青春期和成年早期鉛、鎘聯(lián)合暴露對(duì)小鼠雄性生殖功能的影響

張　莉，胡仁宜，王　華，楊露露，胡永方，王碧偉，張桂彬，徐德祥

◇藥學(xué)研究◇

青春期和成年早期鉛、鎘聯(lián)合暴露對(duì)小鼠雄性生殖功能的影響

張莉1，2，胡仁宜1，王華1，楊露露1，胡永方1，王碧偉1，張桂彬1，徐德祥1

目的 觀察青春期和成年早期小鼠經(jīng)飲水暴露鉛和鎘對(duì)雄性生殖功能的影響。方法 健康4周齡雄性ICR小鼠被隨機(jī)分入對(duì)照組、鉛組、鎘組、鉛+鎘組，每組15只。各組小鼠分別經(jīng)口飲用純凈水（反滲透水）、醋酸鉛水溶液、氯化鎘水溶液以及醋酸鉛和氯化鎘混合水溶液，暴露40 d后摘眼球取血，處死小鼠后取睪丸、附睪，稱臟器重量，計(jì)算臟器系數(shù)，進(jìn)行附睪尾精子計(jì)數(shù)。HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)改變，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清睪酮含量。結(jié)果

與對(duì)照組比較，鉛組、鎘組和鉛+鎘組小鼠的飲水量、進(jìn)食量和體重增長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。染毒40 d后，單純鉛、單純鎘暴露或鎘鉛聯(lián)合暴露均未改變小鼠體重、睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)。進(jìn)一步研究表明，與對(duì)照組比較，鉛組、鎘組和鉛+鎘組小鼠附睪精子濃度和血清睪酮均差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)條件下，青春期和成年早期聯(lián)合暴露鉛與鎘未引起小鼠雄性生殖損害作用。

鎘；鉛；小鼠；聯(lián)合染毒；睪丸；睪酮

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.022.html

鉛和鎘是環(huán)境有毒重金屬。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和電子科技發(fā)展，環(huán)境鉛和鎘污染日益加重。環(huán)境中鉛和鎘通過飲水、吸入和飲食等途徑進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。目前，鉛和鎘對(duì)男性生殖健康損害備受關(guān)注，成年雄鼠暴露一定劑量的鉛不僅引起睪丸和附睪重量下降，還引起精子數(shù)量和活力明顯降低，且血清睪酮含量顯著下降［1-2］。研究［3-6］顯示成年雄性大鼠暴露一定劑量的鎘引起血清睪酮含量降低，睪丸病理學(xué)改變，附睪精子數(shù)量和活力均明顯下降。然而，過去研究更多關(guān)注單純鎘或鉛暴露對(duì)生殖內(nèi)分泌的損害，染毒途徑多數(shù)選擇腹腔注射、皮下注射或灌胃等，染毒時(shí)間比較短等，這些問題嚴(yán)重影響早期研究結(jié)果外推到人群實(shí)際暴露引起健康損害的不確定性。該研究主要探討青春期和成年早期經(jīng)飲水聯(lián)合暴露鉛和鎘對(duì)成年小鼠雄性生殖的影響。

1　材料與方法

1.1化學(xué)試劑與配制 醋酸鉛和氯化鎘均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠血清睪酮ELISA試劑盒購于武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；MDF固定液配方為30 ml甲醛溶液、15 ml乙醇、5 ml冰乙酸和50 ml蒸餾水；精子固定液配方為5 g NaHCO3和1 ml甲醛溶液溶于雙蒸水至100 ml。

