酶法制備黑莓果膠寡糖及其抗氧化活性研究

丁　鵬,沈照鵬,張京良,李國霞,萬國韶,江曉路,3,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003;3.青島海洋生物醫藥研究院,山東青島 266071;4.青島金鳳凰莊園果品有限公司,山東青島 266213)

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酶法制備黑莓果膠寡糖及其抗氧化活性研究

丁鵬1,沈照鵬2,3,張京良2,3,李國霞1,萬國韶4,江曉路1,3,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003;3.青島海洋生物醫藥研究院,山東青島 266071;4.青島金鳳凰莊園果品有限公司,山東青島 266213)

對黑莓果膠寡糖進行抗氧化活性研究,探究其自由基清除能力。對黑莓果膠進行提取,并利用果膠酶對其進行酶解,通過分級醇沉制得黑莓果膠寡糖。以DPPH、ABTS、羥自由基清除能力驗證不同黑莓果膠寡糖體外抗氧化活性。結果表明,4倍醇沉寡糖對DPPH、ABTS自由基的IC50分別為0.59、4.75 mg/mL。10倍醇沉果膠寡糖對這兩種自由基的清除作用更強,IC50分別為0.40、2.79 mg/mL。黑莓果膠寡糖具有顯著的抗氧化活性,對DPPH自由基、ABTS自由基有很強的清除作用,且具有明顯的量效關系。

寡糖,果膠,黑莓,抗氧化活性

黑莓屬于薔薇科懸鉤子屬,是歐美地區廣泛種植的小果類果樹,1994年起開始在國內推廣種植。黑莓含有豐富的氨基酸、維生素、微量元素,尤其硒的含量高達2.07 μg/g,是蘋果的6～8倍,柑橘的12倍[1]。并含有大量的花色苷、黃酮、果膠、SOD等活性成分。

果膠是一類富含半乳糖醛酸的天然高分子化合物,存在于所有的陸生植物中[2]。水果是果膠提取的重要原料,具有工業價值的主要是柑橘皮[3],此外,學者還對蘋果[4]、荔枝[5]、西番蓮[6]等作為果膠提取原料進行了研究。通過酸法或酶法將果膠不完全降解可以得到果膠寡糖。果膠寡糖已被報道具有多種生理活性,如抗氧化活性[7]、抑制腫瘤細胞生長[8],改善腸道菌群[9]等。黑莓是一種新興水果,果膠占干重的5.23%[10],目前未見對其果膠寡糖制備及活性研究的報道。本文以黑莓果膠寡糖為研究對象,初步探究了其在體外的抗氧化活性,以期發現一種功能性食品資源。

表1　不同方法提取黑莓果膠的性質比較

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑莓青島金鳳凰莊園果品有限公司,-18 ℃下保存;果膠酶產果膠酶菌株Aspergillus niger M-8經發酵制得果膠酶制劑[11],酶活力為298 U/mL;DPPH、ABTS sigma公司;無水乙醇、水楊酸等試劑均為分析純。

冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司;L530離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科學儀器有限公司;J722S分光光度計上海精密科學儀器有限公司。

1.2黑莓果膠的提取

果膠的提取采用酸提醇沉法,但由于黑莓本身含有較多的還原糖,所以對酸提法[12]略作改進。取300 g黑莓,解凍后加入600 mL乙醇進行勻漿,勻漿后4000 r/min離心10 min,取沉淀加入到750 mL的0.01 mol/L的鹽酸溶液中,90 ℃振蕩提取100 min,提取完成后,4000 r/min離心10 min,向上清中加入2倍體積的無水乙醇并放置4 h,離心得到沉淀,將沉淀用無水乙醇漂洗兩次,凍干得到黑莓果膠。測定得到果膠得率及其總糖和還原糖含量[13]、糖醛酸含量[14],并與酸提法進行比較。

1.3黑莓果膠寡糖的分級制備

取12 g黑莓果膠溶解到200 mL水中,加熱使果膠完全溶解,冷卻至室溫后,加入果膠酶1.49×104U,35 ℃震蕩酶解12 h。酶解完成后,離心將不溶部分除掉,上清液分別加入2倍、4倍、10倍體積的乙醇進行分級醇沉,將得到的果膠寡糖凍干,分別標記為2倍、4倍、10倍醇沉果膠寡糖,計算得率,測定其總糖、還原糖、糖醛酸含量,采用folin-酚法測定蛋白質含量[15]。

