低溫堿性脂肪酶型時間-溫度指示劑的研究

任興晨,茅林春,苑佳佳,盧文靜

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

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低溫堿性脂肪酶型時間-溫度指示劑的研究

任興晨,茅林春*,苑佳佳,盧文靜

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

利用堿性脂肪酶催化三乙酸甘油酯分解導致pH降低,以酸堿指示劑顯示顏色變化,研究并確定低溫環境的TTI(時間溫度指示劑)的反應體系及基本特性。該時間溫度指示劑(25 mL)的反應體系為:5 mL三乙酸甘油酯∶20 g/L聚乙烯醇乳化液(v∶v=1∶19,均質10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次)、19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液、0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液、0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液、0.20 mL百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑。通過測定反應體系在不同溫度下的pH下降速率,最終確定該反應體系的Ea為60.14 kJ/mol。該反應體系可應用于監測低溫環境下食品中酶反應或脂肪分解的程度,間接判斷對應食品的品質狀況。

時間溫度指示劑,堿性脂肪酶,反應體系,活化能

食品質量的變化程度在很大程度上取決于食品貯運時間的長短和所處環境溫度的高低[1]。時間溫度指示劑(time-temperature indicator,簡稱TTI)貼附在食品包裝上,和食品經歷了相同的溫度歷史效應,通過產生簡單的機械形變或顏色變化來指示食品在流通過程中經歷的時間和實際溫度的雙重效應,從而監測食品質量變化和剩余貨架期[2-3]。它可以應用于易變質食品的物流中,監測食品從生產到銷售全部或部分溫度歷史,以確保食品品質安全。

國際上已開展TTI的研制,并在牛奶[4]、冷凍魚[5]、冷凍肉[6]、冷凍漢堡[7]、冷藏水果及蔬菜[8]上進行了應用性研究。根據TTI的工作原理可以分為:酶型、微生物型、聚合物型、電子型、擴散型等[9]。其中酶型TTI原理簡單,易于控制[3]。脂肪酶為甘油三酯水解酶,能夠逐步將甘油三酯水解成甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸[10],使反應體系pH降低,其來源廣泛,價格低廉。

現有報道的脂肪酶型TTI反應體系是在20 ℃條件下研究確定的[11],其反應體系在冷藏溫度下的適用性還無法確定。為了確保TTI在食品冷藏溫度下的適用性,本實驗研究了4 ℃條件下的堿性脂肪酶TTI反應體系,基本確定了底物種類、乳化處理、金屬離子、底物濃度、pH指示劑等關鍵組分。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

LVK-F100型堿性脂肪酶(20000 U/g)深圳市綠微康生物工程有限公司;三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、聚乙烯醇124、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、酚酞、百里酚酞、酚紅、百里香酚藍、氫氧化鈉、甘氨酸國藥集團化學試劑有限公司。

FSH-2A FS-2型可調分散器金壇市科析儀器有限公司;MIR-254型培養箱日本SANYO公司;CR-200型色差計日本KONICA MINOLTA公司;FE20型實驗室pH計瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2反應體系的確定

1 g/L堿性脂肪酶液:稱取0.10 g堿性脂肪酶,用Gly-NaOH緩沖液定容至100 mL,靜置1 h,過濾取濾液,4 ℃下保存。

酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑:稱取0.10 g酚紅,0.50 g酚酞,0.20 g百里酚酞,溶于100 mL 60%乙醇中,靜置12 h后抽濾。

百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑:稱取0.10 g百里香酚藍,0.30 g酚酞,0.10 g百里酚酞,溶于100 mL 50%乙醇中,靜置12 h后抽濾。

1.2.2反應底物的確定分別取0.25 mL三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯,與4.75 mL 20 g/L聚乙烯醇(PVA)混合,用可調分散器乳化兩次,轉速10000 r/min,每次3 min,間隔5 min[12]。分別在三種乳化液中加入19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液,在4 ℃下預冷10 min,加入0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液,放置在4 ℃恒溫箱,每隔4 h用pH計測pH。

1.2.3乳化處理參數的確定底物和乳化劑分3組處理:第1組0.25 mL三乙酸甘油酯加入4.75 mL 20 g/L PVA混合,10000 r/min均質,每次3 min,間隔5 min,共兩次;第2組0.25 mL三乙酸甘油酯加入4.75 mL 20 g/L PVA,不均質;第3組0.25 mL三乙酸甘油酯加入4.75 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液[11]。反應體系同1.2.2,放置在4 ℃恒溫箱中,每隔4 h測pH。

1.2.4金屬離子對TTI反應體系的影響 三乙酸甘油酯與PVA按1∶19(v∶v)混合后均質(10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次),取5 mL乳化液分別加入到五組19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液中,對照組中加入0.25 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液,4個實驗組中分別加入0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2、NaCl、KCl、MgCl2溶液,其余反應條件同1.2.2,每隔4 h測pH。

1.2.5底物濃度的選擇底物含量配比見表1,反應條件同1.2.2,每隔4 h測pH。

表1　底物含量配比

1.2.6pH指示劑的確定0.25 mL三乙酸甘油酯與4.75 mL PVA混合均質(10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次),再加入19.50 mL緩沖液,0.05 mL酶液,0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液,分別加入0.20 mL酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑、百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑。4 ℃下每隔4 h測pH,并用色差計測定反應液色澤。

第二,醫護人員全面了解抗菌藥物的相關知識,如藥效、藥動力學、適應癥、禁忌癥、使用方法、可能出現的不良反應等,掌握不同抗菌藥物的藥理作用,根據患者實際病情,選擇性用藥。

1.3TTI反應體系動力學參數的測定

目前對時間溫度指示劑的動力學參數Ea研究報道的只有Arrenhenius模型,即lnK=lnKA-Ea/(R×T)[13-14]。本實驗通過在不同溫度下測量體系的pH,得到pH下降速率K進而求得Ea值。25 mL反應體系:0.25 mL三乙酸甘油酯與4.75 mL 20 g/L PVA混合均質(10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次)、19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液、0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液、0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液、0.20 mL百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑。將反應體系分別置于4、10、15、20、25 ℃下,每隔4 h測pH。

1.4數據處理

全部實驗數據用Origin 8.1進行統計處理,計算標準偏差;并使用SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2　結果與討論

2.1TTI反應體系的確定

2.1.1底物的選擇脂肪酶為甘油三酯酶[10],因此本實驗底物從三種常見的甘油三酯中選擇。三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯乳化后溶液呈白色,上層漂浮微小油滴。與三乙酸甘油酯組pH變化(100%)相比,三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯pH相對變化幅度分別為29.30%、16.28%,這兩種反應體系pH下降幅度小、速度慢;三乙酸甘油酯乳化后為透明均一液體,pH從10.46下降到8.31,pH跨度廣(圖1)。三乙酸甘油酯反應體系pH呈現出指數變化規律,將曲線用指數函數擬合,擬合系數為0.9635,pH呈現出良好的時間相關性。因此,選擇三乙酸甘油酯作為TTI反應體系的底物。

圖1　三乙酸甘油酯反應體系pH-時間關系圖Fig.1　pH-time relationship of triacetin reaction system

2.1.2乳化處理的效果各反應體系pH均呈現指數變化的規律,將各曲線用指數函數擬合,不加乳化劑不均質組、加乳化劑不均質組、加乳化劑并均質組的擬合系數分別為:0.9449、0.9410、0.9624,不加乳化劑不均質組與加乳化劑不均質組的擬合系數無顯著差異(p=0.066),加乳化劑并均質組與其他兩組的擬合系數具有顯著差異(p<0.01),加乳化劑并均質組的擬合程度顯著高于其他組,pH與時間相關性好。因此,本實驗選擇加乳化劑并均質處理,處理參數為10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次。

圖2　乳化處理對反應體系pH的影響Fig.2　Effect of emulsification on pH value of reaction system

2.1.3金屬離子的選擇有文獻報道[15],Na+能降低反應體系界面電荷效應的抑制作用,提高酶活力。1 mmol/L K+、Mg2+、Ca2+可以增強脂肪酶活力[16]。實驗結果顯示,各實驗組pH差別較小,根據圖像無法判斷金屬離子對反應體系的影響(圖3)。

圖3　金屬離子對反應體系pH的影響Fig.3　Effect of metal ions on pH value of reaction system

反應60 h內,pH隨時間的變化呈現出指數變化的規律,將各曲線用指數函數進行擬合[17]。對照、Na+、K+、Mg2+、Ca2+反應體系擬合系數分別為0.9683、0.9669、0.9679、0.9673、0.9838。對照組、Na+、K+、Mg2+實驗組的擬合系數兩兩之間無顯著差異,Ca2+實驗組與其他各組均有顯著差異(p<0.01),Ca2+實驗組的擬合程度顯著高于其余實驗組,所以金屬離子選擇Ca2+。

2.1.4底物濃度的確定如圖4所示,五組不同底物濃度的反應體系中e組pH變化最大。與e組(100%)比較,a、b、c、d組的相對變化幅度分別為59.38%、75.45%、90.63%、95.98%(圖4)。a組和b組pH相對變化幅度較小,加入pH指示劑后指示劑的顏色變化不明顯。c、d、e組pH相對變化幅度大,但d、e反應速率太快,導致時間溫度指示劑的指示時間較短,適合在4 ℃下儲存時間特別短的食品。從水產品實際保存時間來考慮,c組的底物含量最優。c組反應曲線的指數函數的擬合系數為0.9834,pH與時間的相關性好,因此底物濃度選擇c組。

