Gas-6蛋白對小鼠急性肺損傷保護作用的研究

尹　璐，楊　進，汪　影，畢繼蕊，劉　輝，陸友金

Gas-6蛋白對小鼠急性肺損傷保護作用的研究

尹璐，楊進，汪影，畢繼蕊，劉輝，陸友金

目的 研究外源性Gas-6蛋白對脂多糖（LPS）誘發小鼠急性肺損傷的保護作用。方法 將Balb/c小鼠隨機分為空白對照組、Gas-6蛋白對照組、LPS處理組、Gas-6蛋白保護組。LPS處理組、Gas-6蛋白保護組分別通過腹腔注射LPS誘導急性肺損傷模型，其余組以等量生理鹽水作為對照。而后Gas-6蛋白對照組及Gas-6蛋白保護組立刻通過尾靜脈注入Gas-6蛋白，其余兩組以等量生理鹽水作為對照。LPS/生理鹽水注射12 h后，取小鼠血清及肺組織。HE染色觀察小鼠肺組織病理學改變、測定肺組織病理學評分、肺組織濕/干質量比、檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平以及肺組織中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的表達情況。結果 肺組織病理學檢查顯示：與空白對照組比較，LPS處理組小鼠肺水腫、肺組織充血、中性粒細胞浸潤、炎性滲出較明顯，而Gas-6蛋白可減輕上述改變。LPS處理組小鼠肺組織濕/干質量比、肺組織病理學評分、血清中TNF-α、IL-6水平及肺組織中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的表達較空白對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護組上述指標較LPS處理組均有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 Gas-6蛋白對LPS所誘導的急性肺損傷小鼠有保護作用。

Gas-6蛋白；脂多糖；急性肺損傷

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.020.html

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是因各種損傷因素導致毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，進而造成彌漫性肺水腫，其發病的關鍵步驟是過度的炎癥反應。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性細菌細胞壁的關鍵成分，參與啟動機體炎癥反應，可導致ALI［1］。Gas-6蛋白屬于維生素K依賴的蛋白家族。研究［2］表明Gas-6蛋白可作用于Tyro-3、Mer、Axl（簡稱TAM）3個不同的受體酪氨酸激酶，抑制炎癥反應。Giangola et al［3］有關小鼠腎臟缺血/再灌注模型的研究表明，Gas-6蛋白能明顯減輕小鼠腎臟的炎癥反應，減輕細胞凋亡及組織損傷，從而改善小鼠生存率。然而目前尚缺少有關Gas-6蛋白應用于ALI的研究。該研究旨在通過LPS誘導小鼠ALI模型，探討Gas-6蛋白通過抑制炎癥反應發揮對小鼠ALI的保護作用，為臨床ALI的治療提供新的依據和思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 10～12周齡雌性Balb/c小鼠32只，20～25 g，SPF級，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2實驗試劑及器材 LPS（E.coli 055：B5）（美國Sigma公司）；Gas-6蛋白（美國R&D Systems公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（美國Promega公司）；逆轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物合成（上海生工生物工程技術服務有限公司）；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（北京國藥集團）；微量移液器（德國 Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1實驗分組及模型建立 將32只10～12周齡雌性Balb/c小鼠隨機分為空白對照組（生理鹽水+生理鹽水）、Gas-6蛋白對照組（生理鹽水+Gas-6）、LPS處理組（LPS+生理鹽水）、Gas-6蛋白保護組（LPS+Gas-6），每組8只小鼠。LPS（E.coli 055：B5）用生理鹽水配制成濃度為2 mg/ml，Gas-6蛋白按照5μg/200μl溶解于生理鹽水中。LPS處理組和Gas-6蛋白保護組小鼠分別腹腔注射20 mg/kg的LPS誘導小鼠ALI模型，其余兩組則腹腔注射等量的生理鹽水。然后Gas-6蛋白對照組和Gas-6蛋白保護組小鼠立刻通過尾靜脈注入5μg的Gas-6蛋白，其余兩組分別尾靜脈注入等量生理鹽水。