1.4黑莓果膠寡糖抗氧化能力的測定

通過分級醇沉得到的果膠寡糖,凍干后計算得率,將醇沉得率較高的糖配制成一定的濃度梯度,進行抗氧化活性研究。

1.4.1清除DPPH自由基的能力參考文獻[13]，向2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L,甲醇配制)中加入2 mL不同醇沉倍數的樣品,混勻,室溫避光條件下反應30 min,測定517 nm下的吸光值。計算不同濃度果膠寡糖對DPPH自由基的清除作用。

清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

式中,Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品的吸光值,Ai0為2 mL甲醇溶液+2 mL樣品的本底吸光值,A0為2 mL DPPH溶液+2 mL蒸餾水的吸光值。

1.4.2清除ABTS自由基的能力參考文獻[16]的方法,配制7 mmol/L的ABTS溶液10 mL(用0.2 mol pH7.4的PBS配制),向其中加入過硫酸銨使過硫酸銨的終濃度為2.45 mmol/L,室溫黑暗環境下放置16小時,使用前,用pH7.4的PBS緩沖液將其稀釋,使稀釋后的ABTS自由基在734 nm下的吸光值為0.7±0.02。

取5 mL ABTS溶液于試管中,加入100 μL的寡糖溶液,混勻,室溫黑暗環境下放置5 min,測定734 nm下的吸光值。

清除率(%)=(1-Ai/A0)×100

式中,Ai為5 mL ABTS溶液+100 μL寡糖溶液的吸光值,A0為5 mL ABTS溶液+100 μL蒸餾水的吸光值。

1.4.3清除羥自由基的能力向試管中分別加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL,9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL,樣品1 mL,最后加入8 mmol的H2O2溶液1 mL,渦旋混勻后,37 ℃水浴30 min,測定510 nm下的吸光值。

清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

式中,Ai為各樣品吸光值,Ai0為用蒸餾水代替H2O2溶液測得的各樣品的本底吸收,A0為以蒸餾水代替樣品測得的吸光值。

1.5數據統計與分析

所得數據采用Excel和SPSS Statistics進行統計分析。

2　結果與分析

2.1黑莓果膠的提取

黑莓中還原糖的含量非常高,以黑莓為原料提取果膠,需要一種得率高,提得粗果膠還原糖含量少的提取方法。通過醇輔助酸提得到粗果膠,得率為5.61%(以黑莓干重計)。對粗果膠進行成分分析,測得粗果膠中總糖含量為67.70%,糖醛酸含量為47.44%,還原糖含量為22.89%。這種提取方法相較于酸提法得率略有降低,但是得到的粗果膠中總糖含量、糖醛酸含量都有明顯提升,尤其糖醛酸含量提高了10.07%。半乳糖醛酸是果膠的主要組成部分,糖醛酸含量的提高也能在一定程度上表征果膠在粗果膠中含量的提高。提得果膠的品質提高可能是醇輔助勻漿過程中還原糖溶出且兩倍體積的乙醇不足以使其沉淀,所以存在于上清中,離心后去除,使得最終得到的粗果膠中還原糖含量較少,而果膠含量相對提高。

2.2黑莓果膠寡糖的分級制備

計算分級醇沉果膠寡糖得率,2倍醇沉果膠寡糖得率為3.17%,4倍醇沉寡糖得率最高,達到30.67%,10倍醇沉的得率為8.50%。通過比較,發現4倍、10倍醇沉的果膠寡糖中總糖含量較高,糖醛酸含量高達85.34%和83.20%。并且隨著醇沉倍數的增加,還原糖的含量也大大增加。2倍醇沉寡糖中蛋白質雜質最多,這可能是加入的果膠酶被沉淀出來導致的。

相較于黑莓粗果膠,分級醇沉得到的果膠寡糖溶解性能大大提高。果膠溶解時,果膠粉末會與水接觸迅速水合形成塊狀,并在塊狀表面形成高度水化的外殼,溶解極慢。而果膠寡糖極易溶于水,在冷水中稍加攪拌即可溶解。這種溶解性能的提高有利于對果膠寡糖進行進一步的加工利用。

