由蝦殼制備的蛋白水解物-檸檬酸鈣的復合鈣粉的生物利用率研究

張文靜,劉云飛,陳舜勝

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

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由蝦殼制備的蛋白水解物-檸檬酸鈣的復合鈣粉的生物利用率研究

張文靜,劉云飛,陳舜勝*

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

目的:評價從蝦殼中制取的蛋白水解物-檸檬酸鈣復合鈣粉(PHC-Ca)的生物利用率。方法:選擇4周齡體重無顯著性差異的SD大鼠60只,隨機分為6組,在自由進食低鈣飼料的基礎上分別以PHC-Ca、碳酸鈣(CaCO3)、檸檬酸鈣、葡萄糖酸鈣以及蝦殼細粉灌胃飼養,每日灌胃劑量為66.5 mg Ca/(kg·d)(以鈣劑量及大鼠體重為計算指標)。喂養至4周末進行3 d代謝實驗,測定鈣表觀吸收率、儲存率。繼續喂養至8周末,觀察大鼠體格增長并測定血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平以及股骨相關指標。結果:低鈣對照組大鼠各項體生長指標均顯著低于除碳酸鈣組外的其他組(p<0.05);PHC-Ca能顯著提高大鼠鈣表觀吸收率、鈣儲存率,且能降低血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平(p<0.05);攝食PHC-Ca、葡萄糖酸鈣的大鼠,其血清鈣水平無顯著性差異(p>0.05)且高于其他組;PHC-Ca組大鼠股骨鈣、股骨長、股骨干重指標高于葡萄糖酸鈣組、檸檬酸鈣組、蝦殼粉組(p<0.05)。結論:從蝦殼中制取的PHC-Ca有促進鈣吸收的效果,其生物利用率優于相同鈣含量的檸檬酸鈣以及蝦殼粉,可作為一種良好的膳食鈣補充劑。

蝦殼,蛋白水解物-檸檬酸鈣,生物利用率

鈣是組成人體骨骼、牙齒支架的主要元素。鈣離子參與人體生命活動,是傳遞細胞間主要信息的使者,其生理代謝對人體極為重要。攝入過量鈣易沉積加重腎臟的負擔,缺乏鈣會導致骨質疏松等癥狀。因此,鈣的吸收利用情況引起越來越多關注,在尋求來源豐富的天然鈣基礎上,研究出一種生物利用率高的補鈣產品極為迫切。

鈣吸收的過程為胃中消化、小腸吸收、血液運輸、骨骼沉積,從而促進大鼠骨骼生長。在胃液作用下消化為Ca2+,一部分被代謝出體外一部分被小腸吸收,被吸收的Ca2+在氨基酸的作用下進入血液。而后在血液的運輸下進入骨骼,最終沉積于骨質[1]。因此,本實驗考察大鼠的代謝指標,血清中堿性磷酸酶、骨鈣素等鈣入骨指標[2],骨骼指標等。除此之外,鈣吸收效果最明顯是體格指標。

表1　大鼠分組及喂食鈣劑量

注:*以鈣的劑量及大鼠體重為計算指標。

蛋白水解成小分子的氨基酸、多肽,有促進鈣吸收的效果。來源不同的蛋白水解成了不同的多肽、氨基酸,其中蛋清肽、鱈魚皮膠原蛋白肽、魚卵肽能有效地促鈣吸收[3-6]。蝦殼中含有豐富的蛋白,酶處理將其分解為小分子多肽氨基酸與鈣質、甲殼素分離從而達到高值利用。然而利用其蛋白水解物探討促鈣吸收的研究鮮有報道。葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣等有機鈣被認為是良好的鈣源應用于食品工業[7]。其中檸檬酸鈣制備方法成熟,來源廣,存在于天然水果的檸檬酸與蝦殼中豐富的鈣質結合制備檸檬酸鈣,可用于鈣強化食品中[8]。

2015中國漁業統計年鑒中顯示,2014年全國海水養殖南美白對蝦(Penaeusvannamei)產量總值為87萬噸,占蝦類總產值的75%左右[9]。而蝦殼中富含蛋白質、鈣質、甲殼素、蝦紅素等,僅作為魚飼料低值利用。為更好地利用天然蝦殼,蝦殼中的蛋白、鈣質等有益物質成為了研究的熱點。

本實驗以南美白對蝦蝦殼作為鈣源,制取蛋白水解物-檸檬酸鈣復合鈣粉,分析比較制備的復合鈣粉與其他不同類型的鈣制劑生物利用率,分析其利用價值,為居民選擇合適的補鈣制劑提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

