單因素試驗優選刺五加多糖的提取條件研究

馮 躍　高 騰　顧歡歡　褚秀玲　蘇 建（聊城大學農學院　山東 聊城　252000）

單因素試驗優選刺五加多糖的提取條件研究

馮 躍高 騰顧歡歡褚秀玲蘇 建*
（聊城大學農學院山東 聊城252000）

刺五加是畜禽生產和保健中常用的一味鎮靜安神，補氣活血的中藥。刺五加多糖是刺五加有效成分的重要組成部分。試驗通過熱水浸提法提取刺五加多糖，采用苯酚-硫酸法測定刺五加多糖的含量，考察單因素刺五加粉碎度、提取溶質、提取pH、浸泡時間和脫脂對刺五加多糖提取率的影響。結果顯示，刺五加粉碎度以80目以上，提取溶質選擇50%乙醇，提取pH值選擇6，浸泡時間選擇2h，石油醚脫脂處理，刺五加多糖的提取率最高，達到3.27±0.07%。本試驗為刺五加多糖的臨床生產提供了理論依據。

刺五加多糖提取單因素

隨著畜禽養殖的規模化、集約化發展，中獸藥的劑型要求從散劑向更高的劑型，如口服液或顆粒劑轉化。中藥有效成分的提取方法是影響藥效發揮的關鍵因素。有效成分最佳提取工藝可以最大效率的應用中藥，解決目前中藥的利用效率低，部分中藥供應不足的問題，符合國家生態、節能的發展目標［1］。同時，中藥的提取標準化也有利于中藥制劑的標準化。

抗生素的禁用和食品安全監管的加強，使中藥成為代替抗生素的重要選擇之一，同時中藥具有綠色、環保、藥食同源的功效，更符合養殖業健康養殖和預防為主的觀念。刺五加系五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus）的干燥根及根莖，具有扶正固本、益智安神及補腎健脾等功效，該藥性溫，味辛、微苦［2］。刺五加多糖（ASPS）是刺五加中一類具有生物活性的多糖，其不但具有提高畜禽生產性能的功效，同時還能激活畜禽機體免疫應答，調節機體腸道微生態平衡［3］。但是ASPS在動物生產上的應用研究極為薄弱。ASPS的提取工藝有待進一步優化，本試驗在前期的基礎上，通過考察單因素對刺五加多糖提取率的影響，從而選擇最佳的提取條件以提高ASPS的提取率，減少資源浪費，提高經濟效益。

1　試驗材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料刺五加飲片（批號：20150507，產地甘肅）購于聊城利民大藥房；苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.1.2試驗儀器水浴鍋、萬能粉碎機、離心機、722分光光度計。

1.2試驗方法

1.2.1刺五加多糖含量測定方法刺五加多糖含量測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為標準品（105℃干燥恒重），準確配制濃度為2g/ml的母液，分別稀釋濃度為20、 40、60、80、100、120和140μg/ml的標準溶液。分別吸取0、20、40、60、80、100、120和140μg/ml的葡萄糖標準溶液各1ml，加入8個10ml的具塞試管中，然后每個試管中分別加入7%苯酚溶液1ml，最后每個試管沿管壁迅速加入5ml濃硫酸，搖勻，冷水浴5min后，以第一個試管樣品為空白對照，在波長490nm處測定吸光度（A）值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸分析。

1.2.2刺五加的粉碎度將刺五加飲片60℃干燥后，高速粉碎，分別過10、20、40、60目和80目篩。料水比、提取時間和提取溫度分別使用實驗室已經獲得的最佳提取條件［4］，既料水比1∶25，提取溫度90℃，提取時間2.5h。分別在5個具塞的錐形瓶中加入2g不同粉碎度的刺五加粉末，加入50ml純凈水，水浴鍋90℃水浴2.5h，紗布過濾，濾液適當稀釋后在490nm處測定多糖的含量。

1.2.3提取溶劑精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個具塞的錐形瓶中，分別加入30%、40%、50%、60%和70%的乙醇50ml。

1.2.4提取液的pH值精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個具塞的錐形瓶中，加入50ml的純凈水，用1M HCl和1M NaOH調節pH值分別為5、6、7、8和9 5個梯度。

1.2.5浸泡時間精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個具塞的錐形瓶中，按浸泡時間1、2、3、4和5h，加入50ml的純凈水。

1.2.6脫脂處理精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個具塞的錐形瓶中，分別加入乙醚、石油醚、丙酮、甲醇和乙酸乙酯各100ml，浸泡24h，過濾，烘干藥渣，再加入50ml的純凈水。

