Kv1.3在LPS誘導的小鼠急性肝損傷模型中表達變化

周　群，吳寶明，孟曉明，黃　成，李　俊

Kv1.3在LPS誘導的小鼠急性肝損傷模型中表達變化

周群1，2，3，吳寶明1，2，3，孟曉明1，2，3，黃成1，2，3，李俊1，2，3

目的 探討脂多糖（LPS）誘導的小鼠急性肝損傷模型中鉀離子通道蛋白Kv1.3的表達水平。方法 選取C57BL/6小鼠，建立LPS誘導的急性肝損傷模型，采用組織病理學檢查，觀察肝損傷病變，相關試劑盒檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平，免疫組化、熒光實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）及Western blot檢測Kv1.3表達變化；選取原位灌流的方法分離原代肝臟枯否細胞（KCs），檢測Kv1.3的表達變化。體外培養RAW264.7細胞，使用LPS刺激，進一步檢測Kv1.3的表達變化；使用Kv1.3特異性阻斷劑瑪格毒素（MgTx）預處理RAW264.7細胞，再加LPS刺激，采用 qRT-PCR和 Western blot檢測細胞因子的表達變化。結果 組織病理學檢查證實急性肝損傷模型建立成功，模型組的ALT和AST含量均高于正常組（P＜0.01），模型組組織和原代肝臟KCs中Kv1.3表達均低于正常組（P＜0.01），體外實驗LPS刺激RAW264.7細胞后，Kv1.3表達降低（P＜0.05）；Kv1.3特異性阻斷劑MgTx減少LPS誘導的細胞因子的分泌。結論

Kv1.3在急性肝損傷模型中的表達降低，阻斷Kv1.3能減少LPS誘導巨噬細胞炎癥因子的分泌，Kv1.3可能在治療肝臟疾病過程中發揮著重要的作用。

離子通道；急性肝損傷；細胞因子；枯否細胞；T淋巴細胞

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.018.html

急性肝損傷是多種病因（病毒、化學藥品、乙醇、免疫反應等）引起的急性肝臟損害的一種疾病，也可繼發于某些全身性疾病，其發病率較高，目前尚無特效的防治方法。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的免疫性急性肝損傷模型，是目前常用的研究肝臟損傷機制模型。在免疫性肝損傷中，免疫細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞在機體的發病過程中起著重要作用。鉀離子通道蛋白Kv1.3在T淋巴細胞、巨噬細胞活化過程中發揮重要作用，參與多種疾病的發生和發展。該研究通過建立LPS誘導的急性肝損傷模型，觀察急性肝損傷模型Kv1.3的表達變化，體外采用LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7，檢測 Kv1.3的表達變化，同時采用特異性阻斷劑阻斷Kv1.3，檢測對LPS誘導的炎癥細胞因子分泌的影響，探討Kv1.3通道在免疫性急性肝損傷進程中的潛在作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物 40只健康雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，購于安徽醫科大學實驗動物中心。飼養于安徽醫科大學藥學院動物房。

1.2細胞株和細胞培養小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自美國ATCC細胞庫。用DMEM高糖混合培養基（含10%FBS及100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素）于37℃5%CO2環境中培養，細胞為貼壁生長，當細胞生長融合達到80%時，用0.25%胰酶消化液消化傳代或按濃度接種培養瓶培養板，實驗細胞均處于對數生長期。

1.3主要藥品與試劑 LPS購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉移酶（alamine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartateaminotransferase，AST）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液（強）、非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗小鼠IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；ECL發光試劑盒購自美國Thermo公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、Kv1.3、誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗購自美國Abcam公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、β-actin、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）一抗購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol Reagent RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；β-actin、IL-6、Kv1.3、iNOS、IL-1β、TNF-α引物由Invitrogen（上海）公司合成；FBS購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養液購自美國HyClone公司；熒光定量染料SYBR Green購自德國QIAGEN公司。

1.4方法

1.4.1動物模型的建立與處理 C57BL/6小鼠40只，隨機分為正常組（n=20）和急性肝損傷模型組（n=20）。所有小鼠處理前禁食12 h，參照文獻［1-2］，模型組小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS，正常組注射等體積的0.9%NaCl溶液。處理過24 h后，所有小鼠眼球采血，分離血清，測定 ALT、AST活性。取部分肝左葉組織，用10%甲醛溶液固定，剩余肝組織放入液氮速凍，然后轉入-80℃冰箱進行長期保存。

