QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蔬菜中6種植物生長調節劑

周純潔,趙　博,吳　丹,鄧美林,黃思瑜

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶 401121)

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QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蔬菜中6種植物生長調節劑

周純潔,趙博,吳丹,鄧美林,黃思瑜

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶 401121)

為提高高沸點極性植物生長調節劑的檢驗效率,建立同時測定蔬菜中6種羧酸類植物生長調節劑(吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、2,4-D、α-萘乙酸、赤霉酸、4-氯苯氧乙酸)殘留量的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法。樣品采用含1%乙酸的乙腈提取,無水硫酸鎂-氯化鈉鹽析,無水硫酸鎂-石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取(d-SPE)凈化。液相色譜以BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)為分析色譜柱,乙腈和0.01%乙酸水溶液作流動相進行梯度洗脫。質譜分析采用電噴霧負離子電離、多反應監測模式,以基質匹配標準曲線外標法定量。6種植物生長調節劑在各自濃度范圍內線性良好(r>0.99),以黃瓜和番茄為代表性基質進行3個水平加標回收實驗,回收率在81.6%～108%之間,相對標準偏差(RSD)在1.3%～8.4%之間,方法檢出限為0.5～6 μg/kg。該方法操作簡便、耗時短、靈敏度和準確性好,可滿足蔬菜中植物生長調節劑殘留量的快速測定的需要。

植物生長調節劑,超高效液相色譜-串聯質譜,蔬菜,QuEChERS

隨著植物生長調節劑的廣泛使用,其安全性受到越來越多的關注[1-2]。植物生長調節劑殘留對蔬菜質量安全的影響已經逐漸引起了各國的重視,其殘留限量標準也在不斷被加強[3-4]。我國國家標準GB 2763《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》對蔬菜中部分植物生長調節劑的殘留限量進行了規定,比如,番茄中α-萘乙酸為0.1 mg/kg,幾種常見蔬菜中2,4-D的殘留限量在0.05～0.5 mg/kg之間。目前我國針對植物生長調節劑的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜-質譜法以及液相色譜-串聯質譜法等[5-10]。液相色譜法靈敏度較低,且不能提供分析物結構方面的信息;氣相色譜-質譜法在針對沸點較高、極性較大的植物生長調節劑的測定時往往需要衍生化,操作繁瑣且檢驗周期較長;液相色譜-串聯質譜法靈敏度和準確性均較高,且對于極性化合物具有良好的色譜保留能力,在高沸點極性化合物的分析方面具有獨特的優勢。

表1　6種植物生長調節劑的保留時間及質譜參數

注:*定量離子。

附劑時黃瓜(羧酸類植物生長調節劑(吲哚乙酸類、苯氧乙酸類、萘乙酸類、赤霉酸類等)通常具有較高的沸點和極性,且其色譜保留行為和提取試劑pH對其溶解性的影響均具有一定的相似性。因此,有必要建立一套針對蔬菜中羧酸類植物生長調節劑殘留的簡便、快速、準確的測定方法。本實驗采用QuEChERS技術[11-13]對樣品進行前處理,建立同時檢測蔬菜中6種羧酸類植物生長調節劑的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法,對色譜條件和樣品前處理過程進行了優化,以期得到簡便快速,回收率、靈敏度和重現性均能滿足日常檢測要求的羧酸類植物生長調節劑的檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

α-萘乙酸、2,4-D、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸和4-氯苯氧乙酸純度均>98%,購于Dr. Ehrenstorfer公司;赤霉酸純度>99%,J&K Scientific公司;無水硫酸鎂和氯化鈉均為分析純,購于成都市科龍化工試劑廠;無水乙酸鈉分析純,天津市大茂化工試劑廠;C18粉和PSA購于Welch公司;GCB購于Supelco公司;乙酸銨色譜純,CNW公司;乙酸色譜純,Thermo-Fisher公司;甲酸色譜純,ACS公司;乙腈色譜純,Merck公司;實驗用水超純水;蔬菜樣品黃瓜、番茄、四季豆、萵筍、油麥菜、白菜市售。

API 4000型三重四級桿質譜(配電噴霧離子源)AB SCIEX公司;ACQUITY超高效液相色譜儀Waters公司;VORTEX GENIUS 3型旋渦振蕩器IKA公司;CF15RXⅡ型高速冷凍離心機HITACHI公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制分別準確稱取6種植物生長調節劑(α-萘乙酸、2,4-D、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、4-氯苯氧乙酸、赤霉酸)標準品,用甲醇配成濃度各為1 mg/mL的標準儲備液,-18 ℃儲存,有效期3個月。