4周齡SD大鼠(Sprague-Dawley)60只,清潔級,上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,許可證號SCXK(滬)2013-0006,飼養環境:溫度(22±2)℃、濕度60%±5%;蛋白水解物-檸檬酸鈣復合鈣粉(PHC-Ca)為實驗室自制,其中鈣含量為19.6%,總氨基酸含量18.3%,脂肪0.44%;胰蛋白酶(1∶250,酶活力≥50000 U/g)、檸檬酸、檸檬酸鈣、碳酸鈣分析純,國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖酸鈣口服溶液哈藥集團三精制藥股份有限公司;血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素檢測試劑盒艾迪康醫學檢驗中心。

石墨爐消化爐長沙基隆儀器有限公司;MARS6微波消解儀美國CEM公司;Zoonit700原子吸收分光光度儀德國耶拿;BS-200全自動生化分析儀邁瑞醫療國際有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1低鈣飼料的制備為建立低鈣喂養模型,制備低鈣飼料[10],其中鈣含量為0.1%。配方如下:酪蛋白19.4%,大豆油10.0%,玉米淀粉39.3%,麥芽糖糊精13.6%,蔗糖8.7%,纖維素5.0%,維生素混合物1.0%,DL-蛋氨酸0.1%,酒石酸膽堿0.2%,TBHQ 0.002%,礦物質混合物2.5%(鈣0.1%)。

1.2.2PHC-Ca的制取參考文獻[11]的方法制備PHC-Ca:洗凈的南美白對蝦(PenaeusvannameiBoone)蝦殼置于80 ℃鼓風干燥箱中烘干6 h,研磨過篩100目,制得蝦殼細粉,直徑<0.15 mm。稱取2 g蝦殼細粉以料液比1∶20加去離子水,均質5 min后進行酶解。利用胰蛋白酶酶解[11]:加酶量2.5×103U/g,pH8.0,溫度45 ℃,酶解1.5 h,滅酶5 min。冷卻至室溫后,經5000 r/min離心10 min收集上層液,分離殘渣。而后在殘渣中繼續添加20 mL,0.34 mol/L的檸檬酸,處理1.5 h后收集上層液。將兩次收集的上層液合并、濃縮、80 ℃烘干后即為PHC-Ca。

1.2.3大鼠實驗分組與喂養方式4周齡70～80 g體重大鼠經適應性喂養一周后,挑選體重無顯著性差異的大鼠60只,分為6組:低鈣對照組、PHC-Ca組、蝦殼細粉組、碳酸鈣組、檸檬酸鈣組、葡萄糖酸鈣組,每組10只。各組大鼠自由進食低鈣飼料、飲用去離子水,在此基礎上進行每日灌胃飼養8周。灌胃劑量(以鈣的劑量為計算指標)參考人體(成年人體質量60 kg)每日需攝入鈣含量800 mg,換算為13.3 mg Ca/(kg·d),中劑量66.5 mg Ca/(kg·d)吸收效果較好[12]。鈣制劑與去離子水混合灌胃量為0.5 mL,低鈣對照組每日灌胃0.5 mL去離子水(表1)。

1.2.4鈣表觀吸收率的測定大鼠體重需每日稱量,喂養至4周后將大鼠放入代謝籠中收集3 d糞便、尿液至100 ℃鼓風干燥箱中干燥,恒重后磨成粉,利用火焰原子吸收測定代謝物中鈣含量。

鈣表觀吸收率(%)=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100

鈣儲存率(%)=(攝入鈣-糞鈣-尿鈣)/攝入鈣×100

1.2.5血清中鈣相關指標的測定喂養大鼠至8周后將其解剖,取動脈血,4 ℃靜置0.5 h,10000 r/min、4 ℃離心取上層血清,4 ℃保存。利用生化自動分析儀測定血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素含量。

1.2.6股骨干重、骨長、骨鈣含量的測定將大鼠處死后取右股骨,用游標卡尺測定長度,烘干恒重后稱股骨干重,最后利用火焰原子吸收法測定骨鈣含量。

1.3數據處理

所有測定數據均重復10次,測定值通過平均值及標準偏差表示,通過SSPS17.0軟件處理,組間比較采用LSD法(least significant difference),p<0.05被認為有顯著性差異。