表2　黑莓果膠寡糖性質比較

2.3黑莓果膠寡糖體外抗氧化活性

2.3.1清除DPPH自由基的能力黑莓果膠寡糖對DPPH自由基的清除效果如圖1所示,隨著濃度的增加,對DPPH自由基的清除作用也越來越強。兩種寡糖對DPPH自由基都有十分明顯的清除作用,在較低的濃度下就有較好的清除效果,且10倍醇沉得到的果膠寡糖對DPPH自由基的清除作用強于4倍醇沉果膠寡糖。杜麗娟報道的4種山楂果膠酶解片段在濃度為1 mg/mL時,對DPPH自由基的清除均低于40%[17]。而兩種黑莓果膠寡糖在相同濃度下,DPPH自由基的清除率均在60%以上,這可能是不同來源的果膠,結構和活性基團的差異導致的。

圖1　黑莓果膠寡糖對DPPH自由基的清除作用Fig.1　DPPH scavenging activity of pectic oligosaccharides from blackberry

利用SPSS軟件,進行probit分析計算得到4倍醇沉果膠寡糖的IC50為0.59 mg/mL,而10倍醇沉寡糖的IC50為0.40 mg/mL。IC50的值越低,說明樣品的清除效果越顯著,10倍寡糖具有較低的IC50,即10倍醇沉果膠寡糖對DPPH自由基的清除效果較好。

2.3.2清除ABTS自由基的能力黑莓果膠寡糖對ABTS自由基的清除作用如圖2所示,兩種寡糖都有十分明顯的清除作用,10倍醇沉果膠寡糖的清除效果尤為突出,濃度為8 mg/mL時,對ABTS自由基的清除率就已經達到了99.59%。probit分析計算得到4倍醇沉果膠寡糖的IC50為4.75 mg/mL,10倍醇沉寡糖的IC50為2.79 mg/mL。

圖2　黑莓果膠寡糖對ABTS自由基的清除作用Fig.2　ABTS scavenging activity of pectic oligosaccharides from black berry

分析發現,在一定范圍內,黑莓果膠寡糖對ABTS自由基的清除作用呈現出顯著的量效關系,4倍、10倍醇沉的寡糖濃度與自由基清除率均呈現正比關系。基于這種正比關系,可以在一定濃度范圍內,在已知寡糖濃度的情況下,對清除率進行預測。

2.3.3清除羥自由基的能力果膠寡糖對羥自由基的清除作用如圖3所示,清除效果隨寡糖濃度的增大而增強,但寡糖濃度達到20 mg/mL時,對羥自由基的清除率仍不到50%,所以黑莓果膠寡糖對羥自由基的清除效果不佳。

圖3　果膠寡糖對羥自由基的清除作用Fig.3　Hydroxy free radical scavenging activity of pectic oligosaccharides from black berry

黑莓果膠寡糖具有顯著的抗氧化作用,是一種有效且天然的抗氧化劑,是一種潛在的功能食品資源。隨著黑莓種植的推廣和消費者對黑莓認可度的提高,對黑莓利用開發提出了新的要求,開發黑莓果汁無疑為一條很好的出路。通常果汁加工中添加果膠酶的作用是提高出汁率和澄清度,卻忽略了添加果膠酶后,生成的果膠寡糖對功能性的提高作用,本研究為這一觀點提供了有力的支持。

3　結論

經體外自由基清除實驗證實果膠寡糖具有顯著的抗氧化作用。4倍醇沉寡糖對DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分別為0.59、4.75 mg/mL。10倍醇沉果膠寡糖對這兩種自由基的IC50分別為0.40、2.79 mg/mL。兩種果膠寡糖對自由基都有顯著的清除作用,且10倍醇沉寡糖表現更為突出。目前尚未見對黑莓果膠寡糖制備及其活性的報道,本文對其抗氧化活性進行了初步探究,為黑莓研究開發提供了理論支持。

[1]陸新龍. 黑莓菊花飲料生產工藝[J]. 飲料工業,2002,5(5).

[2]Willats W G T,Knox J P,Mikkelsen J D. Pectin:new insights into an old polymer are starting to gel[J]. Trends in Food Science & Technology,2006,17(3):97-104.

[3]Cho C W,Lee D Y,Kim C W. Concentration and purification of soluble pectin from mandarin peels using crossflow microfiltration system[J]. Carbohydrate Polymers,2003,54(03):21-26.

[4]章凱,黃國林,陳中勝,等. 微波輔助萃取檸檬皮中果膠動力學及熱力學研究[J]. 食品科學,2010,31(15):107-111.