1.2動(dòng)物來源和處理 清潔級(jí)4周齡雄性ICR小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。小鼠被隨機(jī)分入對(duì)照組、鎘組、鉛組、鉛+鎘組，每組15只。各組小鼠分別經(jīng)口飲用純凈水（反滲透水）、氯化鎘水溶液（100 ppm）、醋酸鉛水溶液（600 ppm），以及氯化鎘和醋酸鉛混合水溶液，鉛鎘混合溶液中氯化鎘終濃度為100 ppm和醋酸鉛終濃度為600 ppm，具體配法為先分別氯化鎘和醋酸鉛儲(chǔ)備液（濃度為10和60 mg/ml），然后按照體積比1∶1用純凈水稀釋配制成上面所述的工作液終濃度。本實(shí)驗(yàn)條件下，鎘和鉛劑量是按照人體暴露量（鉛和鎘攝入量分別約為每天50和300μg）的10倍設(shè)置，鉛和鎘劑量主要參考早期文獻(xiàn)［7-9］的基礎(chǔ)上稍作修改。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食和飲水，測(cè)量飲水量、稱量飼料和稱重。累計(jì)暴露40 d后，所有小鼠摘眼球取血，處死小鼠后取睪丸、附睪，稱雙側(cè)睪丸和單側(cè)附睪重量，計(jì)算臟器系數(shù)（是指100 g動(dòng)物體重其臟器濕重所占比例），進(jìn)行附睪尾精子計(jì)數(shù)，用HE染色法觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)改變，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清睪酮含量。

1.3精子計(jì)數(shù) 按WHO實(shí)驗(yàn)指南第4版精子質(zhì)量評(píng)價(jià)方法［10］檢測(cè)小鼠附睪尾精子數(shù)量。詳細(xì)流程為小鼠單側(cè)附睪尾分離后，立即浸入37℃生理鹽水中，剪碎，使精子充分釋放。37℃恒溫孵育5 min后，按1∶1（50μl+50μl）加精子固定液，混勻10 s；加6μl入計(jì)數(shù)池一側(cè)，將計(jì)數(shù)板放入濕盒中10 min，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在低倍鏡下記錄精子數(shù)量。整個(gè)過程采用雙盲，兩人同時(shí)計(jì)數(shù)，最終結(jié)果取平均值。

1.4血清睪酮濃度測(cè)定 ELISA法檢測(cè)小鼠血清睪酮濃度，具體操作步驟參照ELISA試劑盒說明書。

1.5睪丸組織HE染色 小鼠同側(cè)睪丸被分離后，用改良的Davidson's固定液（MDF）［11］固定，石蠟包埋，4μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察睪丸組織形態(tài)并拍照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)以ˉx±SE表示，多組比較采用方差分析，Bonferroni或Tamhane's T2法進(jìn)行兩組間統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1小鼠飲水和鉛鎘暴露情況 對(duì)照組、鉛組、鎘組和鉛+鎘組小鼠平均每日飲水量分別為6.1、6.6、5.8和6.2 ml，其中鉛組小鼠日平均飲水量高于對(duì)照組（F=3.87，P＜0.05），其余兩組小鼠平均飲水量與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；鉛組和鉛+鎘組小鼠平均每日鉛攝入量分別為3.9和3.5 mg，則40 d每只小鼠總的鉛暴露量分別為234.0、210.0 mg；鎘組和鉛+鎘組小鼠平均每日鎘攝入量分別為0.5和0.6 mg，則40 d每只小鼠總的鎘暴露量分別為30.0、36.0 mg。

2.2小鼠進(jìn)食和體重增長情況 對(duì)照組、鉛組、鎘組和鉛+鎘組小鼠平均每日進(jìn)食量分別為（5.7± 0.5）、（5.4±0.5）、（5.3±0.5）和（6.0±0.6）g，方差分析結(jié)果顯示組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1.23）。隨染毒時(shí)間推進(jìn)，對(duì)照組小鼠體重也在逐漸升高，鎘組和鉛+鎘組小鼠在各個(gè)日齡的體重均與對(duì)照組小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，鉛組小鼠從染毒第4天開始體重較對(duì)照組小鼠有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.05）。見圖1。

2.3小鼠睪丸、附睪重量變化 連續(xù)暴露40 d后，小鼠被剖殺，取小鼠雙側(cè)睪丸和單側(cè)附睪稱重，并計(jì)算睪丸和附睪臟器系數(shù)。與對(duì)照組比較，鉛組和鉛+鎘組小鼠睪丸重量（F=0.24）、附睪重量（F= 0.55）無明顯變化。進(jìn)一步研究表明，單純鉛或鎘暴露、以及鉛鎘聯(lián)合暴露均未引起小鼠睪丸系數(shù)（F =0.75）和附睪系數(shù)（F=0.43）改變。見表1。