2　結果與討論

2.1PHC-Ca對大鼠生長的影響

大鼠體格指標是鈣制劑吸收效果評定的關鍵指標。由表2可知,實驗初期各組大鼠體重、身長無顯著性差異。喂食8周后,各種鈣制劑對大鼠的生長均有一定促進作用。喂養期間,低鈣對照組大鼠較其他組瘦小,毛色暗淡。低鈣對照組大鼠體重與碳酸鈣組無顯著性差異(p>0.05),PHC-Ca組、蝦殼粉組大鼠體重最大,與葡萄糖酸鈣組有顯著性差異(p<0.05)。低鈣對照組大鼠身長顯著低于其他組(p<0.05)。除碳酸鈣組,PHC-Ca組、葡萄糖酸鈣組、檸檬酸鈣組大鼠身長無顯著性差異(p>0.05)。表明足量的鈣質是保證大鼠正常生長發育的前提,PHC-Ca中的蛋白水解物、蝦殼粉中的蛋白是有助體格增長的營養素。

喂食組別體重(g)身長(cm)初始體重第8周初始身長第8周低鈣對照組93.38±3.78a186.77±3.79d11.32±0.92a19.25±0.69cPHC-Ca組93.84±3.66a219.02±5.83a11.22±0.87a22.16±0.73aCaCO3組92.39±4.47a194.54±6.76dc11.35±0.64a20.03±0.73b檸檬酸鈣組93.08±4.76a200.10±10.97c11.43±0.48a21.56±0.59a葡萄糖酸鈣組92.89±3.68a206.85±5.53b11.37±0.62a21.51±0.45a蝦殼細粉組93.67±5.03a212.08±2.99a11.28±0.43a21.62±0.61a

注:同一列中上標字母相同者無顯著性差異(p>0.05),上標字母不同者存在顯著性差異(p<0.05),表3～表5同。

表3　大鼠攝入不同鈣制劑對其鈣吸收的影響±s,n=10)

2.2PHC-Ca對大鼠體內鈣吸收效果的影響

大鼠攝入鈣制劑,在胃液作用下將其分解為離子態,進入小腸中一部分被吸收利用。因此,鈣表觀吸收率,鈣儲存率能反映鈣在大鼠體內表觀的情況。由表3可知,大鼠僅攝食低鈣飼料,鈣表觀吸收率、儲存率均顯著高于其他組(p<0.05)。可能是大鼠因缺鈣產生應激反應,對少量的鈣吸收效果顯著增加。PHC-Ca、葡萄糖酸鈣組大鼠鈣表觀吸收率顯著高于檸檬酸鈣、碳酸鈣、蝦殼粉組(p<0.05)。PHC-Ca組大鼠代謝物中糞鈣、尿鈣含量較低,可能是PHC-Ca溶解性好,成分中的小分子蛋白水解物能促進鈣的吸收,葡萄糖酸鈣為液體有機酸鈣,在小腸中被充分吸收,因此,兩者鈣表觀吸收率較高。

2.3PHC-Ca對大鼠血清鈣水平的影響

鈣離子經小腸吸收后進入血液,匯集于血清,因此血清中鈣相關指標是評價鈣吸收效果的重要方法。由表4可知,PHC-Ca、葡萄糖酸鈣組大鼠血清鈣、磷水平都高于其他組(p<0.05),可能是PHC-Ca、葡萄糖酸鈣中的氨基酸、多肽、葡萄糖是促鈣吸收的物質,使小腸吸收的鈣基本進入血液。血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平又是骨代謝標志物,能維持鈣在骨骼中的礦化的速率[13],攝食相同鈣含量不同鈣制劑的大鼠,其骨鈣素水平無顯著差異。低鈣對照組大鼠血清中堿性磷酸酶、骨鈣素骨代謝指標顯著高于其他組(p<0.05),表明在缺鈣狀態下,大鼠骨鈣不斷流失。

2.4PHC-Ca對大鼠股骨指標的影響

鈣離子通過血液的運輸最終在骨骼的無機質中沉積成鈣鹽,構成骨骼的基本結構。股骨的長勢是大鼠骨骼生長的主要指標,從股骨干重、骨長、骨鈣結果(見表5)中看出攝食PHC-Ca的大鼠骨骼長勢顯著優于其他組(p<0.05)。蝦殼粉作為補鈣產品其鈣吸收效果不及由蝦殼制取的PHC-Ca。PHC-Ca的生物利用率高于檸檬酸鈣,蝦殼中蛋白水解物有效地促鈣吸收。因此,PHC-Ca無需純化,可直接作為膳食鈣補充劑。經分析,PHC-Ca與其他鈣制劑相比能更好地促進大鼠骨骼的生長,預防骨質疏松癥。

