響應面法優化酶解鳶烏賊制備抗氧化肽的工藝研究

楊賢慶,吳　靜,2,胡　曉,李來好,吳燕燕,林婉玲,黃　卉,裘超穎,馬海霞

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海201306)

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響應面法優化酶解鳶烏賊制備抗氧化肽的工藝研究

楊賢慶1,吳靜1,2,胡曉1,李來好1,吳燕燕1,林婉玲1,黃卉1,裘超穎1,馬海霞1

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海201306)

利用響應面分析法對酶法水解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的工藝條件進行優化。首先通過單因素實驗最終確定木瓜蛋白酶為水解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的最佳用酶,然后在單因素的基礎上以加酶量、液料比、酶解時間為自變量,DPPH自由基清除率為響應值,建立二次回歸設計模型,經修正后得到最佳酶解條件為:加酶量為0.66%(w/w),液料比為10.2(v/w),酶解時間為380 min,在此條件下DPPH自由基清除率為89.80%,與模型預測值相吻合。另外,氨基酸分析表明與鳶烏賊蛋白相比,優化后的酶解產物中必需氨基酸含量提高至原蛋白的2.2倍,蛋氨酸、色氨酸等抗氧化性氨基酸分別提高至7.2、25.6倍。

鳶烏賊,酶解,響應面法,抗氧化肽,氨基酸

鳶烏賊屬柔魚科鳶烏賊屬,廣泛分布在印度洋、太平洋的赤道和亞熱帶海域中,其中南海和印度洋西北部海域分布數量較大[1]。我國南海鳶烏賊資源豐富,年捕撈量為130～200萬 t[2]。鳶烏賊作為一種高蛋白低脂肪的海產品,由于肉質較硬,不合大眾口味,導致其鮮銷量較少[3-4]。近年來捕獲的鳶烏賊主要制成魷魚絲外銷,資源利用率較低,經濟價值未被充分挖掘[5]。因此,將鳶烏賊水解,并將其制備成抗氧化活性肽應用于食品、化妝品等領域,可提高鳶烏賊的經濟價值,開辟鳶烏賊蛋白新的利用途徑。

目前在功能性肽的制備方法上,酶解法與溶劑提取法、合成法等相比,酶解法因具有反應條件溫和、不產生有毒副產物、無消旋與氨基酸破壞現象、無污染、生產成本低等諸多優點而備受人們青睞[6-7]。本研究以鳶烏賊為原料,探討了不同蛋白酶、加酶量、液料比和酶解時間對酶解工藝的影響,應用響應面分析法優化酶解制備鳶烏賊抗氧化肽的工藝,并分析了鳶烏賊蛋白和優化后的酶解產物中氨基酸組成及比例,旨在為酶解鳶烏賊蛋白制備功能性肽提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鳶烏賊中國水產科學研究院南海水產研究所漁船捕撈;胰蛋白酶(≥250 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)、中性蛋白酶(≥100 U/mg)、復合蛋白酶(≥120 U/mg)廣州市齊云生物科技公司;Alcalase 2.4L蛋白酶(21萬AU/g)丹麥諾維信公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國sigma公司;其他試劑均為國產分析純。

榨汁機德國博朗公司;電子天平德國Sartorius公司;DS-1高速組織搗碎機上海標本模型廠;Delta320精密pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-S24型恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器廠有限公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器精達儀器制造有限公司;Kjeltel2300凱氏定氮儀丹麥FOSS儀器有限公司;3K30型高速冷凍離心機德國Sigma公司;ALPHA1-4冷凍干燥機德國Christ公司;Akku-drive電位滴定儀德國赫施曼公司;日立L-8900全自動氨基酸分析儀日本;Synergy H1型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理將鳶烏賊去頭、內臟、裙邊和皮,洗凈、瀝干后絞碎,于-20 ℃冰箱中貯存待用。

1.2.2單酶的篩選分別采用胰蛋白酶、Alcalase 2.4 L蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶在其最適pH和溫度下,以液料比為8(v/w),加酶量為0.5%(w/w)的條件下酶解4 h,酶解完成后將酶解液置于100 ℃沸水浴中滅酶10 min,冷卻、離心后過濾,收集濾液冷凍干燥后,測定其抗氧化活性、水解度以及其氨基酸組成分析。酶解條件見表1。

