山參磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶cDNA克隆及序列分析

馮　凱,李　勝,2,麻　銳,姜　銳,孫立偉,陳　偉，*

(1.吉林省中藥科技創新中心,北華大學化學與生物學院,吉林吉林 132013；2.東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040)

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山參磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶cDNA克隆及序列分析

馮凱1,李勝1,2,麻銳1,姜銳1,孫立偉1,陳偉1，*

(1.吉林省中藥科技創新中心,北華大學化學與生物學院,吉林吉林 132013；2.東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040)

磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)具有明顯的抗氧化活性,避免細胞膜受到過氧化損傷。本研究利用RACE技術,克隆出山參phgpx基因全長cDNA。序列分析表明:該克隆片段全長490 bp,編碼162個氨基酸,有3個真核生物PHGPx特有的保守亞結構域。該片段編碼的蛋白為跨膜親水性穩定蛋白質,與柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分別為76%和75%。同時建立了9種植物的系統進化樹。

磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶,基因克隆,山參

人參(PanaxginsengC.A. Mey)是草本藥食同源植物,《神農本草經》中記載著其藥用精髓:“主補五臟,除邪氣,久服,輕身延年”。現代學者用先進的技術手段考察驗證并確認其記載的人參藥效正確,人參確有降血糖[1]、抗疲勞[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、提高免疫力[6],提高認知力[7]和調節血脂異常[8]等多種藥用功效。

目前廣泛認為造成人體衰老的最主要原因之一是活性氧累積所造成的過氧化損傷[9]。人參有延年益壽的功效,因其含較高的抗氧化、抗衰老等活性成分[10]。山參又稱野山參,與栽培人參屬同種,山參生長年限長,生長環境較為苛刻,但積累SOD等成分多于園參,這些研究顯示山參在抗氧化等方面遠高于園參[11-13]。

磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase,簡稱PHGPx)是谷胱甘肽過氧化物酶家族(GPX)中的一類較小的單亞基球狀蛋白[14],也是體內唯一一種能夠減少細胞膜氧化損傷的過氧化物酶[15-16]。PHGPX是最初從鼠和豬中分離純化出的一種“過氧化作用抑制蛋白”[17],對植物phgpx基因的研究首次出現在柑橘中[18],目前僅在煙草[19],苦瓜[20],蘿卜[21]等植物中有該基因的研究報道。人參是傳統中藥植物,具有明顯的抗氧化等功效,但目前沒有關于編碼人參抗氧化活性的phgpx基因的研究報道。本文首次使用RACE PCR克隆技術,克隆出山參phgpx基因,通過該基因片段的特性分析,與其他同源植物基因的同源性分析,以期為山參及其它相近植物的基因克隆及抗氧化機制的研究提供參考和依據。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

30年山參,采自于吉林省白山市撫松縣沿江鄉楞場村(北緯42°48′1″東經127°46′18″)。經長春中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定,其為五加科植物人參,符合《2010版中華人民共和國藥典》(一部)的規定。pGM-T Tiangen產品;大腸桿菌菌種(Escherichiacoli)DH5α本實驗室保存菌種;3′-Full RACE Core Sets with PrimeScriptTM RTase試劑盒,5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒,凝膠回收試劑盒,質粒提取試劑盒TaKaRa產品;DNA marker DL2000Promega產品;氨芐青霉素、IPTG和X-gal主要生化與分子生物學試劑寶泰克產品。DNA測序由上海生工公司完成。

1.2實驗方法

1.2.1山參cDNA第一片段的合成山參總RNA提取方法參照林燕玲改進的Trizol方法進行[22]。以山參總RNA為模版,進行cDNA的反轉錄擴增。反轉錄程序為:30 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min。根據已報道的基因保守序列設計兼并引物A:5′-tcaag/atggaacttt/ctccaagtt-3′、引物B:5′-atccttctca/gatgctc/aagagg-3′。以反轉錄獲得的cDNA為模版,用引物A、B擴增目的基因第一片段。PCR產物經回收后連接在pGM-T載體上轉化大腸桿菌,在含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養基中進行藍白斑篩選,挑取白斑培養,提取質粒后送去測序。