圖4　底物濃度對反應體系pH的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on pH value of reaction system

2.1.5pH指示劑的確定 酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑體系L*隨時間先升高后趨于平緩,a*先升高后下降,b*基本呈上升趨勢(圖5)。與酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑(L*、a*、b*與時間的線性擬合系數分別為0.8080、0.3624、0.6219)相比,百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑體系的L*、a*、b*有較好的時間相關性(L*、a*、b*與時間的線性擬合系數分別為0.9943、0.9565、0.9689),隨時間增加,L*增大,a*由正值趨于0,b*由負值趨于0(圖6),說明反應體系顏色逐漸變淺,最終呈現無色透明溶液。本實驗選擇百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑,反應液的顏色變化順序為藍色-深紫-淺紫-無色,無色時即為反應終點,反應終點辨識度高(圖7)。

圖5　酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑反應體系L*，a*，b*值與時間關系圖Fig.5　Relationship of L*，a*，b* value and time in Phenol red-phenolphthalein-thymophthalein indicator reaction system

圖6　百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑反應體系L*a*b*值與時間關系圖Fig.6　Relationship of L*a*b* value and time in Thymol blue-phenolphthalein-thymolphthalein indicator reaction system

圖7反應體系顏色變化
Fig.7The color change of reaction system

2.2TTI反應體系動力學參數的測定

隨著溫度的升高,反應速率加快。在各溫度下,反應的初期pH的變化呈現指數變化的趨勢(圖8),對各反應曲線進行指數函數的擬合,得到反應速率和決定系數R2(表2)。

圖8　溫度對反應體系pH的影響Fig.8　Effect of temperature on pH value of reaction system

表2　不同溫度下反應體系的反應速率和擬合曲線決定系數

根據Arrenhenius方程,lnK=lnKA-Ea/(R×T),以lnK對1/T×1000作線性圖,則斜率為-Ea/(R×1000),得到回歸方程y=-7.23x+20.34,R2為0.9985(圖9),因此Ea/(R×1000)=7.23,求得Ea為60.14 kJ/mol。根據TTI應用于食品的匹配原則,以及引起食品質量下降的主要反應的活化能,可以判斷該TTI可以指示因酶反應(典型活化能值:41.84～62.76 kJ/mol)或脂肪氧化(典型活化能值:41.84～104.60 kJ/mol)導致品質下降的食品質量變化[18],應用范圍較廣。但該TTI具體應用于哪種食品,需要進一步測定特定食品的Ea值和反應終點Ea值才能確定。

圖9　不同溫度條件下TTI速率常數與1/T半對數圖Fig.9　Relationship of response rate constant and temperature

3　結論

研究確定了適用于低溫(4 ℃)環境的堿性脂肪酶型TTI反應體系。反應體系總體積25 mL,包括5 mL三乙酸甘油酯∶20 g/L聚乙烯醇乳化液(v∶v=1∶19,均質10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次)、19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液、0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液、0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液、0.20 mL百里香酚藍-酚酞-百里酚酞混合指示劑。反應體系的pH與時間相關性好,顏色變化為藍色-深紫-淺紫-無色,變化顯著,辨識度高,反應體系無色時即為反應終點。通過測定不同溫度下的反應速率,確定了反應體系的活化能為60.14 kJ/mol,該時間指示劑可以指示因酶反應或脂肪氧化導致品質下降的食品質量變化。

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Research on low-temperature TTI based on lipase

REN Xing-chen,MAO Lin-chun*,YUAN Jia-jia,LU Wen-jing

(College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

The reaction system and basic characteristic of low-temperature TTI(time-temperature indicator)was determined. The TTI was based on the color change of pH indicator resulted from the hydrolysis of triacetin by alkaline lipase. Finally,parameters of 25 mL reaction system was determined:5 mL triacetin∶20 g/L polyvinyl alcohol emulsion(v∶v=1∶19,10000 r/min,every time 3 min,5 min intervals,a total of 2 times),19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH buffer,0.05 mL 1 g/L alkaline lipase,0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2solution,0.20 mL Thymol blue-phenolphthalein-thymolphthalein mixture indicator. The activation energy of TTI was determined to be 60.14 kJ/mol by measuring pH descending rate at different temperature. The TTI can be applied to monitor enzyme reaction or steatolysis of low-temperature food,and further to indicate the quality of corresponding food.

time-temperature indicator;alkaline lipase;reaction system;activation energy

2015-09-29

任興晨(1991-),女,碩士研究生,主要從事水產品保鮮方面的研究,E-mail:xingchen5624@163.com。

茅林春(1962-),男,博士,教授,主要從事果蔬及水產品保鮮方面的研究,E-mail:linchun@zju.edu.cn。

國家科技支撐計劃課題(2015BAD17B03)。

TS254.4

A

1002-0306(2016)10-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.042