1.2.2樣品前處理提取:準確稱取5 g(精確至0.01 g)已均質的蔬菜樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL含1%乙酸的乙腈,渦旋1 min混勻。

分配:加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉的混合粉末,迅速振搖,渦旋振蕩1 min,以4000 r/min離心5 min。

凈化:轉移2 mL上清液至裝有200 mg無水硫酸鎂和10 mg石墨化炭黑(GCB)的具塞離心管中,渦旋混合1 min,以10000 r/min離心2 min。取上清液過0.22 μm有機系濾膜,待測。

1.2.3儀器條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:A為乙腈,B為0.01%乙酸水溶液;柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min;進樣量5 μL;梯度洗脫程序:0～0.5 min,10% A;0.5～1.5 min,10% A～95% A;1.5～3.0 min,95% A;3.0～4.0 min,95% A～10% A。

質譜條件:電噴霧離子源,負離子模式(ESI-),多反應監測(MRM);電噴霧電壓(IS):-4500 V;離子源溫度:550 ℃;霧化氣(GS1):2.8×105Pa;輔助氣(GS2):3.5×105Pa;氣簾氣(CUR):2.1×105Pa;定性離子對、定量離子對、去簇電壓(Declustering potential)和碰撞能(Collision energy)見表1。

1.3數據處理

用空白樣品基質溶液將標準儲備液稀釋得到不同濃度的基質混合標準工作溶液,按1.2.3所述方法測定。采用Analyst? 1.5.2軟件進行數據處理,得到基質匹配標準曲線,外標法定量。

2　結果與討論

2.1流動相的選擇

首先考察了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時,6種植物生長調節劑混合標準溶液的分離效果。實驗發現,乙腈-水作為流動相時，赤霉酸和4-氯苯氧乙酸在色譜柱上的保留時間分別為0.75 min和0.77 min，保留效果較差，乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相時，兩種化合物的保留時間分別為1.35 min和1.58 min，而乙腈-0.1%甲酸水溶液作流動相時，保留效果較好，兩種化合物保留時間分別為1.63 min和1.86 min，但其它4種化合物響應值均有不同程度的降低,見圖1。該結果表明,流動相中甲酸的引入有利于化合物在色譜柱上的保留,但由于質譜采用的是電噴霧電離負離子模式采集數據,甲酸的引入大大降低了各化合物的離子化效率。因此,考慮采用乙腈-乙酸水溶液作流動相。

圖1　不同流動相時6種植物生長調節劑的相對峰面積Fig.1　Relative peak area of 6 plant growth regulators using different mobile phase

由于α-萘乙酸和4-氯苯氧乙酸在m/z 184.7/140.8離子對監測時均有響應,4-氯苯氧乙酸保留時間變大可能導致其與α-萘乙酸的色譜峰發生重疊,影響分離效果,本實驗還對流動相中乙酸的濃度進行了優化。圖2為乙腈-水、乙腈-0.001%乙酸水溶液、乙腈-0.01%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動相時m/z 184.7/140.8離子對的色譜圖。圖2表明,隨著乙酸濃度的增大,4-氯苯氧乙酸的保留時間逐漸變大,但采用乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動相時,α-萘乙酸和4-氯苯氧乙酸已無法實現基線分離。因此,本實驗選擇乙腈-0.01%乙酸水溶液作流動相,可兼顧各化合物的質譜響應及色譜保留效果。

圖2　不同乙酸水溶液作為流動相時m/z 184.7/140.8離子對的色譜圖Fig.2　Chromatogram of ion pair m/z 184.7/140.8 using an aqueous phase containing acetic acid注:(A)0%,(B)0.001%,(C)0.01%,(D)0.1%。

2.2QuEChERS樣品前處理條件的優化

2.2.1提取劑的選擇6種植物生長調節劑在水中溶解性均較小,因此本實驗采用有機溶劑作為提取劑。由于蔬菜中通常含有大量的色素,若采用非極性有機溶劑容易將色素同時提取出來,所以考慮采用乙腈提取。乙腈對于不同極性的物質均有一定的溶解能力,且所提取的色素等干擾物質較少,滿足多種物質同時檢測時提取劑的要求[14]。考慮到待測化合物分子結構中均含有羧基,乙酸的加入有利于其存在形態從離子態向分子態轉變,從而增加其在乙腈中的溶解度,以增加乙腈的提取效率。實驗分別考察了用乙腈和1%乙酸乙腈作為提取劑時,各化合物的回收率結果見表2,發現乙酸的加入對赤霉酸的提取效率影響較大,其回收率可由35%提高到90%。因此,實驗選擇用1%乙酸乙腈作為提取劑。

表2　不同提取劑提取時6種植物生長調節劑的加標回收率(50 μg/kg)

2.2.2分配劑的選擇QuEChERS方法主要包括提取、分配和凈化三部分,其中分配步驟中加入的鹽可以促使有機相與水相分層,降低待測物在水相中的溶解度,并除去提取液中的水分。本實驗分別考察了加入無水硫酸鎂-氯化鈉和無水硫酸鎂-無水乙酸鈉時各化合物的回收率。結果見圖3,表明采用無水硫酸鎂-無水乙酸鈉體系作為分配劑時,6種化合物的回收率均較低。這可能是由于緩沖體系的使用使提取液中雜質增多,且弱堿性乙酸鈉的引入抑制了各化合物由離子態向分子態的轉變所致。因此,實驗選擇在提取步驟中加入無水硫酸鎂-氯化鈉作為分配劑。

圖3　不同分配劑時黃瓜(A)和番茄(B)中6種化合物的加標回收率(50 μg/kg)Fig.3　The recoveries of 6 plant growth regulators (spiked 50 μg/kg)in cucumber(A)and tomato(B) using different distribution agents

2.2.3吸附劑的選擇與傳統的固相萃取方法不同,QuEChERS技術是將適量的吸附劑直接作用于提取液中,以除去樣品提取液中大部分雜質。常用的吸附劑主要有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18粉等。PSA可以有效去除提取液中的脂肪酸和糖類的干擾,GCB主要用于去除色素的干擾,而C18粉具有良好的脫脂能力[15]。本實驗考察了無水硫酸鎂+PSA、無水硫酸鎂+C18粉和無水硫酸鎂+GCB的凈化效果,結果表明,GCB可以有效去除提取液中的色素,但C18粉和PSA脫色效果不明顯,提取液和凈化液顏色差異很小。如圖4所示,當采用無水硫酸鎂+PSA作為吸附劑時,赤霉酸、2,4-D和4-氯苯氧乙酸的回收率明顯降低;而采用無水硫酸鎂+C18粉作為吸附劑時,吲哚-3-丁酸的回收率相對較低。雖然GCB對吲哚-3-丁酸也有一定的吸附作用,但為了有效去除提取液中大量的色素,延長色譜柱的使用壽命,本實驗選擇無水硫酸鎂+GCB作為吸附劑。由于GCB的用量與其吸附能力相關,本實驗還對GCB的加入量進行了優化,當加入1.25 mg/mL GCB時,脫色效果較差;隨著GCB加入量的增加,脫色效果逐漸增強,當加到5 mg/mL GCB以上時,提取液中的色素脫除效果比較理想,凈化后溶液呈淡黃色。繼續增加GCB的用量,雖然脫色效果更好,但各化合物的回收率明顯降低。如圖5所示,當加入10 mg/mL以上的GCB時吲哚-3-丁酸、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、α-萘乙酸和吲哚-3-乙酸的回收率逐漸降低,因此本實驗吸附劑GCB的用量選擇5 mg/mL。

圖4　加入不同吸附劑時黃瓜(A)和番茄(B)中6種化合物的加標回收率(50 μg/kg)Fig.4　The recoveries of 6 plant growth regulators(spiked 50 μg/kg)in cucumber(A)and tomato(B) when adding different sorbents

圖5　加入不同量GCB作為吸附劑時黃瓜(A)和番茄(B)中6種化合物的加標回收率(50 μg/kg)Fig.5　The recoveries of 6 plant growth regulators (spiked 50 μg/kg)in cucumber(A) and tomato(B)when adding different quantities of GCB as sorbents

2.3線性方程、方法檢出限及定量限

取陰性蔬菜樣品,按照1.2.2步驟進行樣品前處理得到空白基質溶液,配制6種化合物的標準系列工作溶液,以峰面積(Y)對質量濃度(X)進行線性回歸分析,這6種化合物在相應的質量濃度范圍內線性關系良好,線性相關系數(r)均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)濃度估算方法檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)所對應濃度作為方法定量限(LOQ),6種植物生長調節劑方法檢出限在0.5～6 μg/kg之間,方法定量限在1.5～18 μg/kg之間,見表3。

表3　6種化合物的線性范圍、回歸方程、方法檢出限和定量限

表4　6種植物生長調節劑的平均回收率和相對標準偏差(n=6)

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2.4方法回收率和精密度

以黃瓜和番茄為代表基質,進行添加回收和精密度實驗。3個添加水平的回收率為81.6%～108%,相對標準偏差(RSD)均不大于8.4%,見表4。

2.5實際樣品測定

將該方法分別應用于黃瓜、番茄、四季豆、萵筍、油麥菜、白菜6種蔬菜25批次樣品的檢測,結果在3批次四季豆和1批次白菜中檢出吲哚-3-乙酸,濃度在10.2～17.2 μg/kg之間;在3批次四季豆中檢出赤霉酸,濃度在8.0 μg/kg～17.1 μg/kg之間;在1批次番茄中檢出7.6 μg/kg的2,4-D,低于GB 2763《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》對番茄中2,4-D的限量要求(0.5 mg/kg)。

3　結論

本實驗采用QuEChERS樣品前處理技術,建立了同時測定蔬菜中6種羧酸類植物生長調節劑的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品采用含1%乙酸的乙腈提取,無水硫酸鎂-氯化鈉鹽析,無水硫酸鎂-石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取(d-SPE)凈化。液相色譜以C18柱為分析色譜柱,乙腈和0.01%乙酸水溶液作流動相進行梯度洗脫。質譜分析采用電噴霧負離子電離、多反應監測模式,以基質匹配標準曲線外標法定量。6種植物生長調節劑在各自濃度范圍內線性良好,線性相關系數(r)均大于0.99,以黃瓜和番茄為代表性基質進行三水平加標回收實驗,獲得了理想的回收率(81.6%～108%),相對標準偏差(RSD)在1.3%～8.4%之間。本方法簡便快速,靈敏度和準確性高,應用于日常檢測可以縮短檢測周期,降低檢測成本,對于蔬菜中植物生長調節劑殘留檢測具有重要意義。

表5　蔬菜中植物生長調節劑檢出情況

注:“ND”代表未檢出。

Determination of six plant growth regulators in vegetables by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Chun-jie,ZHAO Bo,WU Dan,DENG Mei-lin,HUANG Si-yu

(Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing 401121,China)

To improve the detection efficiency of polar plant growth regulators with high boiling point,a new method for the simultaneous determination of 6 carboxyl-contained plant growth regulators(indole-3-acetic acid,indole-3-butyric acid,2,4-D,α-naphthaleneacetic acid,gibberellic acid and 4-chlorophenoxyacetic acid)residues in vegetables was developed by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The analytes were extracted with acetonitrile containing 1% acetic acid,and salted out with anhydrous magnesium-sodium chloride. The extracts were cleaned up by dispersive solid phase extraction(d-SPE)using anhydrous magnesium-graphitized carbon black(GCB)as sorbents. Chromatographic analysis was carried out on BEH C18column(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)using a mobile phase comprised of acetonitrile and water(containing 0.01% acetic acid)in gradient program. The plant growth regulators were analyzed by negative electrosprary ionization(ESI-)tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring(MRM)mode. Quantification was achieved using matrix-matched external standard method. The calibration curves showed good linearity in each concentration range,and the recoveries of the 6 plant growth regulators spiked at three levels in cucumber and tomato were between 81.6% and 108%,with the relative standard deviation(RSD)ranging from 1.3% to 8.4%. The limits of detection(LODs)in vegetables were in the range of 0.5 μg/kg and 6 μg/kg. The method is simple,convenient,time-saving,sensitive and accurate,and suitable for the rapid determination of plant growth regulators residues in vegetables.

plant growth regulators;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);vegetables;QuEChERS

2015-10-19

周純潔(1985-)，女，博士，工程師，研究方向：食品安全檢測，E-mail:chunjie_45@163.com。

重慶市應用開發計劃項目(cstc2013yykfB80016)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)10-0094-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.009