1.4.2KCs提取 參考實驗室提取KCs方法［3］，提取正常組、模型組KCs，進行后續實驗。

1.4.3LPS刺激RAW264.7建立炎癥模型 用1 000 ng/ml LPS溶液刺激RAW264.7細胞24 h，建立炎癥模型。Kv1.3特異性阻斷劑瑪格毒素（MgTx，10 nmol/L）于LPS處理前2 h加入。

1.5檢測指標和方法

1.5.1肝組織形態學HE染色 取10%甲醛溶液固定的肝左葉組織，常規石蠟包埋，切片后脫蠟于蘇木精和伊紅染料中依次染色，封片后于光學顯微鏡下觀察肝組織形態學的變化。

1.5.2ALT、AST活性檢測 小鼠眼球采血，4℃靜置過夜后，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，根據試劑盒說明書，檢測血清血清ALT、AST活性。

1.5.3免疫組化方法檢測Kv1.3蛋白表達 小鼠肝組織經甲醛溶液固定及石蠟包埋后制成2μm厚度的切片，并經多聚賴氨酸處理，將石蠟切片常規脫蠟，滴加3%過氧化氫溶液以抑制內源性過氧化物酶，放置于室溫下孵育15 min。沖洗甩干后浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中，并使用微波爐高火加熱10～15 min，以修復表面抗原，PBS沖洗后加入山羊血清封閉，37℃孵育30 min，再滴加山羊抗大鼠Kv1.3多克隆抗體（1∶500），使用PBS作為陰性對照組，后放置于4℃冰箱中過夜，第2天，將切片放入37℃溫箱中孵育30 min復溫，PBS沖洗甩干后滴加聚合物增強劑，37℃孵育20 min，PBS沖洗后加入辣根酶標記山羊抗小鼠IgG多聚體，30℃孵育30 min，PBS沖洗甩干后應用DAB顯色。

(2) 深入開展CFRP基礎性研究。軌道車輛對材料的力學性能、環保性能、防火性能、抗沖擊性能、耐極端環境性能、耐老化性能、隔音隔熱性能、減振阻尼性能、電磁兼容性、生命周期環境友好性以及安全可靠性等都有特殊要求，開展滿足軌道車輛應用的材料性能研究，解決目前復合材料存在的防火、隔聲隔熱、抗沖擊性能局限性，可大大提高復合材料的應用廣度。

1.5.4實時定量RT-PCR 檢測Kv1.3及細胞因子的表達應用TRIzol試劑盒提取肝組織、原代提取KCs、細胞株RAW264.7中總RNA，并測定其濃度和純度，并要求吸光度（absorbance，A）值A260/A280為1.8～2.0，并調整RNA濃度至1 mg/L，采用一步法RT-PCR試劑盒反轉錄cDNA。

表1　基因引物序列

1.5.5Western blot檢測Kv1.3及細胞因子蛋白表達 使用RIPA裂解液提取肝組織、原代KCs和RAW264.7細胞，裂解充分后，用移液管將勻漿液轉移至1.5 ml EP管中，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液；使用BCA試劑盒進行蛋白定量檢測，各組上清液用裂解液調至相同蛋白濃度，加入5 ×SDS蛋白上樣緩沖液，100℃沸水煮10 min，進行SDS-PAGE電泳并轉膜于PVDF膜上，PVDF膜用含5%脫脂牛奶室溫置于水平搖床封閉3 h。然后依次滴加1：500的鼠抗Kv1.3、兔抗TNF-α、抗IL-6和βactin抗體，4℃孵育過夜后TBST洗滌3次，每次15 min，使用1∶10 000山羊抗鼠/兔二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。最后用ECL發光液進行曝光顯影，Bio-Rad照相系統拍照，并用Image-J軟件分析蛋白的相對表達量。

1.6統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析，計量資料以ˉx±s表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組均數比較采用One-Way ANOVA法。

2　結果

2.1鼠肝組織及血清相關檢測結果

2.1.1 兩組小鼠的肝組織病理學檢查比較 光鏡下觀察，正常組肝臟組織形態正常，肝小葉結構清楚；模型組可見大量肝細胞壞死，肝小葉結構模糊，組織匯管區充血，周邊出現炎性細胞浸潤及大小不等的空泡樣變，肝細胞混濁腫脹、邊界不清、胞質疏松淡染。見圖1。

2.1.2兩組小鼠血清ALT、AST活性結果 檢測血清中酶的活性的改變可以反映肝臟的功能情況，當肝細胞受損時，肝細胞內的ALT、AST釋放入血，血清ALT、AST活性會升高。因此，這兩種酶的活性升高成為肝功能受損的特異性指標。結果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著升高，與正常組相比，差異有統計學意義（t=8.020、5.033，P＜0.01）。見圖2。

