鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽衍生-HPLC法測定果蔬中甲醛含量

李　俊,王　輝,劉　輝,陳中愛,劉　嘉,陳朝軍,唐健波,呂　都,劉永翔

(貴州省生物技術(shù)研究所,貴州貴陽 550006)

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鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽衍生-HPLC法測定果蔬中甲醛含量

李俊,王輝,劉輝,陳中愛,劉嘉,陳朝軍,唐健波,呂都,劉永翔*

(貴州省生物技術(shù)研究所,貴州貴陽 550006)

通過鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽與甲醛衍生,建立了測定果蔬中甲醛含量的高效液相色譜法。樣品在溫度為70 ℃超聲波條件下直接提取衍生30 min,經(jīng)離心純化后液相色譜檢測,外標(biāo)法定量。優(yōu)化的色譜條件為:Eelipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈和水(70∶30,v/v),流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,檢測波長210 nm。結(jié)果表明,該方法的檢出限可達(dá)到0.114 mg/kg,在0.57～57 mg/kg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均回收率為82.3%～94.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.1%(n=6)。該方法樣品前處理簡便,穩(wěn)定性好,檢測限低,適合果蔬中甲醛的快速定量檢測。

甲醛,高效液相色譜,鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽,衍生

甲醛(formaldehyde),俗稱蟻醛,在常溫下是一種無色具有強烈刺激性氣味的氣體,易溶于水、醇和醚,35%～40%的甲醛水溶液被稱為福爾馬林[1]。甲醛屬于中等毒性物質(zhì),過量攝入會導(dǎo)致頭痛、乏力、嘔吐、失眠以及神經(jīng)紊亂[2-3]。研究表明,甲醛還有遺傳毒性和致癌性[4]。甲醛是我國禁止在食品中添加和使用的物質(zhì),其具有一定的防腐功效,近年來有關(guān)甲醛污染果蔬的報道越來越多,已嚴(yán)重危害到人們的健康[5]。目前測定食品中甲醛含量的方法主要有分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]、氣相色譜法[8]等,甲醛檢測標(biāo)準(zhǔn)方法有SC/T 3025-2006、DB44/T 519-2008、SN/T 1547-2011、NY/T1283-2007[9-12]等,主要用于測定水產(chǎn)品、香菇、米面制品、啤酒、乳飲料等產(chǎn)品中甲醛含量,而針對果蔬中甲醛的檢測方法鮮有報道。因此,急需建立一種高效、穩(wěn)定的果蔬中甲醛含量的檢測方法。這對于完善市場監(jiān)管和食品中甲醛檢測標(biāo)準(zhǔn)方法體系具有重要意義。

現(xiàn)有甲醛檢測方法的原理都是通過一種衍生劑與甲醛結(jié)合生成一種穩(wěn)定的衍生物,通過檢測衍生物來確定甲醛含量,常用的衍生物為乙酰丙酮和2,4-二硝基苯肼。乙酰丙酮分光光度法的原理是乙酰丙酮與甲醛的顯色反應(yīng),果蔬樣品的顏色對檢測結(jié)果干擾較大;2,4-二硝基苯肼與甲醛的衍生物在水中溶解度不高[13],且前處理過程中操作繁瑣,易造成檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。本研究通過鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)[14]與甲醛衍生,優(yōu)化衍生反應(yīng)條件,改進(jìn)前處理工藝,通過高效液相色譜檢測,為果蔬中甲醛檢測提供一種穩(wěn)定高效的定量檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘋果、桔子、白菜、白蘿卜、辣椒、西蘭花、姜購于重慶市北碚區(qū)永輝超市;鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司購買;乙腈色譜純;37.0%～40.0%甲醛溶液購買于成都市科龍化工試劑廠,用碘量法[15]標(biāo)定其精確濃度為1.14 mg/mL,配制甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為114 μg/mL;其他試劑均為分析純。

1290超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器美國Agilent公司;DK-8D型三孔電熱恒溫水槽上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;722-P型紫外可見分光光度計上海現(xiàn)代儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1液相色譜條件的選擇準(zhǔn)確移取200 μL 114 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mg/mL PFBHA衍生劑,用蒸餾水定容至10 mL,在60 ℃水浴條件下加熱30 min,冷卻后過0.22 μm混合相濾膜,然后置于高效液相色譜儀上用DAD檢測器進(jìn)行全波長掃描,確定最佳吸收波長。選取乙腈和水作為流動相,流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,使流動相比例分別為乙腈∶水=60∶40、70∶30、75∶25、80∶20、90∶10來確定最佳流動相比例。同時根據(jù)最佳流動相比例調(diào)節(jié)柱溫分別為30、35、40 ℃來確定最佳柱溫。