組別血清鈣(mmoL/L)血清磷(mmoL/L)堿性磷酸酶(IU/L)骨鈣素(ng/mL)低鈣對照組2.364±0.072d1.568±0.017c219.40±6.52a0.712±0.037aPHC-Ca組2.871±0.089a1.842±0.029a189.40±6.52d0.421±0.011bCaCO3組2.655±0.035c1.679±0.029b196.10±5.51b0.446±0.033b檸檬酸鈣組2.715±0.047b1.665±0.033b193.00±7.59c0.440±0.036b葡萄糖酸鈣組2.898±0.069a1.809±0.051a190.20±3.76d0.456±0.026b蝦殼細粉組2.725±0.053b1.596±0.059c194.40±6.62c0.492±0.027b

組別股骨干重(g)股骨長(cm)股骨鈣(mg/g)低鈣對照組0.1938±0.0024d2.72±0.02d152.8±3.2dPHC-Ca組0.2783±0.0074a2.93±0.01a191.4±4.3aCaCO3組0.2388±0.0083c2.83±0.03c177.7±3.1c檸檬酸鈣組0.2645±0.0161b2.85±0.04c183.7±5.2b葡萄糖酸鈣組0.2681±0.0179b2.90±0.03b189.6±2.9b蝦殼細粉組0.2370±0.0064c2.91±0.03b183.0±3.0b

通過比較5種不同類型的鈣制劑生物利用率相關的各項指標,發現利用胰蛋白酶-檸檬酸聯用的方式制取PHC-Ca,其生物利用率優于蝦殼細粉。蝦殼細粉中的蛋白能促進大鼠體格生長,但從表觀吸收率、血清鈣水平、骨鈣含量等指標得到,促鈣吸收的效果較差,綜合評價其生物利用率較低。相比之下,大鼠僅攝食低鈣飼料時,因缺鈣引起機體應激反應,鈣表觀吸收率較高,但其血清鈣、骨鈣處于各組最低水平,未達到補鈣效果。

PHC-Ca與葡萄糖酸鈣吸收效果較好,可能是兩者在胃中溶解性好,得以充分吸收[14]。與檸檬酸鈣相比其生物利用率較高,可能是PHC-Ca中的小分子多肽、氨基酸是促生長、促鈣吸收的營養物質,這與氨基酸、魚骨粉酶解物促鈣吸收的研究結論一致[15-17]。PHC-Ca是利用廢棄的蝦殼制取而成,其成分中的蛋白水解物是促鈣吸收的關鍵因素。因此,無需進一步純化PHC-Ca。

3　結論

PHC-Ca組大鼠體格、血清鈣磷水平、骨鈣含量等指標最高,表明PHC-Ca能有效地促進鈣的吸收,其生物利用率優于相同鈣含量的檸檬酸鈣以及蝦殼粉。綜上所述,PHC-Ca可作為一種良好的膳食鈣補充劑添加到食品中。蝦殼中的蛋白與鈣質可作為天然的蛋白鈣源進一步回收利用,為蝦類廢棄物的綜合利用作參考。

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Study on bioavailability of protein hydrolysate-citrate calcium prepared from shrimp shell

ZHANG Wen-jing,LIU Yun-fei,CHEN Shun-sheng*

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Objective:To evaluate bioavailability of protein hydrolysate-citrate calcium(PHC-Ca)from shrimp shell. Method:4 weeks SD rats were randomly divided into 6 groups with 10 rats in each,and then gavaged with PHC-Ca,CaCO3,calcium citrate,calcium gluconate,shrimp shell powder based on low calcium diet and low calcium control diet for 8 weeks. The calcium gavage dose to rats was 66.5 mg Ca/(kg·d). Calcium metabolic test was conducted by the end of the forth week. Moreover,the index related to serum and bone were assayed by the end of the 8th week. Result:The rats’ growth index in low calcium was lower than other group except CaCO3.The calcium absorption rate of PHC-Ca group was remarkable high than other groups except low calcium control. Furthermore,the level of ALP,BGP,in serum indicated that PHC-Ca improved calcium absorption in serum level significantly(p<0.05). Moreover,the bone index showed the bioavailability in PHC-Ca group(p<0.05). Conclusion:PHC-Ca prepared from shrimp shell could be promote calcium absorption,its bioavailability was better than same calcium content of calcium citrate and shrimp shell powder,which could be used as sources of dietary calcium supplement.

shrimp shell;protein hydrolysate-citrate calcium(PHC-Ca);bioavailability

2015-12-22

張文靜(1990-)，女，碩士研究生，主要從事水產品加工利用方面的研究，E-mail:zwj323@sina.com。

陳舜勝(1956-)，男，碩士，教授，主要從事水產品加工與貯藏方面的研究，E-mail:sschen@shou.edu.cn。

國家自然科學基金資助項目(31471685)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD28B05);融合海洋食品科學的海洋生物藥物(B5201120040);上海市2015高校內涵建設項目(A2018150009)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)10-0360-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.066