圖1　不同日齡小鼠體重變化

2.4小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué) 連續(xù)暴露40 d后，小鼠被剖殺，睪丸組織肉眼包膜完整，外觀未見明顯充血或出血現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠睪丸生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞排列整齊，層次清楚，部分管腔內(nèi)充滿大量成熟精子，單純鉛、單純鎘或鉛鎘聯(lián)合暴露小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)與對(duì)照組近似，未見睪丸內(nèi)充血、生殖細(xì)胞壞死、生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞排列紊亂等組織病理學(xué)改變。見圖2。

表1　小鼠睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)

表1　小鼠睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)

組別睪丸重（g）睪丸系數(shù)附睪重（g）0.25±0.01　0.61±0.03　0.051±0.002　0.24±0.01鉛0.26±0.01　0.64±0.02　0.049±0.001　0.25±0.01鎘0.25±0.01　0.61±0.02　0.048±0.001　0.23±0.01鉛　+鎘附睪系數(shù)對(duì)照0.25±0.01　0.60±0.02　0.050±0.001　0.24±0.01

2.5小鼠血清睪酮含量及附睪精子數(shù)量 與對(duì)照組比較，鉛組和鉛+鎘組小鼠附睪精子數(shù)無變化，鎘組小鼠附睪精子數(shù)有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且鉛+鎘組小鼠附睪精子數(shù)與鉛組或鎘組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步研究顯示，單純鉛或鎘暴露未引起小鼠血清睪酮濃度改變，而鉛與鎘聯(lián)合暴露稍微降低小鼠血清睪酮濃度，但后者與鉛組或鎘組小鼠血清睪酮濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2　小鼠血清睪酮濃度和附睪精子數(shù)

表2　小鼠血清睪酮濃度和附睪精子數(shù)

組別精子數(shù)（106個(gè)/附睪）血清睪酮（ng/ml）15.3±1.7　3.7±0.4鉛15.8±1.0　3.8±0.4鎘14.7±1.7　4.2±0.4鉛+鎘對(duì)照16.5±1.7　3.5±0.3

3　討論

鉛和鎘暴露對(duì)機(jī)體生長發(fā)育的影響尚存在爭議。研究［12］表明成年大鼠連續(xù)15 d給予醋酸鎘（0.025 mg/kg）、醋酸鉛（0.025 mg/kg）或鎘鉛聯(lián)合處理（醋酸鎘和醋酸鉛劑量均為0.025 mg/kg）均未引起雄性大鼠體重改變。隨后另一項(xiàng)研究［7］卻顯示，雄性大鼠連續(xù)90 d經(jīng)飲水暴露氯化鎘（300 ppm）、醋酸鉛（1 000 ppm）或鎘鉛混合液（氯化鎘和醋酸鉛劑量分別為300和1 000 ppm）均引起大鼠體重明顯下降。研究［13］表明孕中期小鼠經(jīng)腹腔單次給予氯化鎘（4.5 mg/kg）后，其胎鼠體重和身長較對(duì)照組明顯降低；雄性ICR小鼠于出生后35～70 d被每日給予氯化鎘（1 mg/kg），其體重較對(duì)照組明顯降低［14］；哺乳期（出生后第1～21天）母體經(jīng)飲水暴露醋酸鉛（200和2 000 ppm）后，兩種劑量的鉛暴露均引起出生后21 d雄鼠體重明顯下降，而只有高劑量鉛暴露引起出生后70 d雄性小鼠體重顯著降低［15］。本研究主要探討青春期和成年早期雄性小鼠連續(xù)40 d經(jīng)飲水給予氯化鎘（100 ppm）、醋酸鉛（600 ppm）或鎘鉛混合液（氯化鎘100 ppm和醋酸鉛600 ppm）處理對(duì)小鼠體重的影響，結(jié)果表明青春期和成年早期小鼠暴露氯化鎘、醋酸鉛或鎘鉛混合液均未引起小鼠體重增長減緩現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不同的原因可能是暴露劑量、暴露途徑、持續(xù)暴露時(shí)間以及動(dòng)物種屬和周齡等不同。上述結(jié)果提示，鉛和鎘暴露對(duì)機(jī)體生長發(fā)育的影響尚需要設(shè)置更多劑量和不同暴露時(shí)間加以確證。