1.2.2同時提取衍生條件的確定

1.2.2.1衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇對衍生反應(yīng)有影響的3個因素:衍生劑加入量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間,進(jìn)行正交優(yōu)化實驗,分別測定每組的峰面積。

1.2.2.2超聲波提取法中乙酸鋅和亞鐵氰化鉀用量的確定準(zhǔn)確稱取打碎后的白菜樣品10.00 g,置于100 mL具塞離心管中,在每份樣品中分別加入21.9%的乙酸鋅、106 g/L的亞鐵氰化鉀和二者(1∶1)混合溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL,補足蒸餾水至50 mL,設(shè)定超聲波功率100 W,溫度60 ℃,超聲提取30 min,然后在離心機上8000 r/min離心5 min,將上清液移入50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至50 mL,移取2.0 mL提取液,用分光光度計在413 nm波長下檢測其吸光值[7](若溶液中有少許雜質(zhì)需過0.22 μm水相濾膜),并做空白實驗。

表1　衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實驗因素水平表

1.2.2.3超聲波提取條件的正交優(yōu)化實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇對超聲波提取有較大影響的3個因素:提取時間、超聲波功率、提取溫度,進(jìn)行正交優(yōu)化實驗。選擇西蘭花作為樣品。

表2　超聲波提取條件的正交優(yōu)化實驗因素水平表

1.2.3乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對甲醛-PFBHA衍生物的影響準(zhǔn)確移取50、100、200 μL 114 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液各兩份于10 mL容量瓶中,其中一份依次加入0.5 mL 21.9%的乙酸鋅溶液,0.5 mL 106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液,1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑;另一份依次加入1.0 mL蒸餾水,1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑,兩份溶液均用蒸餾水定容至10 mL,然后在60 ℃水浴中加熱20 min,取出后在流水中快速冷卻,在離心機上8000 r/min離心5 min,取少許溶液過0.22 μm混合相濾膜,液相色譜檢測。重復(fù)3次。

1.2.4顏色干擾實驗和衍生物顯色穩(wěn)定性實驗通過將少量莧菜紅、肼黃、靛藍(lán)三種顏色分別加入2.28 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品中和白蘿卜樣品中,測定其峰面積變化,確定果蔬樣品顏色對甲醛檢測過程是否產(chǎn)生干擾。

準(zhǔn)確移取50、200、500 μL 114 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑,用蒸餾水定容至10 mL,置于60 ℃水浴中衍生20 min,取出后在流水中快速冷卻,取少許溶液過0.22 μm混合相濾膜,然后分別放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h,液相色譜法測定每個時間點時溶液的峰面積,確定甲醛-PFBHA衍生物的顯色穩(wěn)定時間。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確移取0、20、50、100、200、500 μL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑,用蒸餾水定容至10 mL,70 ℃水浴衍生30 min,取出后流水中快速冷卻,然后加入0.5 mL乙酸鋅溶液,0.5 mL亞鐵氰化鉀溶液,攪拌均勻,8000 r/min離心5 min,過0.22 μm濾頭,液相色譜測定。重復(fù)測定3次。

樣品中甲醛含量M=(C×50×1000)/(m×1000)

式中:M為樣品中甲醛的殘留量(mg/kg);C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的樣液中甲醛的濃度(mg/L);m為稱取試樣質(zhì)量(g);50為提取液最終定容體積(mL)。

1.2.6方法的回收率和精密度實驗將實驗原料中7種樣品打碎,每種樣品分別精確稱取4份,每份10.00 g,置于100 mL具塞離心管中,每種樣品中甲醛的添加水平分別為0、1.14、8.55、17.10 mg/kg,然后按照實驗所得檢測方法測定甲醛含量。重復(fù)6次。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Origin(Version 8.6)進(jìn)行作圖,采用SPSS(Version 17.0)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異,p<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的確定