[5]姜翠翠,陳小巧,邱松山,等. Box-Behnken法優化提取荔枝渣中果膠工藝[J]. 食品科學,2014,10:98-102.

[6]Pinheiro E R,Silva I,Gonzaga L V,et al. Optimization of extraction of high-ester pectin from passion fruit peel(Passiflora edulis flavicarpa)with citric acid by using response surface methodology[J]. Bioresource Technology,2008,99(13):5561-5566.

[7]Li T,Li S,Du L,et al. Effects of haw pectic oligosaccharide on lipid metabolism and oxidative stress in experimental hyperlipidemia mice induced by high-fat diet[J]. Food Chemistry,2010,121(4):1010-1013.

[8]徐溪. 蘋果果膠寡糖的分離制備及其活性研究[D]. 西安:西北大學,2010.

[9]G T,AK G,JM G,et al. A novel galactooligosaccharide mixture increases the bifidobacterial population numbers in a continuousinvitrofermentation system and in the proximal colonic contents of pigsinvivo[J]. Journal of Nutrition,2005,135(7):1726-1731.

[10]田金輝. 黑莓果汁的研制[D]. 無錫:江南大學,2006.

[11]王志偉. 聚半乳糖醛酸酶的酶學性質及產物分析[D]. 青島:中國海洋大學,2007.

[12]劉義武,王碧. 檸檬皮中果膠提取工藝研究[J]. 內江師范學院學報,2011,10:14-17.

[13]趙麗. P. fluorenscens 發酵生產胞外多糖的結構分析及活性評價[D]. 青島:中國海洋大學,2013.

[14]曲昊楊,朱文學,劉琛,等. 蘋果渣果膠提取工藝優化及堿法降酯效果評價[J]. 食品科學,2014,14:87-92.

[15]Li L,Ban Z,Li X,et al. Effect of 1-methylcyclopropene and calcium chloride treatments on quality maintenance of ‘Lingwu Long’ Jujube fruit[J]. Journal of Food Science and Technology-Mysore,2014,51(4):700-707.

[16]Re R,Pellegrini N,Proteggente A,et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free radical biology and medicine,1999,26(9):1231-1237.

[17]杜麗娟,李拖平,王娜,等. 山楂果膠分解物抗氧化作用研究[J]. 食品研究與開發,2009,6:18-20.

Study on preparation of pectic oligosaccharides from blackberry by enzymatic hydrolysis and its antioxidant activities

DING Peng1,SHEN Zhao-peng2,3,ZHANG Jing-liang2,3,LI Guo-xia1,WAN Guo-shao4,JIANG Xiao-lu1,3,*

(1.College of Food Science and Engineering of Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.School of Medicine and Pharmacy of Ocean University of China,Qingdao 266003,China;3.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao,Qingdao 266071,China;4. Qingdao Golden Phoenix Manor Fruit Co. Ltd,Qingdao 266213,China)

In order to study the antioxidant activity of the oligosaccharide of BlackBerry pectin,their radical scavenging activities were evaluated. After the enzymolysis of the extracted BlackBerry pectin,different oligosaccharide fragments were obtained with graded ethanol precipitation.Invitroantioxidant activities of that oligosaccharide were evaluated by the DPPH radicals,ABTS radicals,and hydroxyl radical scavenging activity. The results indicated that the oligosaccharide obtained with 4 times of ethanol could scavenge DPPH radicals with ABTS radicals with IC50values of 0.59 mg/mL and 4.75 mg/mL,respectively. By contrast,the oligosaccharide obtained with 10 times of ethanol showed relatively high scavenging activity on DPPH radicals and ABTS radicals with IC50value of 0.40 mg/mL and 2.79 mg/mL,respectively. The oligosaccharide of BlackBerry pectin exhibited significant antioxidant activity,and the scavenging activity on DPPH radicals and ABTS radicals presented a quantity-effect relation with the concentration of oligosaccharide.

oligosaccharides;pectin;blackberry;antioxidant activity

2015-12-02

丁鵬(1990-)，男，碩士，研究方向：應用微生物工程，E-mail：dpsunshine@126.com。

江曉路(1959-)，女，本科，教授，研究方向：應用微生物工程，E-mail：jiangxl@ouc.edu.cn。

國家自然科學基金(U1406402-5)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)11-0076-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.007