1.2.7驗證性試驗使用以上單因素試驗獲得的最佳提取條件，對刺五加多糖提取3次，測定刺五加多糖的提取率。

3　結果和分析

3.1葡萄糖標準曲線的建立

以葡萄糖配制標準溶液，采用苯酚—硫酸法測定不同濃度的葡萄糖在490nm處的吸光值，繪制標準曲線。不同標準濃度葡萄糖與對應吸光值的線性回歸直線如圖1，線性擬合方程為A=0.0095C-0.005，R2=0.9929，試驗表明，葡萄糖濃度在20～140μg/ml范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

附圖　葡萄糖溶液標準曲線

3.2刺五加粉碎度對多糖提取率的影響

刺五加粉碎度對多糖提取率的影響見表1，由表中數據可見，刺五加多糖的提取率隨粉碎度的上升而上升，80目以下最高，10目以上最低，20目、40目和60目相近。藥物的粉碎度越高，越有利于有效成分的溶出，但是20～80目之間的差別不大，80目以上，多糖提取率達到最高。考慮到生產中的經濟性和實用性，臨床生產可以選擇40目粉碎，試驗室選擇80目粉碎。

表1　粉碎度對刺五加多糖提取率的影響　　　　 （%）

3.3提取溶劑對刺五加多糖提取率的影響提取溶劑對刺五加多糖提取率的影響見表2，由表中數據可見，刺五加多糖的提取率開始隨乙醇濃度的上升而上升，50%達到最高，然后隨乙醇濃度的增加而下降。乙醇的極性高于水，隨著乙醇濃度的提高，提取液極性增強，有利于溶液滲透到細胞內，但是多糖不溶于乙醇，所以，當乙醇濃度超過50%時，多糖的溶解度下降，導致提取率也降低。臨床選擇50%乙醇作為提取溶劑最優。

表2　提取溶劑對刺五加多糖提取率的影響　　　　 （%）

3.4提取液pH值對刺五加多糖提取率的影響

提取溶劑pH值對多糖提取率的影響見表3，由表中數據可見，刺五加多糖的提取率在不同pH條件下，以pH6最高。酸堿性對多糖的性質和結構都有影響，強酸和強堿都能造成多糖的降解，特別是強酸。試驗結果顯示弱酸pH6有利于多糖的提取。

表3　提取液pH值對刺五加多糖提取率的影響　　　 （%）

3.5浸泡時間對刺五加多糖提取率的影響

浸泡時間對多糖提取率的影響見表4，由表中數據可見，刺五加多糖的提取率隨浸泡時間的增加而增加。隨著浸泡時間的延長，細胞的結構發生改變，有利于有效成分的溶出。但考慮到時間和經濟因素，選擇2h浸泡即可。

表4　浸泡時間對刺五加多糖提取率的影響　　　（h、%）

3.6脫脂對刺五加多糖提取率的影響

脫脂對刺五加多糖提取率的影響見表5，由表中數據可見，石油醚對刺五加的脫脂效果最好。藥物中的脂肪會影響有效成分多糖的溶出，在提取前通過有機溶劑脫脂，除去不易溶解的脂肪等雜質，更有利于后期多糖的溶出。石油醚的非極性強，價格便宜，脫脂效果好。

表5　脫脂處理對刺五加多糖提取率的影響　　　（h、%）

3.7驗證性試驗

對刺五加多糖的三次提取率見表6，由表中數據可見，三次刺五加多糖的提取率平均為（3.27± 0.07）%。

表6　刺五加多糖的提取　　　　　　　　（%）

4　結論

試驗通過對刺五加多糖提取率的影響因素粉碎度、脫脂、pH值、溶劑乙醇濃度和浸泡時間進行單因素提取實驗，獲得了影響刺五加多糖提取的最佳提取條件。試驗結果顯示，粉碎度、提取介質和脫脂對多糖的提取率影響較大，在生產中有必要重點考慮。

［1］任衛東. 立足畜牧業生產優勢，發展高效生態畜牧業［J］. 山東畜牧獸醫， 2016， 37（230）∶ 46-47.

［2］董文婷， 霍金海， 張海燕等. 刺五加葉的藥理作用研究進展［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2015， 21（23）∶ 220-223.

［3］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典∶一部［S］. 北京∶ 中國醫藥科技出版社， 2010∶ 192.

［4］陳芬芳， 于紅梅， 王瑞等. 刺五加多糖的提取工藝研究［J］. 中國飼料， 2015， 1∶ 22-24.

S853.73

A

1007-1733（2016）08-0008-02

聊城大學大學生科技文化創新基金資助，項目編號：（SF2014210）

2016-04-26）