圖1　鼠肝臟組織形態學染色 HE×200A：正常組；B：模型組

圖2　正常組與模型組ALT、AST結果與正常組比較：**P＜0.01

2.1.3免疫組化法檢測肝組織Kv1.3蛋白表達情況 免疫組化結果顯示，與正常組相比，模型組肝組織Kv1.3蛋白表達明顯減少，見圖3。

圖3　免疫組化法標記肝組織　Kv1.3的表達 SP×200A：正常組；B：模型組

2.1.4實時熒光定量RT-PCR的相對定量結果采用qRT-PCR檢測正常組和模型組肝組織中Kv1.3及各細胞因子mRNA表達水平，結果顯示，模型組肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平顯著升高（t=10.03、9.811、14.88，P＜0.01），Kv1.3 mRNA水平降低（t=3.353，P＜0.05）。見圖4。

2.1.5兩組間Kv1.3、TNF-α、IL-6蛋白表達量的比較 Western blot結果顯示，與正常組相比，模型組肝組織細胞因子TNF-α（t=9.532，P＜0.01）、IL-6（t=3.663，P＜0.05）蛋白表達水平升高，Kv1.3蛋白表達水平顯著降低（t=5.941，P＜0.01）。見圖5。

2.2原代KCs中 Kv1.3、TNF-αm RNA的表達qRT-PCR結果顯示，模型組提取的KCs中TNF-α mRNA表達顯著高于正常組（t=4.886，P＜0.01）。模型組Kv1.3 mRNA表達顯著低于正常組（t= 14.35，P＜0.01）。見圖6。

2.3體外LPS誘導RAW 264.7細胞Kv1.3的表達模型組為采用1 000ng/ml LPS刺激RAW264.7細胞24 h，qRT-PCR結果顯示，與正常組相比，模型組Kv1.3mRNA的表達降低，與正常組相比，差異有統計學意義（t=4.583，P＜0.05）。見圖7。

2.4M gTx抑制LPS誘導RAW 264.7細胞因子的分泌

2.4.1實時熒光定量RT-PCR的相對定量結果qRT-PCR結果顯示，MgTx預處理后，LPS誘導的細胞因子iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表達水平降低，與模型組比較，差異有統計學意義（F=168.2、862.9、596.7、61.11，P＜0.05，P＜0.01）。見圖8。

2.4.2MgTx抑制LPS誘導的RAW264.7細胞因子分泌的蛋白 Western blot結果顯示，MgTx預處理后，LPS誘導的細胞因子分泌與LPS模型組相比，iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（F=377.3、109.5、115.0、20.44，P＜0.05，P＜0.01）。見圖9。

圖4　肝組織各細胞因子及　Kv1.3 mRNA表達水平與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖5　肝組織各細胞因子及　Kv1.3蛋白表達與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖6　原代KCs中Kv1.3、TNF-αmRNA表達水平與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

3　討論

急性肝損傷是易發和常見的肝臟疾病，而內毒素血癥是引起肝損傷的主要病因，因此內毒素誘發急性肝損傷模型的建立對基礎科研和臨床用藥研究有重要意義。嚙齒類動物腹腔內單獨應用LPS或與肝毒素共同作用建立肝臟急性炎癥損傷模型，已被廣泛應用［4］。本實驗采用腹腔注射10 mg/kg LPS作用24 h后，收集血清和肝臟組織。組織病理學HE染色驗證模型建造成功，血清ALT/AST活性的測定反映了肝細胞損害和壞死的程度。

圖7　Kv1.3 mRNA表達水平與正常組比較：*P＜0.05

文獻［5］報道，CD4+T淋巴細胞及其分泌的細胞因子如TNF、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）有促肝臟損傷作用，同時在自身免疫性肝臟疾病中，T淋巴細胞介導的免疫炎癥顯著促進此類肝臟疾病中肝臟損傷的發生和進展［6］。在參與炎性反應的細胞中，T淋巴細胞活化為CD8+和CD4+T細胞，通過分泌IL-1β、IFN-γ、TNF-α等細胞因子，進一步激活肝臟KCs，在這些細胞因子及相關黏附分子的介導下引起免疫炎癥反應導致肝細胞及組織損傷［7］。KCs是肝內定居的巨噬細胞，在炎癥和防御的過程中起重要作用。LPS可通過受體激活NF-κB，使肝臟KCs釋放內源性致炎細胞因子，在免疫性肝損傷中發揮著重要作用。