1.2.2標本制備 LPS/生理鹽水腹腔注射12 h后，摘眼球取血，血液收集于1.5 ml EP管中，然后通過頸椎脫臼法處死小鼠。快速打開胸腔，取出肺組織。取兩葉右側肺組織進行肺濕/干質量比測定；一葉右肺組織4%多聚甲醛固定（室溫），24 h后送入安徽醫科大學第二附屬醫院病理科進行HE染色制備病理切片，光鏡下觀察組織病理變化；余肺經0.01%DEPC水漂洗2遍后放入1.5 ml無酶EP管，立即放入-80℃冰箱中保存。血液在1.5 ml EP管中室溫靜置2 h后，3 500 r/min離心20 min后取上清液，迅速將血清移至-80℃冰箱中保存。

1.2.3肺濕/干質量比測定 迅速分離小鼠五葉肺組織，取兩葉右側肺組織后立刻稱重，計為濕重。然后肺組織置于80℃烘箱中72 h后，再次稱重，計為干重。濕重/干重為肺濕/干質量比。

1.2.4肺組織病理學變化及評分 取一葉右側肺組織固定于4%多聚甲醛中，室溫放置24 h后送入安徽醫科大學第二附屬醫院病理科進行HE染色制備病理切片，光鏡下觀察肺組織病理變化。采用Takao et al［4］的方法進行病理評分。主要就肺泡及血管壁的中性粒細胞浸潤、肺充血情況、肺泡間隔增厚程度、肺透明膜的形成等對肺損傷程度進行評分。每項指標由輕到重評分記為0～4分。并隨機選取10個視野進行評估，最終將評分匯總，總分代表各組小鼠肺損傷程度。

1.2.5ELISA法檢測小鼠血清TNF-α及IL-6濃度

按照ELISA試劑盒說明書分別檢測血清TNF-a、IL-6濃度。酶標儀上450 nm處測吸光度（optical density，OD）值，繪制標準曲線，評估待測品濃度。1.2.6 實時定量PCR（qRT-PCR）法檢測小鼠肺組織中 TNF-a mRNA、IL-6 mRNA表達情況 每只小鼠分別稱取40 mg肺組織，液氮中碾碎，勻漿器反復勻漿。然后用美國Promega公司提供的試劑盒提取總RNA。用日本TaKaRa公司的逆轉錄及Script RT-qPCR試劑盒并參照試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，然后進行qRT-PCR法檢測。從PubMed Genbank中檢索相關基因序列，由上海生工生物公司進行引物設計合成。引物序列：TNF-α上游引物：5′-AGACCCTCACACTCAGATCATCTTC-3′，下游引物：5′-TTGCTACGACGTGGGCTACA-3′；IL-6上游引物：5′-ACCACGGCCTTCCCTACTTC-3′，下游引物：5′-CTCATTTCCACGATTTCCCAG-3′；GADPH上游引物：5′-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′。反應條件：95℃、30 s為預變性階段條件，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個循環的擴增階段，95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s為溶解曲線階段條件。以GADPH作為內參，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.3統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，數據以ˉx±s表示，多組間的均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey檢驗。

2　結果

2.1各組小鼠肺濕/干質量比 經LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠肺濕/干質量比的差異有統計學意義（F=14.58，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠肺濕/干質量比差異無統計學意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護組小鼠，肺濕/干質量比較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護組小鼠肺濕/干質量比較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見表1。

表1　經LPS及Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺濕/干質量比、肺組織病理學評分比較

表1　經LPS及Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺濕/干質量比、肺組織病理學評分比較

與空白對照組比較：*P＜0.05；與 LPS處理組比較：#P＜0.05

組別肺組織濕/干質量比（g/g）肺組織病理學評分（分）空白對照3.94±0.17　1.23±0.18 Gas-6蛋白對照　3.92±0.22　1.15±0.17 LPS處理　4.51±0.26*　5.95±0.43*Gas-6蛋白保護　4.22±0.15*#　3.43±0.27*#

2.2各組小鼠肺組織病理學變化及評分 與空白對照組、Gas-6蛋白對照組比較，經LPS處理后的LPS處理組、Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織病理改變表現為不同程度的肺組織充血、炎性滲出、肺泡壁增厚和破壞、透明膜形成、中性粒細胞浸潤等。而Gas-6蛋白保護組小鼠較LPS處理組小鼠上述情況有所減輕。見圖1。隨機選取10個視野進行評估，最終將評分匯總，總分代表小鼠肺損傷程度。經LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠肺組織病理評分的差異有統計學意義（F=517.00，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠肺組織病理學評分差異無統計學意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織病理學評分較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織病理學評分較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見表1。

