看蔗糖、海藻糖、蔗糖+吐溫80、甘露醇+吐溫80外觀均出現不同程度的氣泡或分層現象。從抗病毒活性角度看,右旋糖酐、精氨酸、脫脂乳、右旋糖酐(5%)+吐溫80(0.2%)、甘露醇(5%)+PEG(3%)、右旋糖酐(5%)+PEG(3%)的保護效果較好,凍干粉生物學活性顯著高于其他保護劑(p<0.05)。但從外觀、溶解度和凍干粉的生物學活性角度綜合考慮,最終選擇甘露醇和PEG的復合保護劑作為凍干保護劑。

2.2凍干保護劑濃度及裝液量的優化

凍干保護劑中的低分子物質可有效緩解水分子對生物活性物質的副作用[11-12],并能使凍干生物制品仍含有一定量水分,還可促進高分子物質形成骨架,使凍干制品呈多孔的海綿狀,從而增加溶解度。低分子物質主要包括糖類和氨基酸類等。高分子物質在凍干生物制品中主要起骨架作用,防止低分子物質的碳化和氧化,保護活性物質不受加熱的影響,使凍干制品形成多孔性,疏松的海綿狀物,從而使溶解度增加,如聚乙二醇等聚合物。凍干保護劑濃度及西林瓶裝液量直接影響凍干后制品的外觀和溶解度等,并最終影響生物活性。基于此,在確定甘露醇和PEG的復合保護劑為凍干保護劑的基礎上,進行了凍干保護劑配比濃度和西林瓶(20 mL)裝液量的優化。

首先從產品成本控制角度對凍干保護劑配比濃度進行分組(如表2所示),繼而進行凍干實驗,結果如圖1所示。結果表明:與對照組比較,隨著甘露醇和PEG的濃度降低,凍干粉的生物活性在不斷降低,與對照組比較,甘露醇(3%)+PEG(3%)組的生物活性較對照組活性降低幅度不顯著(p>0.05)因此從產品成本控制角度,選擇的凍干保護劑配比濃度。

表2　凍干保護劑配比濃度分組Table 2　Definition the lyophilized protective concentration

注:從產品成本控制角度進行分組。

圖1　凍干保護劑濃度 對雞重組α-干擾素凍干粉劑制備的影響Fig.1　Effects of the lyophilized protectant concentration on the production of lyophilized recombinant chicken α-interferon

其次,在凍干保護劑配方確定的基礎上,對西林瓶的裝液量進行了優化。由圖2可看出,裝液量在30%和40%,生物學活性變化不顯著(p>0.05),但30%裝液量的凍干粉劑有明顯的掛壁現象,產品外觀存在明顯缺陷,不適宜進行市場銷售。隨著裝液量的增加凍干粉的生物學活性有了大幅度下降,因此選擇40%作為最終的裝液量標準。從最終凍干粉劑的外觀來看(如圖3所示),均呈現海綿狀、表面平整、體積與凍結時的體積基本一致,顏色均勻,無起泡現象,復水迅速而完全(30 s內復水為合格)。

圖2　裝液量對雞重組α-干擾素凍干粉劑制備的影響Fig.2　Effects of medium volume on the production of lyophilized recombinant chicken α-interferon

圖3　雞重組α-干擾素凍干粉劑外觀圖Fig.3　Lyophilized power image of recombinant chicken α-interferon

2.3生物活性穩定性實驗

將凍干后的樣品,分別置于4、37、40 ℃條件下進行生物活性穩定性追蹤實驗,結果如表3所示,從定期取樣測定生物活性的結果可以看出,一年內,無論在4 ℃還是在40 ℃(常規加速實驗溫度),樣品的生物活性均變化不顯著(p>0.05),該結果亦表明凍干保護劑的選擇是恰當的。

表3　凍干樣品的生物活性穩定性考察Table 3　Biological activity stability of lyophilized recombinant chicken α-interferon

3　結論

本研究通過凍干保護劑的篩選及凍干保護劑濃度的優化,確定凍干保護劑的最終配方(甘露醇(3%)+PEG(3%)),繼而確定了最佳的裝液量(40%)。凍干粉劑外觀呈海綿狀、表面平整、體積與凍結時的體積基本一致,顏色均勻,無起泡現象,復水迅速而完全(30 s內復水為合格)。通過生物活性穩定性實驗,40 ℃條件下貯藏12個月,生物活性無明顯變化,證明凍干保護劑的選擇是恰當的。最終獲得的凍干保護工藝對雞重組α-干擾素凍干粉劑工業化生產具有一定的指導和借鑒意義。

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Screening of the lyophilized protectant for recombinant chicken alpha-interferon preparation

JIANG Zheng-jun1,KANG Mei1,WANG Shao-juan1,HUANG Jin1,2,*

(1.Shandong Huachen Bio-tech Co.,Ltd,Weifang 261061,China;2.Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

In order to achieve excellent component of lyophilized protectant for chicken alpha-interferon production,lyophilized protectants were screened at first. Secondly,the concentration of protectants and the medium volume were optimized. As the results showed,the mannitol and PEG were selected as the best lyophilized multi-protectants and the concentrations were defined as 3% and 3% respectively. And with the optimized medium volume of 40%,the physical appearance was sponginess and uniform,tabulated,bubble-free and quickly soluble. Under the optimized conditions,the lyophilized recombinant chicken alpha interferon was harvested. The anti-virus activity of alpha-interferon showed no significant difference after 12 months under the temperature at about 40 ℃. This process was successfully established and could be advantageous to its application for chicken alpha interferon production.

chicken alpha-interferon;lyophilized protectant;optimization;screening

2015-08-31

姜正軍(1971-)，男，碩士，高級工程師，研究方向：E-mail:sinostar5555@gmail.com。

黃金(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：蛋白類藥物,E-mail:huangjin979@zjut.edu.cn。

山東省2011年科技發展計劃資助項目(2011GGH22109)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0089-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.009