1.2.2目的基因的3′RACE克隆據第一片段序列信息,設計3′ RACE outer 引物:5′-acttttccaagtt cctggtgg-3′;inner 引物:5′-agatggcaatgttgtcgatcg-3′,分別與3′-Full RACE試劑盒下游引物配合,以山參總RNA為模板進行3′ RACE的outer PCR和inner PCR程序,程序按照說明書進行,PCR產物回收后經TA克隆后送去測序。

1.2.3目的基因的5′ RACE克隆據第一片段序列信息,設計5′ RACE outer 引物:5′-agcgatcgacaa cattgccatc-3′;inner 引物:5′-accttctcgatgctcagaggagag-3′;以山參總RNA為模板,參照5′-Full RACE說明書進行5′ RACE的outer PCR和inner PCR程序,PCR產物回收后經TA克隆后送去測序。

1.2.4序列拼接和分析使用工具EMBOSS(http://emboss.bioinformatics.nl/)對序列進行人工拼接。用工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/),NCBI CD-Search service(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi),SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和DNAStar7.10(美國DNAstar公司)、DNAMAN5.2(美國Lynnon Biosoft公司)等軟件對序列進行分析,用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

2　結果與分析

2.1山參phgpx基因的PCR擴增

經RACE方法克隆出的山參PHGPx基因經0.8%瓊脂糖凝膠電泳,檢測結果如下,5′RACE回收產物大約50 bp(圖1A),3′RACE回收產物大約460 bp(圖1B)。

圖1　RACE PCR電泳圖 Fig.1　RACE PCR electrophoresis 注:Marker:DL2000,圖A 1:5′RACE產物,圖B 1:3′RACE產物。

目的基因片段同T載體連接、轉化、鑒定后取陽性克隆送去測序。測序結果用在線工具EMBOSS 拼接,拼接得到山參PHGPx(PgPHGPx)基因全長序列為490 bp含有一個起始密碼子ATG和一個終止密碼子TAG,編碼162個氨基酸。

2.2山參PHGPx基因的蛋白特性分析

利用在線工具ProtParam對PgPHGPx氨基酸序列進行理化特性分析,結果表明PgPHGPx的分子量為18.0375 ku,理論等電點為8.56。其中極性氨基酸(Trp、Tur、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Thr、Asp、Gly、Lys、Arg、His)54.3%,蛋白質不穩定指數估算值為28.5,屬于穩定蛋白類。

2.3山參PHGPx基因保守結構域和氨基酸序列分析

利用NCBI CD-Search service工具對PgPHGPx蛋白質的結構域分析表明,其含有谷胱甘肽過氧化物酶GSH-peroxidase結構域和類似硫氧還蛋白類超家族結構,在第41個氨基酸位置具有催化殘基(圖2)。應用DNAMAN5.2進行phgpx基因的氨基酸序列同源性比較,結果表明,不同植物phgpx基因同源性差異較大,山參phgpx基因與柑橘(Citrushybridcultivar,ABL67656.1)、蓖麻(Ricinuscommunis,XP_002509790.1)、菠菜(Spinaciaoleracea,BAA22194)的phgpx基因氨基酸同源性分別為76%、75%、70%,均含有PHGPx特有的3個保守的亞結構域(圖3)。植物物種的不同,其體內的磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶的同源性也會較低(大約50%～80%),這一結果明顯比動物磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶同源性(90%以上)低很多,這或許是在表明植物在進化的過程中,其磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶也出現了相應的功能分化[22]。

圖2　PgPHGPx結構域分析Fig.2　Analysis of PgPHGPx domain

圖3　PgPHGPx與其他植物的PHGPx的氨基酸序列比較Fig.3　Comparison of PHGPx amino acid sequencesbetween PgPHGPx and other plants

用ProtScale程序對PgPHGPx親水性預測表明,PgPHGPx氨基酸親水性殘基所占比例大于疏水性殘基,數值為-11.3(圖4),因此可以推測該酶是親水性的,其疏水性氨基酸主要作用與疏水性底物PLOOH結合,這與前人其他物種的該酶報道一致[14]。

圖4　PgPHGPx親疏水性預測分析Fig.4　PgPHGPx hydrophilicity predictive analysis

二級結構預測由SOPMA來完成。結果表明該蛋白含有16.67%的α-螺旋,29.01%的延伸鏈,13.58%的β-轉角和40.74%的無規則卷曲(圖5)。

圖5　PgPHGPx蛋白序列的二級結構預測Fig.5　Secondary structure prediction of PgPHGPx protein sequence

2.4山參PHGPx系統進化樹分析

將PgPHGPx與其他植物的磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶進行氨基酸水平的聚類分析(圖6)。系統進化樹除山參外還包括柑橘(Citrushybridcultivar,ABL67656.1)、楊樹(Populustrichocarpa,XP-002299536)、蓖麻(Ricinuscommuris,XP-002509790)、菠菜(Spinaciaoleracea,BAA22194)、水稻(Oryzasativa,NP-001057006)、大豆(Glycinemax,ACU14410.1)、大黃(Rheumaustrale,ACH63236.1)、高粱(Sorghumbicolor,XP-002436614)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP-194915.2)等9種植物。系統進化樹分析表明,山參磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶與大戟科植物蓖麻的磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(XP-002509790)同源性較近,說明它們具有類似的結構和功能,這與前人報道也一致[14]。

圖6　山參PgPHGPx與其他植物PHGPx的進化Fig.6　Evolutionary of PgPHGPx and other plants PHGPx

3　結論

山參磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶含有真核生物磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶所特有的3個亞結構域,是穩定蛋白,其親水性殘基所占比例遠大于疏水性殘基,因此可以推測該酶是親水性的。這些數據為山參磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶對抗氧化作用的強弱分析提供了依據,豐富了山參相關活性酶對損傷細胞的修復、免疫調節等方面的基因庫。通過氨基酸序列建構系統進化樹,顯示山參與其他植物的同源關系,這些數據為以后其他植物phgpx基因克隆提供了理論依據。

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Cloning and sequence analysis of wild ginseng phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase cDNA

FENG Kai1,LI Sheng1,2,MA Rui1,JIANG Rui1,SUN Li-wei1,CHEN Wei1,*

(1.Science and Technology Innovation Center of Jilin Traditional Chinese Medicine,College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013,China;2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Northeast Forestry University,Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field(SAVER),Ministry of Education,Harbin 150040,China;)

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx)has significant antioxidant activity,avoiding the harm by peroxidation in the cell membrane. To clone the full-length cDNA encodingPHGPxgene from Panax ginseng,the RACE technology was used in this study. The sequence analysis showed that:the full length of the cloned fragment was 490 bp. It encoded 162 amino acids and contained 3 sub-conservative domains which were specific in eukaryonic phospholipid hydroperodixe glutathione peroxidase. The encoding protein was a stable non-transmembrane hudrophilic protein. The sequence of amino acids was similar with PHGPx of citrus and castor,homologous rates of amino acids were 76% and 75%. And then,the phylogenetic tree of nine plants was constructed.

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase;gene clone;Panax ginseng

2015-11-05

馮凱(1976-),男,碩士,講師,研究方向:植物分子生物學,E-mail:fengk544@163.com。

陳偉(1983-),女,博士,講師,研究方向:植物分子生物學,E-mail:chenw352@126.com。

吉林省科技發展計劃項目(201201144)；吉林省人參轉化關鍵技術研究與應用創新團隊(20140519016JH)；吉林省中藥生物技術科技創新中心(20130604039TC)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0152-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.023