2.3各組小鼠血清TNF-α及IL-6濃度 經LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度差異均有統計學意義（F=96.98、140.20，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度差異無統計學意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見圖2。

圖1　經　LPS及　Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺組織病理學改變 A：空白對照組；B：Gas-6蛋白對照組；C：LPS處理組；D：Gas-6蛋白保護組

圖2　ELISA法檢測經　LPS及　Gas-6蛋白處理后各組小鼠血清　TNF-α、IL-6濃度1：空白對照組；2：Gas-6蛋白對照組；3：LPS處理組；4：Gas-6蛋白保護組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與　LPS處理組比較：#P＜0.05

2.4各組小鼠肺組織TNF-α及IL-6 mRNA表達

經LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達差異有統計學意義（F=35.23，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達差異無統計學意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。各組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達差異有統計學意義（F= 30.38，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組、Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達差異無統計學意義。Gas-6蛋白保護組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3　qRT-PCR檢測經LPS及　Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺組織TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表達1：空白對照組；2：Gas-6蛋白對照組；3：LPS處理組；4：Gas-6蛋白保護組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與　LPS處理組比較：#P＜0.05

3　討論

ALI是由于毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞損傷導致肺部炎癥，進而導致彌漫性肺水腫；其發病機制主要是大量中性粒細胞及單核-巨噬細胞在肺內聚集、活化并釋放炎癥因子導致的嚴重炎癥反應。促炎因子主要包括IL-6、TNF-α、IL-17等［5］，在ALI發生時，這些炎癥因子被迅速激活，并通過細胞間信號傳導而放大炎癥反應，促進ALI的發展。盡管過去十年中由于保護性肺通氣策略的應用，ALI的死亡率已經有所降低［6］。但有研究［7］顯示，美國2007年死于該病的患者約74 500例。而幾項流行病學研究［8］表明我國ALI病死率高于西方發達國家。因此尋求有效治療ALI的方法顯得尤為重要。目前有關治療ALI的研究主要是圍繞減輕機體全身和局部的過度炎癥反應，肺水腫程度及中性粒細胞在肺組織間隙的浸潤聚集程度［9］。

Gas-6蛋白是維生素K依賴的蛋白家族成員，廣泛表達于各類細胞，主要包括單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞等。臨床試驗表明肺部感染［10］及急性胰腺炎［11］患者血漿Gas-6蛋白水平較正常組升高。Gas-6蛋白濃度與系統性紅斑狼瘡［12］、膿毒血癥［13］的病情嚴重程度及預后成正相關。Alciato et al［14］的細胞實驗則表明Gas-6蛋白可抑制單核/巨噬細胞釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子。以上研究均表明Gas-6蛋白可能在機體的炎癥反應發展過程中發揮保護作用。

本研究通過腹腔注射LPS誘導小鼠ALI模型，尾靜脈注射Gas-6蛋白證明其對小鼠ALI有一定保護作用。相關分子實驗及病理觀察表明，LPS處理的ALI小鼠較對照組小鼠出現血清及肺組織炎癥指標上升，肺濕/干質量比及肺組織病理學評分升高。并出現彌漫性肺水腫、肺組織充血、中性粒細胞浸潤、炎性滲出、透明膜形成等病理損傷。而Gas-6蛋白可減輕炎癥反應、肺水腫程度及病理損傷。

綜上所述，Gas-6蛋白通過抑制全身及局部炎癥反應，減輕彌漫性肺水腫，發揮對LPS誘導的ALI小鼠的保護作用，為臨床ALI的治療提供新思路。目前認為Gas-6蛋白抗炎作用的發揮與TAM有關，但具體機制仍有待進一步研究。

［1］ Chen H，Bai C X，Wang X D.The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injurymodel in respiratory medicine［J］. Expert Rev Resp Med，2010，4（6）：773-83.

［2］ Fujimori T，Grabiec A M，Kaur M，et al.The Axl receptor tyrosine kinase is a discriminator of macrophage function in the inflamed lung［J］.Mucosal Immunol，2015，8（5）：1021-30.

［3］ Giangola M D，YangW L，Rajayer SR，etal.Growth arrest-specific protein 6 protects against renal ischemia-reperfusion injury［J］.JSurg Res，2015，199（2）：572-9.