鉛和鎘均是公認(rèn)的雄性生殖毒物，但過去研究更多關(guān)注成年期單純鉛或鎘暴露對(duì)雄性生殖與內(nèi)分泌的影響。研究［12］表明，成年大鼠連續(xù) 15 d給予醋酸鎘（0.025 mg/kg）、醋酸鉛（0.025 mg/kg）或鎘鉛聯(lián)合處理（醋酸鎘和醋酸鉛劑量均為0.025 mg/kg）均引起睪丸和附睪精子數(shù)量明顯減少、附睪精子活力和存活率顯著下降，血清和睪丸睪酮濃度明顯下降，而鎘鉛聯(lián)合處理較單純鉛或鎘處理誘發(fā)的生殖與內(nèi)分泌損害有所減輕。近期研究［7］也表明，成年雄性大鼠連續(xù)90 d經(jīng)飲水暴露氯化鎘（300 ppm）、醋酸鉛（1 000 ppm）或鎘鉛混合液（氯化鎘和醋酸鉛劑量分別為300和1 000 ppm）均引起大鼠睪丸重量明顯下降、附睪精子數(shù)顯著減少以及睪丸組織病理學(xué)改變（睪丸生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞減少、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少等）。第三次全國健康與營養(yǎng)評(píng)價(jià)調(diào)查（NHANES III）結(jié)果顯示，美國青春期女孩全血鉛和尿液鎘濃度均與血清中卵泡發(fā)育相關(guān)的生殖激素抑制素B水平呈負(fù)相關(guān)［16］。然而，人體主要通過職業(yè)或非職業(yè)方式暴露多種環(huán)境因素而引起健康損害。因此，本研究主要探討青春期和成年早期雄性小鼠連續(xù)40 d經(jīng)飲水聯(lián)合暴露鎘鉛混合液（氯化鎘為100 ppm和醋酸鉛600 ppm）對(duì)小鼠雄性生殖與內(nèi)分泌的影響，結(jié)果顯示，青春期和成年早期小鼠暴露氯化鎘、醋酸鉛或鎘鉛混合液均未引起小鼠睪丸和附睪重量下降、睪丸組織形態(tài)學(xué)改變、附睪精子數(shù)量降低以及血清睪酮含量降低。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)條件下，青春期和成年早期暴露一定劑量鎘和鉛未引起成年小鼠雄性生殖功能損害。另外的研究尚需要探討更高劑量或更長暴露時(shí)間下鎘和鉛對(duì)雄性生殖功能的影響。

［1］ Sainath SB，Meena R，Supriya Ch，et al.Protective role of Centella asiatica on lead-induced oxidative stress and suppressed reproductive health in male rats［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2011，32（2）：146-54.

［2］ Priya P H，Reddy P S.Effect of restraint stress on lead-induced male reproductive toxicity in rats［J］.JExp Zool A Ecol Genet Physiol，2012，317（7）：455-65.

［3］ Adamkovicova M，Toman R，CabajM，etal.Effectsof subchronic exposure to cadmium and diazinon on testis and epididymis in rats［J］.Scientific World Journal，2014，2014：632581.

［4］ AsadiM H，Zafari F，Sarveazad A，et al.Saffron improves epididymal sperm parameters in rats exposed to cadmium［J］. Nephrourol Mon，2013，6（1）：e12125.

［5］ Eleawa SM，Alkhateeb M A，Alhashem F H，et al.Resveratrol reverses cadmium chloride-induced testicular damage and subfertility by downregulating p53 and Bax and upregulating gonadotropins and Bcl-2 gene expression［J］.JReprod Dev，2014，60（2）：115 -27.

［6］ Al-Azemi M，Omu F E，Kehinde E O，et al.Lithium protects against toxic effects of cadmium in the rat testes［J］.JAssist Reprod Genet，2010，27（8）：469-76.

［7］ Kumar B A，Reddy A G，Kumar PR，et al.Protective role of NAcetyl L-Cysteine against reproductive toxicity due to interaction of lead and cadmium in male Wistar rats［J］.JNat Sci Biol Med，2013，4（2）：414-9.

［8］ Thijssen S，Maringwa J，F(xiàn)aes C，et al.Chronic exposure ofmice to environmentally relevant，low doses of cadmium leads to early renal damage，not predicted by blood or urine cadmium levels［J］. Toxicology，2007，229（1-2）：145-56.

［9］ Breton J，Le Clère K，Daniel C，et al.Chronic ingestion of cadmium and lead alters the bioavailability of essential and heavymetals，gene expression pathways and genotoxicity in mouse intestine［J］.Arch Toxicol，2013，87（10）：1787-95.

［10］World Health Organization.WHO laboratorymanual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction［M］.4th edition.Cambridge，United Kingdom：Cambridge University Press，1999.

［11］Latendresse JR，Warbrittion A R，Jonassen H，et al.Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid：comparison with Bouin＇s fluid and conventional Davidson＇s fluid［J］.Toxicol Pathol，2002，30（4）：524-33.

［12］Pandya C，Pillai P，Nampoothiri L P，et al.Effect of lead and cadmium co-exposure on testicular steroid metabolism and antioxidant system of adultmale rats［J］.Andrologia，2012，44 Suppl 1：813-22.

［13］徐忠美，王 華，王 振，等.孕期補(bǔ)充鋅減輕鎘引起的小鼠胚胎發(fā)育毒性［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（4）：425-8.

［14］Ji Y L，Wang H，Liu P，et al.Pubertal cadmium exposure impairs testicular developmentand spermatogenesis via disrupting testicular testosterone synthesis in adultmice［J］.Reprod Toxicol，2010，29（2）：176-83.

［15］Wang H，Ji Y L，Wang Q，et al.Maternal lead exposure during lactation persistently impairs testicular development and steroidogenesis inmale offspring［J］.JAppl Toxicol，2013，33（12）：1384 -94.

［16］Gollenberg A L，Hediger M L，Lee P A，et al.Association between lead and cadmium and reproductive hormones in peripubertal U.S. girls［J］.Environ Health Perspect，2010，118（12）：1782-7.

Mice in each group were exposed to pure water（reverse osmosiswater），lead acetate solution，cadmium chloride solution，and themixed solution including lead acetate and cadmium chloride.After exposure of 40 days，blood was collected by removing eyeballs，and thenmicewere killed.The testes，epididymideswere detached and weighted.The organ coefficient of testes and epididymides was counted.Sperm was counted from cauda epididymidis. Testicular histologicalmorphology was evaluated using H&E staining.Serum testosterone concentration was analyzed using enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results No significant difference in water consumption，diet intake，and body weight gain was observed among cadmium，lead，cadmium plus lead co-exposure group and the control group.After exposure of40 days，lead，cadmium or lead plus cadmium did not cause the change of body weight，the weight of testes and epididymides，and organ coefficient of testes and epididymides.Further research showed that no obvious difference in sperm count and serum testosterone concentration was observed among the four groups.Conclusion The present study shows that lead and cadmium co-exposure during puberty and early adulthood does not affectmale reproduction in mice.

Effects of lead and cadm ium co-exposure during puberty and early adulthood on male reproduction in m ice

Zhang Li1，2，Hu Renyi1，Wang Hua1，et al
（1Dept of Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Anatomy，Dept of Basic，West Anhui Health Vocational College，Lu'an 237005）

Objective To observe the effects of lead and cadmium co-exposure through drinking water during puberty and early adulthood on male reproduction in mice.Methods Healthy male ICR mice at 4 weeks were randomly divided into the control，lead，cadmium，lead plus cadmium group.There were 15 mice in each group.

lead；cadmium；mouse；combined exposure；testis；testosterone

R 114

A

1000-1492（2016）05-0659-05

2016-02-18接收

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81473016）；安徽醫(yī)科大學(xué)中青年學(xué)術(shù)骨干資助基金

1安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，合肥230032

2皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部解剖教研室，六安 237005

張 莉，女，碩士研究生；

王 華，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wanghuadev@126.com