1.2.3單因素實驗對篩選的酶類主要考察加酶量、液料比、酶解時間對鳶烏賊蛋白酶解工藝的影響。

表1　不同蛋白酶酶解實驗條件

1.2.3.1液料比對酶解工藝的影響在蛋白酶的最適pH和溫度下,以液料比(v/w)分別為6、8、10、12、14,加酶量為0.5%的條件下酶解4 h,然后將酶解液置于100 ℃沸水浴中滅酶10 min,冷卻、離心后過濾,收集濾液冷凍干燥后,測定其DPPH自由基清除率。

1.2.3.2加酶量對酶解工藝的影響在蛋白酶的最適pH和溫度下,以加酶量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,液料比(v/w)為8的條件下酶解4 h,其他處理條件同1.2.3.1,測定其DPPH自由基清除率。

1.2.3.3酶解時間對酶解工藝的影響在蛋白酶的最適pH和溫度下,以酶解時間分別為2、4、6、8、10 h,液料比(v/w)為8,加酶量為0.5%的條件下進行酶解,其他處理條件同1.2.3.1,測定其DPPH自由基清除率。

1.2.4響應面實驗設計根據單因素的實驗結果,選擇液料比、加酶量、酶解時間3個因素作為響應變量,分別記為A、B、C,以DPPH自由基清除率為響應值,應用Box-Behnken中心組合進行三因素三水平的實驗設計,采用Design-Expert8.0.6軟件進行統計分析。實驗因素及水平見表2。

表2　響應面分析因素水平表

1.2.5氨基酸組成分析參照國標GB/T 5009.124-2003。

1.2.6抗氧化活性的測定

1.2.6.1DPPH自由基清除率的測定參照Aewsiri[8]等人方法稍做修改,將樣品濃度配成10 mg/mL,實驗組取0.5 mL樣液,加入0.5 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液(用95%的乙醇溶解),對照組為0.5 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液,空白組為0.5 mL DPPH溶液加上0.5 mL 95%的乙醇溶液,混勻后在室溫條件下避光反應30 min,于517 nm波長處測定吸光度,按公式(1)計算DPPH自由基清除率。

表3　不同蛋白酶的酶解產物的抗氧化活性及水解度

注：同列標有不同小寫字母表示同一指標下不同蛋白酶的酶解產物間有顯著性差異(p<0.05),標有相同字母表示同一指標下不同蛋白酶的酶解產物間無顯著性差異(p>0.05)。>

式(1)

式中:A0為空白組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為對照組吸光度。

1.2.6.2·OH清除率的測定參照馬賽蕊、王晶[9-10]等人的方法并稍做修改,取0.3mL5mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液加0.2mLpH6.6的磷酸鹽緩沖液和0.3mL0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液,樣品管Ai加入1mL濃度為10mg/mL樣液和0.2mL0.1%H2O2,損傷管Aj加入1mL蒸餾水和0.2mL0.1%H2O2,未損傷管Ao加入1.2mL蒸餾水,在37 ℃條件下水浴60min,然后在536nm波長處測定樣品管、損傷管、未損傷管的吸光度Ai、Aj、Ao。按公式(2)計算·OH清除率。

式(2)

1.2.6.3還原力的測定參照Naourez Ktari[11]等人的方法稍做修改,取1 mL濃度10 mg/mL樣液加入1 mL pH7.4磷酸緩沖鹽溶液和1 mL 1%鐵氰化鉀混勻后50 ℃水浴20 min,再加1 mL 10%三氯乙酸后離心(10000 r/min,10 min,4 ℃),取1 mL上清液,加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵后50 ℃水浴10 min,在波長為700 nm處測定其吸光度,記錄吸光值。

1.2.7水解度測定原料中總氮含量采用半微量凱氏定氮法,酶解液中氨基酸態氮含量采用甲醛電位滴定法測定[12]。

2　結果與分析

2.1單酶的篩選

2.1.1不同蛋白酶的酶解產物的抗氧化活性及水解度由表3可知,不同蛋白酶對鳶烏賊蛋白酶解的效果存在顯著性的差異(p<0.05),就水解度而言,復合蛋白酶的酶解效果最好,水解度達到21.35%±0.46%。其次是Alcaese2.4L蛋白酶和中性蛋白酶,水解效果較差的是胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,分別為10.84%±0.49%和7.88%±0.35%。就抗氧化活性活性而言,木瓜蛋白酶的DPPH自由基清除率、·OH清除率、還原力都是最高的,其次是中性蛋白酶和復合蛋白酶,酶解液抗氧化活性較低的是胰蛋白酶和Alcaese2.4L蛋白酶。復合蛋白酶和Alcaese2.4L蛋白酶屬微生物蛋白酶,前者具有內切和外切蛋白酶的特性,后者是一種非特異性蛋白質肽鍵內切酶;而胰蛋白酶是一種動物來源的蛋白酶,對變性蛋白的水解效果較好;木瓜蛋白酶是一種含巰基肽鏈的植物蛋白酶,水解特異性較低[13-14]。不同酶的酶切位點的專一性和酶自身的特異性會導致酶解產物中肽段分子量的大小以及氨基酸的組成和序列,最終導致酶解產物的抗氧化活性大小不同。

2.1.2不同蛋白酶酶解液氨基酸組成分析由表4可知酶解產物中含有17種氨基酸,五種不同蛋白酶酶解產物中苯丙氨酸、賴氨酸含量都較高,與其他氨基酸含量存在極顯著的差異性(p<0.01),除木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解產物外,亮氨酸含量也較高,都占總氨基酸的10%以上。酶解產物中疏水性氨基酸含量最高的是木瓜蛋白酶酶解產物,達到73.66%,其次是中性蛋白酶酶解產物,含量最低的是胰蛋白酶酶解產物,其含量僅為 46.65%。多肽的抗氧化活性的強弱與氨基酸的種類、組成、疏水性以及其在肽鏈中的位置有關[15]。芳香性氨基酸能作為質子供體而清除自由基,組氨酸上的咪唑環具有螯合金屬離子、捕獲自由基的能力,含疏水性氨基酸的多肽能抑制脂質中氫的釋放或與氧結合,起到抗氧化作用,其含量與抗氧化能力呈正相關性[16]。此外,必需氨基酸含量比較高的是木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解產物,因此其營養價值比較高。在制備抗氧化肽時,應選擇水解度高,抗氧化活性強的蛋白酶進行酶解,結合表3、表4可知中性蛋白酶水解度較高,且必需氨基酸含量較高,木瓜蛋白酶的酶解產物抗氧化活性最高,因此選擇中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行后續的單因素實驗。

表4　不同蛋白酶酶解液氨基酸的組成及比例

2.2酶解制備抗氧化肽的單因素實驗

2.2.1液料比對酶解工藝的影響由圖1可知,木瓜蛋白酶的DPPH自由基清除率呈現先升高后降低的趨勢,而中性蛋白酶在液料比為6時DPPH自由基清除率就達到了最大,這說明了不同的酶對底物濃度的要求不一樣。液料比越大,底物濃度越小,底物與酶的結合位點越少,反應速度越慢;但液料比太小時,反應速度也會較慢,這是因為液料比太小時,溶液較為粘稠,流動性較差,影響酶與底物的結合[17]。

圖1　不同液料比的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.1　Effect of liquid-material ratio on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.2加酶量對酶解工藝的影響由圖2可知,兩種酶的DPPH自由基清除率隨加酶量的增加都呈現出先上升后降低的趨勢,且在加酶量0.7%時達到最大值。這可能是因為當底物濃度一定時,不同的加酶量會影響體系反應速率,當加酶量較少時,與底物結合的酶分子較少,反應速度較慢,當加酶量逐漸增加時,與底物結合的酶分子也越來越多,反應速度會加快,當加酶量達到一定值時,酶與底物基本飽和,過多的酶反而會影響體系反應速度[18]。

圖2　不同加酶量的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.2　Effect of enzyme amount on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.3酶解時間對酶解工藝的影響由圖3可知,隨著酶解時間的延長,DPPH自由基清除率先升高后降低,在6 h左右達到最大。酶解時間太短,酶與底物作用不夠充分,所得到的產物中大分子的肽較多,具有抗氧化活性的殘基未能暴露出來,抗氧化活性較弱;酶解時間太長,會導致水解過度,產物多為游離氨基酸,抗氧化活性也較弱[19]。

圖3　不同酶解時間的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.3　Effect of enzymolysis time on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

由圖1、圖3可知木瓜蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率在同一液料比和酶解時間下都比中性蛋白酶要高,且最大值也高于中性蛋白酶。雖然加酶量在0.1%～0.5%之間時,中性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率要高于木瓜蛋白酶,但隨著加酶量的增加,木瓜蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率又高于中性蛋白酶。在制備抗氧化肽的過程中主要選擇酶解物抗氧化活性較高的酶,因此綜合考慮來看選擇木瓜蛋白酶來酶解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽進行后續實驗。

表6　回歸方程的方差分析

注:表中*代表顯著,p<0.05;**代表極顯著,p<0.01。

2.3酶解制備抗氧化肽響應面的優化工藝

2.3.1響應面實驗設計及結果在單因素的基礎上,以DPPH自由基清除率為響應值,運用Design Expert 8.0.6軟件編碼單位對實驗進行了三因素三水平的響應設計見表5,實驗共有17組,其中包含12個析因點和五個零點,這五個零點實驗做為誤差估計。

表5　響應面實驗設計與結果

2.3.2回歸方程的建立與方差分析根據實驗結果以DPPH自由基清除率為響應值利用軟件對表5進行分析,得到的二次多元回歸擬合方程如下:

DPPH自由基清除率(%)=90.56+0.85A-1.46B+0.75C+1.65AB-0.9AC+0.75BC-1.91A2-3.27B2-1.39C2

由表6可見,一次項B、二次項A2、B2對DPPH自由基清除率影響極顯著(p<0.01),A、AB、C2項對DPPH自由基清除率也有顯著影響(p<0.05),其余項不顯著,這表明實驗因素對DPPH自由基清除率的影響不是線性關系,而是存在一定的交互作用。從各因子、二次、交互作用綜合來看,三個因素對DPPH清除率的影響依次為B>A>C。

2.3.3響應曲面結果分析從圖中等高線可以看出,圖4等高線基本呈現為橢圓,表明AB的交互作用影響較大,另外三維曲面圖也可以很直觀地反映兩個因素之間的交互作用。由圖4可以看出固定加酶量,改變液料比,呈現平滑的弧線,而固定液料比,改變加酶量,曲線較為陡峭。曲線越陡,表明該因素對響應值的影響越大,曲線越平滑,表明該因素對響應值的影響越小,因此加酶量對DPPH自由基清除率的影響比料液比大,這與模型分析結果相吻合。由圖5可以看出固定酶解時間,改變加酶量時,DPPH自由基清除率在加酶量較低時變化較為平緩,當逐漸增大加酶量0.7%～0.9%時呈現出滑低現象,可能是酶和底物已經達到了相對飽和的狀態,過多的蛋白酶可能會影響酶解反應速度,而時間的變化對響應值的影響并不大。由圖6可以看出,與圖4、圖5相比,液料比和時間對DPPH自由基清除率的影響要小于加酶量對其的影響,該結論與表6回歸方程的方差分析結果相一致。

圖4　加酶量和液料比對響應值的影響Fig.4　Effect of enzyme amountand liquid-material ratio on response value

圖5　加酶量和酶解時間對響應值影響Fig.5　Effect of enzyme amountand enzymolysis time on response value

圖6　液料比和酶解時間對響應值影響Fig.6　Effect of liquid-material ratioand enzymolysis time on response value

2.3.4模型驗證實驗通過響應面優化得到的木瓜蛋白酶水解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的最優水解條件為液料比10.21(v/w),加酶量0.66%,時間382.8 min,此時預測的響應值為90.81%。將酶解條件修正為液料比10.2(v/w),加酶量0.66%,酶解時間380 min,在此條件下所得實際DPPH自由基清除率為89.80%,與理論值相比相對誤差在0.71%,說明采用響應面法優化酶解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的工藝是準確可靠的。

2.4氨基酸組成分析

鳶烏賊蛋白和優化后酶解產物中氨基酸組成及比例如表7所示,鳶烏賊蛋白中谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸所占比例較高,但經木瓜蛋白酶酶解的產物中這幾種氨基酸的含量發生了顯著性變化,且苯丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸所占比例較高。優化后的酶解產物中必需氨基酸含量高于鳶烏賊蛋白,這說明了酶解產物也具有一定的營養價值,該結論與劉賀[20]等人對扁杏仁水解蛋白的抗氧化活性及分子組成特性研究相一致。另外,優化后酶解產物中疏水性氨基酸含量是鳶烏賊蛋白的1.8倍左右,必需氨基酸是原來的2.2倍，蛋氨酸、色氨酸等抗氧化性氨基酸所占比例大幅度提高，分別提高至原來的7.2、25.6倍。

表7　氨基酸的組成及比例

3　結論

本研究比較了五種不同蛋白酶在同一條件下的酶解,實驗結果表明中性蛋白酶水解度最高,木瓜蛋白酶的酶解產物抗氧化活性最高。單因素實驗結果表明經木瓜蛋白酶水解后的產物在不同的液料比、酶解時間條件下抗氧化活性都高于中性蛋白酶。響應面實驗得到木瓜蛋白酶酶解鳶烏賊制備抗氧化肽的最佳工藝條件是液料比10.20(v/w),加酶量0.66%,酶解時間380 min,驗證結果表明該模型與實際擬合程度較好,具有很好的預測能力。同時氨基酸分析結果表明在此條件下酶解產物具有較高的營養價值,與鳶烏賊蛋白相比,優化后的酶解產物中必需氨基酸含量提高至原來的2.2倍,蛋氨酸、色氨酸等抗氧化性氨基酸含量分別提高至原來的7.2、25.6倍。

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Optimization of enzymatic preparation of antioxidant peptides from purpleback flying squid(sthenoeuthisoualaniensis)protein by response surface methodology

YANG Xian-qing1,WU Jing1,2,HU Xiao1,LI Lai-hao1,WU Yan-yan1,LIN Wan-ling1,HUANG Hui1,QIU Chao-ying1,MA Hai-xia1

(1.Key Lab of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing;South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Guangzhou 510300,China;2. College of Food Science and Engineering,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Response surface methods were used to optimize the hydrolysis conditions of purpleback flying squid(Sthenoeuthisoualaniensis)for production of antioxidant peptides. Papain was the optimum enzyme selected by the single-factor tests. Based on the single-factor tests,enzyme amount,liquid-material ratio and hydrolysis time were determined by single-factor tests as independent variables,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging activity as the response value. The model of quadratic regression design was established. The hydrolysis conditions were adjusted to that enzyme amount was 0.66%(w/w),liquid-material ratio was 10.2(v/w),hydrolysis time was 380 min. Under such conditions,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging activity was 89.80%. The result was consistent with the model prediction. In addition,amino acid analysis showed that compared with purpleback flying squid protein,the content of essential amino acids of enzymatic hydrolysis product was increased to 2.2 times,antioxidative amino acids such as methionine and tryptophan was increased to 7.2,25.6 times,respectively.

purpleback flying squid;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;antioxidant peptides;amino acid

2015-11-16

楊賢慶(1963-),男,本科,研究員,從事水產品加工及貯藏研究,E-mail:yxqgd@163.com。

農業部財政重大專項(NFZX2013);國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-49);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD28B06);國家自然科學基金青年科學基金項目(31301454);廣東省海洋漁業科技與產業發展專項(A201401C02);廣東省科技計劃項目(2013B021100013);中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(2012TS03)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)11-0242-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.041