［4］ Takao Y，Mikawa K，Nishina K，et al.Attenuation of acute lung injury with propofol in endotoxemia［J］.Anesth Analg，2005，100（3）：810-6.

［5］ 李 菡，姜寶珍，劉澤玉，等.HMGB1/TLRs信號通路在大鼠機械通氣肺損傷中的作用［J］.安徽醫科大學學報，2015，50（4）：458-62.

［6］ Lin W C，Chen CW，Huang Y W，et al.Kallistatin protects against sepsis-related acute lung injury via inhibiting inflammation and apoptosis［J］.Sci Rep，2015，5：12463.

［7］ Matthay M A.Treatmentof acute lung injury：clinical and experimental studies［J］.Proc Am Thorac Soc，2008，5（3）：297-9.

［8］ 宋振舉，白春學.我國急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征臨床和實驗研究進展［J］.內科理論與實踐，2010，5（6）：496-9.

［9］ Giangola M D，YangW L，Rajayer SR，etal.Growth arrest-specific protein 6 Attenuates Neutrophil Migration and Acute Lung Injury in Sepsis［J］.Shock，2013，40（6）：485-91.

［10］Sainaghi P P，Alciato F，Carnieletto S，et al.Gas6 evaluation in patients with acute dyspnea due to suspected pulmonary embolism［J］.Respir Med，2009，103（4）：589-94.

［11］Uehara S，Handa H，Gotoh K，et al.Plasma concentrations of growth arrest-specific protein 6 and protein S in patientswith acute pancreatitis［J］.JGastroenterol Hepatol，2009，24（9）：1567-73.

［12］Ekman C，J?nsen A，Sturfelt G，et al.Plasma concentrations of

Gas6 and sAxl correlate with disease activity in systemic lupus erythematosus［J］.Rheumatology（Oxford），2011，50（6）：1064-9.

［13］Gibot S，Massin F，Cravoisy A，et al.Growth arrest-specific protein 6 plasma concentrations during septic shock［J］.Crit Care， 2007，11（1）：R8.

［14］Alciato F，Sainaghi PP，Sola D，etal.TNF-alpha，IL-6，and IL-1 expression is inhibited by GAS6 inmonocytes/macrophages［J］. JLeukoc Biol，2010，87（5）：869-75.

The protective effect of Gas-6 protein on murine acute lung injury

Yin Lu，Yang Jin，Wang Ying，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effectof exogenous Gas-6 protein on LPS-induced acute lung injurymice. Methods Balb/c mice were randomly divided into control group，Gas-6 protein control group，LPS-treated group and Gas-6 protein protection group.LPSwas administered to inducemurine acute lung injurymodel by intraperitoneal injection in LPS-treated group and Gas-6 protein protection group，while the other groups used normal saline. Then Gas-6 protein was intravenously injected in Gas-6 protein control group and Gas-6 protein protection group at once，while the other groups used normal saline.12 hours after LPS/normal saline injection，serum and lung tissue ofmice were obtained.HE staining was used to observe pathological changes in the lung tissue ofmice.The lung pathological score，lung tissue wet-to-dry weight ratio，the levels of TNF-αand IL-6 in serum，the expression of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in lung tissue were analyzed at the same time.Results The pathological results showed that the degrees of pulmonary edema，lung congestion，neutrophil infiltration，inflammatory exudate of the LPS-induced group weremore serious than the control group.However，the Gas-6 protein could reduce the changes.Compared with the control group，the lung pathological score，lung tissuewet-to-dry weight ratio，the levels of TNF-αand IL-6 in serum，the expression of TNF-αmRNA and IL-6mRNA in lung tissue of the LPS-induced group were significantly increased（P＜0.05）.However，the index of the Gas-6 protein protection group was lower than the LPS-induced group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Gas-6 protein has protective effect on acute lung injury induced by LPS in mice.

Gas-6 protein；LPS；acute lung injury

◇預防醫學研究◇

R 563.8

A

1000-1492（2016）05-0655-05

2016-02-22接收

國家自然科學基金（編號：81400058）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2013Z154）

安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，合肥 230601

尹 璐，女，碩士研究生；

陸友金，男，碩士生導師，責任作者，Email：luyougolden@ hotmail.com