細胞膜上離子通道電生理活性，對于細胞的活化、細胞因子的分泌、細胞的增殖等起著重要作用。正常大鼠腹腔巨噬細胞鉀離子通道電生理特性證實了巨噬細胞表達不同的功能性鉀離子通道蛋白亞型［8］。文獻［9-10］報道，Kv1.3對巨噬細胞生理功能調節起著重要作用，影響細胞增殖和細胞因子分泌。Kv1.3通道屬于電壓門控鉀通道Shaker家族，是由約500個氨基酸的亞單位非共價結合形成的同源四聚體，是巨噬細胞主要表達的鉀離子通道亞型。Kv1.3在動脈粥樣硬化［11］、胰腺癌［12］、乳腺癌［13］等疾病中異常表達，已成為疾病治療的重要靶點。

圖8　MgTx抑制　LPS誘導的　RAW264.7細胞因子分泌的　mRNA表達與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

鑒于Kv1.3在巨噬細胞及許多疾病中都起著重要作用，而Kv1.3在肝臟損傷方面暫無研究，為此本課題組設計探討Kv1.3在免疫性肝損傷中的作用。結果顯示，Kv1.3在LPS誘導的小鼠急性肝損傷模型中表達降低，提示Kv1.3的異常表達可能參與急性肝損傷的發生發展過程。體外實驗證實Kv1.3特異性阻斷劑MgTx能減少LPS誘導的RAW264.7細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，同時發現，MgTx能減少 iNOS生成，抑制 NO釋放減少［14］。進一步提示Kv1.3參與急性肝損傷過程，可能與調節KCs細胞因子的分泌有關。在肝損傷過程中，TNF-α、IL-6、IL-1β等細胞因子可造成炎性細胞浸潤及肝細胞損傷壞死，最終導致肝臟病變，阻斷Kv1.3能減少KCs細胞因子分泌，表明Kv1.3在急性肝損傷過程中發揮著重要作用。

圖9　M gTx抑制　LPS誘導的　RAW 264.7細胞因子分泌蛋白表達與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

鑒于Kv1.3在肝臟KCs活化過程中所扮演的角色，而KCs正是免疫性急性肝損傷重要的免疫細胞，Kv1.3將有可能成為免疫性肝損傷防治的重要靶點。

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Expression profile of voltage-gated potassium channel Kv1.3 in LPS-induced acute liver injury

Zhou Qun1，2，3，Wu Baoming1，2，3，Meng Xiaoming1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，AnhuiMedical University，2Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University，3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To investigate the expression profile of voltage-gated potassium channel Kv1.3 in lipopo-lysaccharide（LPS）-induced acute liver injury.Methods C57BL/6 mice were injected with LPS intraperitoneally for 24 h，to establish themodel of acute liver injury.Themorphological changes of liver tissueswere observed by HE staining.Alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）levels weremeasured using test kits.The Kv1.3 expression was measured by immunohistochemistry，Florescent real-time quantitative RT-PCR（qRT-PCR）and Western blot.Kupffer cells（KCs）were isolated by in situ perfusion，and then applied to detect Kv1.3，tumor necrosis factor alpha（TNF-α）expression by qRT-PCR.The expression of Kv1.3 was also detected in LPS-stimulated RAW264.7 cells.Margatoxin（MgTx）was pretreated to block Kv1.3 in LPS-stimulated RAW264.7 cells，then detected the expression of cytokines by qRT-PCR and Western blot.Results HE staining showed that liver tissueswere damaged by LPS，ALT and AST levels increased significantly after LPS treatment（P＜0.01）.The Kv1.3 expression decreased significantly inmodel group compared to normal group（P＜0.01）.Kv1.3 was low expressed in KCs in LPS-inducedacute liver injury model group（P＜0.01）.LPS-stimulated RAW264.7 cells expressedlow level of Kv1.3（P＜0.05），and MgTx，the Kv1.3 specific blocker，decreased LPS-induced cytokynesis secretion.Conclusion The results indicate that Kv1.3 is low expressed in LPS-induced acute liver injury and blocking of the Kv1.3 channel decreases LPS-induced cytokynesis secretion inmacrophage.Kv1.3 may play an important role in the treatment of liver diseases.

ion channel；acute liver injury；cytokynesis；Kupffer cells；T lymphocyte

R 967；R 965.2

A

1000-1492（2016）05-0649-07

2016-02-22接收

國家自然科學基金（編號：81273526、81473268、81500473）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042212）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH145）

安徽醫科大學1藥學院、2肝病研究所，3安徽省創新藥物

產業共性研究院，合肥 230032

周 群，男，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn