反油酸處理對人HepG2細胞代謝組的影響

劉　瑩,劉會昌,石建新

(上海交通大學生命科學技術學院,上海 200240)

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反油酸處理對人HepG2細胞代謝組的影響

劉瑩,劉會昌,石建新*

(上海交通大學生命科學技術學院,上海 200240)

本研究以人細胞(HepG2)為模型,通過MTT實驗研究反油酸對HepG2細胞存活率的影響,選擇1.2 mmol/L和1.5 mmol/L的反式油酸處理HepG2細胞6和12 h,利用UPLC-MS/MS和GC-MS對HepG2細胞的代謝組進行檢測,以了解人細胞對反式油酸的代謝反應。結果表明,反油酸處理引起了HepG2細胞代謝水平的廣泛變化。反油酸處理促進了脂肪酸合成,引起細胞磷脂代謝顯著變化及細胞膜的重構,也增加了膽固醇和酰基甘油代謝中間產物的水平;同時,反油酸引起糖類和氨基酸代謝途徑的增強,為脂肪酸合成提供原料。本研究獲得的體外代謝組水平的變化為揭示反式脂肪酸與人類健康的不良關系提供了新的證據。

反油酸,反式脂肪酸,代謝組學,膽固醇代謝,HepG2細胞

反式脂肪酸(TFA)是一類包含一個或多個反式構型雙鍵的不飽和脂類分子。日常膳食中的反式脂肪酸主要來源于人造氫化植物油(iTFA),少量來源于天然反式脂肪酸(rTFA)。流行病學研究表明,rTFA對人體健康無害也無益,但iTFA可以增加心血管疾病的風險,與II型糖尿病和代謝綜合癥等疾病有一定的相關性[1]。研究證實,iTFA對血脂產生不良的影響,主要表現在增加膽固醇和低密度脂蛋白-膽固醇的含量,減少高密度脂蛋白-膽固醇的水平[2]。目前的研究大多集中在動物實驗和流行病學方面,實驗方面的研究主要集中在膽固醇及脂蛋白相關途徑中單分子水平和活性的測定[3],然而,iTFA對人體健康的影響應該是多種分子共同影響的結果。

代謝組學是揭示生物體系(細胞、組織或生物體)受外界刺激后其內源代謝產物種類、數量及其濃度整體變化規律的學科。代謝物是細胞調控或生化過程的終端產物,其變化反映的是被干擾生物體系最終生命活動的結果。同時,通過代謝途徑中關鍵代謝物的功能分析可發掘重要的生物標志物,以便用于疾病或反式脂肪酸的暴露監控管理[4-5]。

目前只有脂肪組學技術被用于研究反油酸對人體細胞脂肪組代謝的影響[6]。事實上,反式脂肪酸對人體健康影響并不局限于脂類代謝。因此,本研究采用非靶標代謝組學技術全面揭示反油酸處理對人HepG2細胞代謝組的影響,為揭示反式脂肪酸影響人類健康的分子機制提供代謝組依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

HepG2細胞中科院上海生命科學研究院細胞資源中心;反油酸(EA),油酸(OA),二甲基亞砜(DMSO),噻唑藍(MTT)均為美國Sigma公司產品;DMEM培養基為美國Invitrogen公司產品;胎牛血清(FBS)法國Biowest公司;青霉素鏈霉素溶液和0.25%胰酶Solarbio公司。其它所用試劑均為分析級。

超凈工作臺蘇州施威克環保科技有限公司;SHY-2A型數顯水浴恒溫振蕩器上海豫康科教儀器設備有限公司;酶標儀和高速離心機基因有限公司;CO2恒溫培養箱上海三騰儀器有限公司;倒置顯微鏡上海豫光儀器有限公司;冷凍干燥機上海安普科技有限公司;超高效液相色譜-線性離子阱質譜聯用儀沃特斯(Waters)公司;氣相色譜質譜聯用儀熱電(Thermo)公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養HepG2細胞采用DMEM培養基(含10%胎牛血清+1% 100×青霉素鏈霉素溶液)進行培養,培養箱條件為37 ℃,5% CO2。細胞每隔兩天換一次培養基,一周傳代2次。反油酸和油酸采用不含脂肪酸的BSA促進溶解,實驗時稀釋成不同的濃度。空白對照組采用不含反油酸和油酸并添加與實驗組等濃度BSA的培養基培養。

1.2.2MTT實驗采用MTT實驗評估反油酸對HepG2細胞存活率的影響。在96孔板中培養細胞(5×103/孔)細胞,每組設有6個重復。8 h后,待細胞貼壁,將培養基換成分別含有0、0.75、1.0、1.2、1.5 mmol/L反油酸的培養基繼續培養12,24和40 h,1.5 mmol/L油酸作為對照。培養結束后,加入MTT(5 mg/ml)20 μL并繼續培養,4 h后,吸凈培養基,加入150 μL DMSO溶解甲瓚。恒溫振蕩器震蕩10 min后,采用酶標儀檢測570 nm處的OD值,細胞存活率=1-(空白組OD值-實驗組OD值)/空白組OD值。

1.2.3代謝組樣品制備基于MTT實驗結果,采用1.2 mmol/L和1.5 mmol/L反油酸,1.5 mmol/L油酸和DMEM培養基(空白對照組)對HepG2細胞分別進行6 h和12 h培養,每組有四個重復。培養結束后,將HepG2細胞收集到2 mL EP管中,4 ℃、1000 r/min離心2 min,棄上清,用冷的PBS洗兩遍,將細胞沉淀放在-80 ℃冰箱備用。

1.2.4代謝組分析采用美國METABOLON公司比較成熟的UPLC-MS/MS和GC-MS代謝組平臺檢測不同處理組HepG2細胞代謝物。對于樣品的抽提,向細胞沉淀中加適量體積的超純水,震蕩懸浮,吸取懸浮液100 μL至96深孔板中,加入適量甲醇提取液,使用Geno Grinder 2000(Glen Mills INC.,Clifton,NJ)680 r/min振蕩2 min,振蕩結束后,4 ℃ 3000 r/min離心5 min,吸取三份上清分別用于LC-MS/MS(+),LC-MS/MS(-)和GC-MS檢測。所得到的數據經過標準化處理后比對到Metabolon公司的數據庫,進行檢索、鑒定和相對定量[7]。

1.2.5代謝物途徑和功能分析采用t-test檢驗(p<0.05)得到與空白對照相比顯著變化的代謝物,并通過錯誤發現率(FDR)的計算對p值進行校正,FDR值小于0.1說明結果可信;通過SIMCA-P+11軟件對得到的數據進行主成分分析(PCA)和判別分析(PLS-DA)來確定與對照組的差異[8],最后使用KEGG和HMDB數據庫對變化顯著的代謝物進行途徑和功能分析。

2　結果與分析

2.1反油酸對細胞存活率的影響

由圖1可知,低濃度(0.75 mmol/L)的反油酸對HepG2細胞的增值有促進作用,當濃度大于等于1 mmol/L時,反油酸以濃度和時間依賴的方式降低HepG2細胞存活率。經終濃度為1.2 mmol/L和1.5 mmol/L的反油酸處理12 h后,細胞存活率分別為88%和67%;經終濃度為1.2 mmol/L和1.5 mmol/L的反油酸處理24 h后,細胞存活率分別降至66%和48%,而經1.5 mmol/L油酸處理12 h和24 h的HepG2細胞的存活率沒有顯著差異。當處理時間達到40 h時,1 mmol/L的反油酸使HepG2細胞的存活率降至25%,顯著低于1.5 mmol/L油酸處理組(p<0.05)。基于此分析結果,1.2和1.5 mmol/L反式油酸處理6 h(短期處理)和12 h(長期處理)后的HepG2細胞被用來進行代謝組學分析。

圖1　反油酸和油酸處理對HepG2細胞存活率的影響Fig.1　Effects of elaidic acidand oleic acid on HepG2 cells viability注:與空白組比較:*代表差異顯著(p<0.05),**代表差異極顯著(p<0.01)。

2.2反油酸對細胞代謝的影響

經LC-MS/MS和GC-MS檢測,在HepG2細胞中總鑒定到212種不同的化合物,其中氨基酸57種,脂類68種,糖類29種,核苷酸22種,輔酶和維他命14種,多肽16種,其它代謝物6種。由主成分分析(PCA)(圖2)可知,處理6 h后,與油酸處理組相比,反油酸處理組樣品和空白對照樣品有較好的分離,而12 h后,油酸處理樣品和空白對照樣品也能分開,表明油酸長時間處理也會導致細胞代謝組的變化。反油酸處理導致的代謝組的差異更為明顯,無論是6 h組樣品還是12 h組樣品,反油酸處理樣品和空白樣品以及反油酸處理樣品和油酸處理樣品之間均存在明顯的分離。由偏最小二乘判別分析(PLS-DA)可知,33種代謝物在反油酸處理6 h和12 h同步顯著變化(表1),它們對區分反油酸和油酸處理樣品至關重要。這些代謝物包括22種脂類(脂肪酸、磷脂、膽固醇等)、2種糖類、5種氨基酸和3種輔酶。

表2　反油酸和油酸處理對HepG2細胞代謝組的影響

注:圖中數字表示反油酸和油酸處理引起細胞中顯著變化的代謝物數量(p<0.05)。

圖2　不同處理組間細胞代謝物的主成分分析Fig.2　Principle component analysis(PCA)of detected cell metabolites of different treatments

VarID(Primary)參與代謝途徑6h12hM1.VIP[6]M1.VIP[6]油酸(18∶1n9)脂肪酸1.65631.4987丙酰肉堿脂肪酸1.55881.0516二十二碳五烯酸(n6DPA;22∶5n6)脂肪酸1.09411.3105二十二碳五烯酸(n3DPA;22∶5n3)脂肪酸1.06461.288510-十七碳烯酸(17∶1n7)脂肪酸1.05641.2985順式十八碳烯酸(18∶1n7)脂肪酸1.05241.3592二十二碳六烯酸(DHA;22∶6n3)脂肪酸1.03891.3788二十碳三烯酸(20∶3n9)脂肪酸1.01121.2677花生四烯酸(20∶4n6)脂肪酸1.00761.3066二十二碳二烯酸(22∶2n6)脂肪酸1.00371.2451甘油磷脂膽堿(GPC)磷脂1.70951.3213膽堿磷脂1.60151.5907胞苷二磷酸膽堿磷脂1.44371.6312磷酸乙醇胺磷脂1.38591.3258角鯊烯膽固醇1.65501.1197環氧化鯊烯膽固醇1.59201.2727

續表

反油酸處理引起的差異變化代謝物參與的主要代謝途徑有脂類代謝、氨基酸代謝和碳代謝,變化最顯著的是脂類代謝(表2)。其中,差異代謝物中的甘油磷酰膽堿和磷酸乙醇胺被證實與心血管疾病的發生有一定的相關性[5]。

2.2.1反油酸對脂肪酸合成的影響與油酸相比,反油酸對細胞中脂肪酸合成的影響最為顯著。細胞內游離脂肪酸的增加主要是用于脂肪酸合成以及脂肪酸長鏈延伸。由圖3(根據KEGG和HMDB數據庫繪制)可知,處理6 h時,與油酸相比,反油酸引起棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、DHA和花生四稀酸等脂肪酸水平的提高,其可能的原因是促進了棕櫚酸合成限速酶(ACACA)的表達[9]。

圖3　反油酸和油酸對脂肪酸合成的影響Fig.3　Effects of elaidic acid and oleic acid on fatty acid synthesis注:背景數字代表處理組與空白組相比代謝物水平顯著上升或下降的倍數:白色背景表示無顯著變化,灰色背景表示顯著下降,黑色背景表示顯著上升。代謝物后面左邊的數字代表油酸處理引起的變化倍數,右邊的數字代表反油酸處理引起的變化倍數。圖4、圖5和圖6同。

圖4　反油酸和油酸對磷脂代謝的影響Fig.4　Effects of elaidic acid and oleic acid on phospholipid metabolism

經反油酸處理12 h時,細胞內不飽和脂肪酸仍保持高水平,說明反油酸處理持續激活脂肪酸鏈伸長和去飽和過程。這個結果與文獻中已報道的反油酸可增加固醇調節元件結合蛋白1(SREBP-1)目的基因表達水平一致,該元件的過量表達可以促進脂肪酸合成過程[9-10]。值得注意的是,油酸處理對細胞脂肪酸合成的影響與反油酸不同:油酸處理6 h和12 h后,細胞中油酸水平均顯著升高;其次,經油酸處理12 h的細胞中棕櫚油酸、二十二碳六烯酸和豆蔻酸水平均顯著下降(圖3)。

2.2.2反油酸對磷脂代謝的影響甘油磷脂是細胞膜的主要組成成分,對細胞起到保護作用并參與多種細胞信號傳導及囊泡運輸。由圖4可知,反油酸和油酸處理均導致細胞甘油磷脂含量發生顯著變化。處理6 h和12 h時后,油酸主要影響磷脂酰膽堿的代謝,體現為胞苷二磷酸膽堿酯和甘油磷脂膽堿水平的上升,以及磷酸膽堿和1-棕櫚酰-GPC(16∶0)水平的下降,表明油酸對細胞膜重建的影響主要限制在磷脂酰膽堿途徑。與油酸相比,反油酸對細胞磷脂代謝和細胞膜重建的影響更為廣泛。6 h和12 h的反油酸處理顯著降低了細胞的磷酸乙醇胺和胞苷二磷酸乙醇胺的水平(圖4)。6 h和12 h的反油酸處理還顯著提高了細胞的乙酰膽堿、1-油酰基-GPE(18∶1)、1-油酰基-GPI(18∶1)和1-油酰基-GPS(18∶1)的水平(表3)。這三種油酰基磷脂酸衍生物是溶血性磷脂代謝的中間產物并參與磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸代謝,它們的水平提高在缺血性腦卒(腦梗死)患者中曾有報道[11]。這些油酰基磷脂酸衍生物的變化可能與反式脂肪酸引起細胞中負責磷脂合成及重構的轉錄因子(PCYT2)的表達變化[12-13]相關。此外,這些變化也可能與反油酸可替代細胞膜磷脂中不飽和脂肪酸的脂肪酸基團相關[14]。綜上所述,反油酸處理影響了細胞膜重建及磷脂代謝。

2.2.3反油酸對膽固醇代謝的影響由圖5可知,經反油酸和油酸處理6 h,細胞中膽固醇水平未發生顯著變化;處理時間為12 h時,反油酸和油酸處理組細胞中膽固醇水平均顯著降低。油酸和反油酸處理12 h后導致細胞內膽固醇含量下降的可能原因是油酸和反油酸處理導致膽固醇結合脂肪酸形成膽固醇脂,或增加膽固醇酯和膽固醇的流出量,從而導致胞內膽固醇含量降低[13,15]。從膽固醇合成中間產物含量的變化來看,6 h 和12 h時的反油酸和油酸處理均顯著提高了細胞中角鯊烯、角鯊烯環氧化物、羊毛甾醇和7-脫氫膽固醇等膽固醇合成中間產物的水平。反油酸處理比油酸處理引起的膽固醇中間代謝物的變化更明顯。

表3　反油酸和油酸對HepG2細胞單酰基甘油代謝的影響

圖5　反油酸和油酸對膽固醇代謝的影響Fig.5　Effects of elaidic acidand oleic acid on cholesterol synthesis

圖6　反油酸和油酸對糖酵解、戊糖磷酸途徑和氨基酸回補反應的影響Fig.6　Effects of elaidic acid and oleic acid on glycolysis,pentose phosphate pathway and amino acid anaplerosis

注:↑和↓分別表示代謝物水平顯著上升和下降(p<0.05),未標注表示變化不顯著。

2.2.4反油酸對單酰基甘油代謝的影響由表3可得,處理時間為6 h和12 h時,反油酸和油酸均顯著影響單酰基甘油的代謝,表現為細胞內1-油酰甘油酯(18∶1)和2-油酰甘油酯(18∶1)單酰基甘油水平的上升。反油酸處理6 h后,細胞內2-棕櫚酰甘油酯(18∶1)的水平顯著增加。總體來講,反油酸處理影響的單酰基甘油的種類更多。單酰基甘油酯可以分解為脂肪酸和甘油,也可在甘油酯激酶的催化下產生溶血磷脂酸,重新進入酯化反應形成三酰基甘油或者參與信號傳導。有研究發現反油酸可以引起三酰甘油代謝過程中PNPLA3基因表達水平的增加[9,16],而PNPLA3基因的表達與三酰甘油和二酰甘油的含量呈正相關,在脂肪生成過程中發揮重要的作用[9,16]。本實驗結果從代謝水平上說明反油酸可以引起酰基甘油代謝的變化。