由圖1可知PFBHA衍生液相色譜法檢測的最佳波長為210 nm。通過實驗發(fā)現(xiàn)流動相比例乙腈∶水=70∶30,柱溫40 ℃時,所得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的分離效果最佳,如圖2所示,衍生物色譜峰和其他峰能完全分離,完成一個樣品的分析耗時7 min,甲醛衍生物保留時間在5.3 min。因此高效液相色譜法色譜條件為:流速:1.0 mL/min;流動相:乙腈∶水=70∶30;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測器:二極管列陣檢測器,檢測波長:210 nm;色譜柱為C18柱。

圖1　PFBHA-甲醛衍生物全波長掃描圖Fig.1　Full wavelength scans of PFBHA-formaldehyde derivatives

圖2　甲醛標(biāo)準(zhǔn)品(A)和白菜樣品(B)的HPLC圖Fig.2　HPLC profile of formaldehyde standards(A)and cabbage sample(B)

2.2衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實驗結(jié)果

由表3分析可得,影響衍生反應(yīng)條件的因素主次順序為:衍生劑加入量>水浴溫度>水浴時間。綜合各因素,最優(yōu)的衍生反應(yīng)條件為:A3B2C2,即水浴溫度為70 ℃,衍生劑加入量為1.0 mL,水浴時間為30 min,在該最佳衍生反應(yīng)條件下進(jìn)行驗證實驗,重復(fù)3次,測得平均峰面積為486.1±3.1。

表3　衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實驗結(jié)果L9(34)

2.3乙酸鋅和亞鐵氰化鉀用量的選擇

所得結(jié)果如圖3所示,隨著乙酸鋅和亞鐵氰化鉀加入量的增多,溶液的吸光值不斷降低,說明溶液的澄清度不斷升高。當(dāng)兩者混合加入量達(dá)到5 mL后,溶液的吸光值隨加入量增加趨于穩(wěn)定,且加入5 mL乙酸鋅和亞鐵氰化鉀(1∶1)混合溶液時吸光值比單一加入乙酸鋅或者單一加入亞鐵氰化鉀更低,說明溶液更加澄清透明,此時對測定結(jié)果影響更小,所以選擇加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀(1∶1)溶液5 mL為較適宜加入量。

圖3　乙酸鋅和亞鐵氰化鉀加入量對澄清度的影響Fig.3　Effect of the amount of Zinc acetateand Potassium hexacyanoferrate on the clarity of the solution

2.4超聲波提取條件的確定

由表4分析可得,影響超聲波提取條件的因素主次順序為:超聲波功率>提取時間>提取溫度。綜合各因素,最優(yōu)的超聲波提取條件為:A2B2C2,即提取溫度60 ℃,超聲波功率80 W,提取時間30 min,在該最佳超聲波提取條件下補充驗證實驗,重復(fù)3次,提取出的甲醛平均含量為2.40±0.53 mg/kg。

表6　不同顏色對甲醛-PFBHA衍生液相色譜法檢測結(jié)果的影響

表4　超聲波提取條件的正交優(yōu)化實驗結(jié)果L9(34)

2.5乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對甲醛-PFBHA衍生物的影響

由表5可知,加與不加乙酸鋅和亞鐵氰化鉀在三種濃度下測得的甲醛-PFBHA衍生物峰面積無顯著差異(p>0.05),說明加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對甲醛-PFBHA衍生物沒有影響,乙酸鋅和亞鐵氰化鉀可以作為PFBHA衍生液相色譜法前處理過程中的有效澄清劑。

因此改進(jìn)后的樣品處理方法為:準(zhǔn)確稱取經(jīng)打碎的樣品10.00 g,置于100 mL具塞離心管中,依次加入5.0 mL PFBHA衍生劑,35 mL蒸餾水。在超聲波功率80 W,溫度60 ℃條件下超聲提取30 min,然后依次加入2.5 mL乙酸鋅溶液,2.5 mL亞鐵氰化鉀溶液,在離心機上8000 r/min離心5 min,將上清液移入50 mL容量瓶中,再用少量蒸餾水(約5 mL)清洗殘渣1次,在離心機上8000 r/min離心5 min,合并上清液并用蒸餾水定容至50 mL,即為樣品待測液。

表5　乙酸鋅和亞鐵氰化鉀

注:每一行中相同字母表示衍生物色譜峰平均面積無顯著差異(p>0.05),表6同。

2.6顏色干擾實驗

由表6可知,經(jīng)過添加莧菜紅、肼黃和靛藍(lán)三種顏色,甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液和白蘿卜樣品溶液中測得的衍生物峰面積與未加色素測得的衍生物峰面積均無顯著差異(p>0.05),說明顏色對衍生物的生成量沒有影響,即果蔬樣品的顏色對檢測結(jié)果無影響,所以鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽衍生液相色譜法前處理過程中不需要進(jìn)行脫色處理。

2.7衍生物穩(wěn)定性實驗

所得結(jié)果如圖4所示,鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽-甲醛衍生物在放置6 h后,峰面積有減少的趨勢,隨著放置時間延長,峰面積逐漸減少,可能是因為衍生物在放置6 h后開始慢慢分解,所以處理完的樣品應(yīng)盡量在6 h以內(nèi)檢測,以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4　衍生物穩(wěn)定性隨時間變化曲線Fig.4　The curve of derivatives stability changed with time

2.8標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法的線性范圍及檢出限

按上述步驟處理,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=210.37x+6.2804,相關(guān)系數(shù)為0.9997,在0.57～57 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限,該方法的檢出限為0.114 mg/kg。

圖5　甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　Standard curve of formaldehyde

2.9方法的回收率和精密度

由表7可知,當(dāng)樣品中甲醛的添加水平為1.14 mg/kg時,回收率為82.3%～88.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.0%;添加水平為8.55 mg/kg時,回收率為90.5%～94.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～6.1%;添加水平為17.10 mg/kg時,回收率為89.2%～93.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%～7.1%。在三個不同濃度的添加水平下,平均回收率為82.3%～94.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.1%,說明該方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性均為良好。

表7　不同樣品中甲醛的回收率和精密度(n=6)

3　結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽與甲醛的衍生物在水中溶解性較好,且檢測過程中不受樣品顏色干擾,所以可以優(yōu)化前處理步驟,直接用水提取且同時衍生,經(jīng)乙酸鋅和亞鐵氰化鉀純化處理后液相色譜檢測,操作簡便,準(zhǔn)確度高。鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽與甲醛衍生反應(yīng)的最佳條件為水浴溫度70 ℃,衍生劑加入量1.0 mL,反應(yīng)30 min,生成的衍生物最佳吸收波長為210 nm。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=210.37x+6.2804,相關(guān)系數(shù)為0.9997,在0.57～57 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限0.114 mg/kg,能有效檢測出甲醛含量較低的樣品中甲醛含量。當(dāng)甲醛添加水平分別為1.14、8.55、17.1 mg/kg時,平均回收率為82.3%～94.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.1%(n=6),方法的回收率和準(zhǔn)確度都較高。本方法完成一個果蔬樣品的檢測只需47 min,可以用于果蔬中甲醛含量的快速定量檢測。

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Determination of formaldehyde in fruits and vegetables by HPLC derived with o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride

LI Jun,WANG Hui,LIU Hui,CHEN Zhong-ai,LIU Jia,CHEN Zhao-jun,TANG Jian-bo,LV Du,LIU Yong-xiang*

(Biological Technology Institute of Guizhou Province,Guiyang 550006,China)

A high performance liquid chromatography method was used to determine formaldehyde in fruits and vegetables by o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride derived with formaldehyde,Samples was directly extracted and derived at a temperature of 70 ℃ under the conditions of ultrasonic 30 min,then monitored by liquid chromatography after centrifugation and purified and quantified using the external standard method. The detection was performed on a XDB-C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)in an isocratic elution mode using a mobile phase consisting of acetonitrile and water(70∶30,v/v)at a flow rate of 1.0 mL/min,the column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was 210 nm. The results showed that the quantification limit of the method was 0.114 mg/kg,with a good linear relationship between 0.57～57 mg/kg. The average recovery rate were 82.3%～94.1%,with RSD of 4.0%～8.1%(n=6). The method was simple,stability,low detection limits and suitable for the determination formaldehyde in fruits and vegetables.

formaldehyde;HPLC;o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride;derivatives

2015-11-23

李俊(1990-)，男，碩士，研究實習(xí)員，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)，E-mail:lijunsjs2015@163.com。

劉永翔(1978-)，女，博士，研究員，研究方向：食品化學(xué)，E-mail:kittyliu0211@163.com。

TS255.7

B

1002-0306(2016)11-0305-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.054