2.2.5反油酸對碳氮代謝的影響細胞內脂肪酸的主要來源于胞外攝取和胞內自身合成兩個途徑,其中胞內自身合成需要糖酵解途徑和氨基酸回補的支持[17]。由圖6可知,與油酸組相比,反油酸處理組葡萄糖和核糖水平顯著上升,說明細胞需要吸收葡萄糖來滿足反油酸引起的合成代謝增加的能量需求。經反油酸處理6 h的細胞中磷酸戊糖途徑的中間產物6-磷酸葡萄糖酸和核糖水平顯著升高,表明細胞通過增強磷酸戊糖途徑為脂肪酸合成提供支持。此外,細胞還通過增加氨基酸的攝入及代謝水平為細胞代謝提供支持,特別是支鏈氨基酸(亮氨酸和纈氨酸)和芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)代謝。氨基酸的回補反應還體現在氨基酸降解過程中4-甲基-2-氧代戊酸酯和3-甲基-2-氧代戊酸甲酯等中間體含量的升高(見表3)。綜上可知,與油酸相比,反油酸處理顯著影響糖代謝和氨基酸代謝,為脂肪酸合成提供原料。

3　結論

反油酸可以引起HepG2細胞代謝組的顯著變化,主要涉及脂類代謝的各個方面,特別是脂肪酸合成、磷脂代謝、膽固醇和酰基甘油代謝,從而影響到細胞脂肪酸從頭合成、膽固醇合成、磷脂代謝以及細胞膜的重建。反油酸還顯著影響糖酵解、戊糖磷酸途徑和氨基酸代謝,從而影響細胞的生命活動。反油酸對人體細胞代謝水平的影響為理解反式脂肪酸對人體健康不利的分子機制提供了代謝組學依據。結合其它組學技術,該研究結果將有助于發現人體細胞對反式脂肪酸的暴露和效應標志物。由于本研究采用的是非靶標代謝組學技術,因而鑒定到的顯著變化的代謝物比較多,變化的代謝通路也比較多。這些結果有助于整體認識反油酸對人體細胞的毒害機制,但還不能一一深入揭示其毒害機制。單從代謝水平上來看,今后要針對反油酸對不同代謝途徑的影響開展靶標性的代謝組研究,進一步從代謝途徑水平明確其毒理。此外,目前獲得的可能生物標志物(代謝物)還需要結合轉錄組和/或蛋白組的數據進行最后的確認,使研究結果真正服務于食品中反式脂肪酸的風險評估和監管。

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Effect of elaidic acid on the metabolomic changes of human HepG2 cells

LIU Ying,LIU Hui-chang,SHI Jian-xin*

(School of Life sciences and Biotechnology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

The human HepG2 cells were used to investigate the metabolomic responses of HepG2 cells to the exposure of elaidic acid,with the aim to reveal the molecular mechanisms underlying its harmful effects on human health. Based on the preliminary result of toxicological assay,HepG2 cells were treated with 1.2 mmol/L and 1.5 mmol/L elaidic acid for 6 and 12 h,and the metabolome changes of these cells were analyzed by using a non-targeted platform composing of UPLC-MS/MS and GC-MS. Statistic data revealed that the treatment of elaidic acid resulted in remarkable metabolome changes in HepG2 cells in a time-dependent way. Elaidic acid treatment accelerated the pathway of fatty acid synthesis,led to the significant changes in phospholipid metabolism,the reconstruction of cell membrane,and the increase of the levels of intermediates involved in cholesterol and acylglycerol metabolism. Eladic acid treatment also enhanced the sugar and amino acid pathways,which provided fuel for the accelerated synthesis of fatty acids. Theseinvitrometabolomic data provide novel insights into the detrimental effects of trans-fatty acids on human health.

elaidic acid;trans-fatty acids;metabolomics;cholesterol metabolism;HepG2 cells

2015-12-14

劉瑩(1992-),女,碩士,研究方向:生物化學與分子生物學,E-mail:rouyuezuoban@163.com。

石建新(1966-),男,博士,副研究員,主要研究方向為生物化學與分子生物學,E-mail:jianxin.shi@sjtu.edu.cn。

國家基礎研究項目(2012CB72804)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)11-0332-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.060