Toll樣受體10基因rs10004195位點多態性與Hp感染以及相關疾病的關系

舒　穎，張平安，童永清

Toll樣受體10基因rs10004195位點多態性與Hp感染以及相關疾病的關系

舒穎，張平安，童永清

目的 探討Toll樣受體10（TLR10）基因rs10004195位點多態性與幽門螺桿菌（Hp）感染以及相關疾病的關系。方法 收集行胃鏡活檢的患者652例，同時采集患者外周血標本。采用免疫膠體金法檢測患者外周血中Hp抗體，DNA直接測序方法檢測TLR10基因rs10004195位點基因型。結果 TLR10基因rs10004195位點AA、TT和AT基因型分別為30.98%、20.71%、48.31%；Hp抗體陽性組TT基因型頻率明顯高于Hp抗體陰性組（P＜0.05）。Hp抗體陽性組中各疾病組與對照組基因型分布的比較，以及Hp抗體陰性組中各疾病組與對照組基因型分布的比較，差異均無統計學意義。結論 TLR10基因rs10004195位點多態性與Hp感染有易感相關性，而與Hp感染相關疾病無相關性。

Toll樣受體10基因；單核苷酸多態性；幽門螺桿菌

R 735.2

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.054.html

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是人類最常見的慢性感染之一，不同的人群中，感染率有所不同，我國人群感染率為20%～80%［1］。個體感染Hp后也并非全都發病，部分可能僅為Hp抗體陽性，而無任何病癥，且Hp感染后所表現的疾病類型也不盡相同，Hp感染患者最終大約只有1%～2%會發展為胃癌［2］，不同個體針對Hp感染產生不同程度的生理病理反應，這可能與細菌毒力、環境因素以及宿主本身的遺傳易感性密切相關。近年來，宿主的遺傳易感性在Hp的感染中的作用備受關注。IL-1B基因C-31T［3］以及FCGR2A基因rs368433位點［4］等基因多態性與Hp感染有易感相關性，其他一些基因多態性位點與Hp感染的相關目前也有研究。該研究擬探討TLR10基因rs10004195位點基因多態性與Hp感染以及Hp感染所致相關疾病的關系。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集2012年12月～2014年7月在武漢大學人民醫院內鏡中心進行胃鏡活檢的就診患者652例。其中男416例，女236例，年齡17～73（46.8±6.3）歲。根據胃鏡及活組織病理學診斷，胃癌患者146例，消化道潰瘍患者90例，非萎縮性胃炎患者140例，胃黏膜組織正常者276例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，研究對象均簽訂知情同意書。

1.2試劑與儀器 全血基因組DNA提取試劑盒（上海萊楓公司）；瓊脂糖（英國OXIOD公司）；DNA marker DL 2000（日本TaKaRa公司）；PCR試劑盒（深圳富酶泰斯生物技術有限公司）；胃Hp抗體檢測試劑盒（深圳市惠安公司）；ABI 9700基因擴增儀、測序所用試劑和ABI 3130測序儀（美國Applied Biosystem公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一公司）；凝膠成像系統（SYNGENE公司）。

1.3標本的采集 采集所有研究對象空腹靜脈血3 ml，取1 ml，3 000 r/min離心5 min，分離出血清，-20℃保存備用；2ml置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝試管中充分混勻，-20℃保存備用。

1.4Hp抗體檢測 采用免疫膠體金法，按照Hp抗體檢測試劑盒說明書操作進行Hp抗體檢測，靈敏度92.3%，特異性97.7%。

1.5基因組DNA提取 取EDTA-Na2抗凝血200 μl，按照因組DNA提取試劑盒說明書操作提取外周血基因組DNA，操作過程參照試劑盒使用說明書。所提取基因組DNA于-20℃保存備用。

1.6rs10004195位點基因型的檢測 參照Genbank中TLR10基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物。上游引物：5′-TTGCACTCTCTCAGCAGAGCT-3′，下游引物：5′-GACATTTGCGGGACT GAGAA-3′，擴增目的片段為376 bp。PCR總擴增體系為20μl：mix 10μl，diH2O 7μl，DNA 2μl，10 μmol/L引物1μl。擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，30

2016-02-22接收

1.7統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析。檢測數據采用百分比表示，基因型和等位基因型頻率的比較，以及是否符合Hardy-Weiberg遺傳平衡采用Χ2檢驗。關聯程度用OR值（95%CI）表示。

2　結果

2.1Hp抗體檢測結果 胃癌患者Hp抗體陽性率為71.2%（104/146），消化道潰瘍患者為86.7%（78/90），慢性非萎縮性胃炎患者為68.6%（96/ 140），胃黏膜組織正常者為50.7%（140/276）。

2.2TLR10基因rs10004195位點基因型分析 經PCR擴增后，所得目的條帶片段大小為376 bp，見圖1。對 652例DNA樣本進行分析，TLR10基因rs10004195位點AA、TT和AT基因型分別為30.98%（202/652）、20.71%（135/652）、48.31%（315/ 652），其中 Hp陽性組AA、TT和 AT基因型分別為31.10%（130/418）、23.44%（98/418）、45.46%（190/ 418），Hp陰性組AA、TT和AT基因型分別為30.77%（72/234）、15.81%（37/234）、53.42%（125/ 234）?？側后w、Hp陽性組以及 Hp陰性組各基因型的分布均符合Hardy-Weiberg遺傳平衡定律（Χ2= 0.35、3.06、2.02，P＞0.05），具有群體代表性。3種基因型測序結果見圖2。

圖1　PCR產物電泳結果M：Marker

圖2　rs10004195位點3種基因型測序圖A：AA型；B：TT型；C：AT型；箭頭示多態性位點

2.3TLR10基因rs10004195位點多態性與Hp感染及相關疾病的關系 胃癌組、消化性潰瘍組、非萎縮性胃炎組以及胃黏膜組織正常組TLR10基因rs10004195位點基因型的分布均符合Hardy-Weiberg遺傳平衡定律（Χ2=1.53、0.11、0.24、0.02，P＞0.05）。TLR10基因rs10004195位點各基因型在Hp抗體陽性組和陰性組中的分布差異有統計學意義（Χ2=6.2，P=0.04）；Hp抗體陽性組TT基因型頻率明顯高于Hp抗體陰性組，差異有統計學意義（Χ2=5.32，P=0.02，OR=1.63，95%CI：1.07～2.48）。Hp抗體陽性組中各疾病組與正常組基因型分布的比較以及Hp抗體陰性組中各疾病組與正常組基因型分布的比較差異均無統計學意義，見表1。

表1　Hp抗體陽性組中以及陰性組各疾病組與正常組基因型分布的比較

3　討論

Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）是近年來發現的在抗病原微生物免疫防御反應中起重要作用的受體蛋白，能通過識別細菌、病毒等病原體的相關模式分子，啟動天然免疫和調節免疫反應，在聯系天然免疫和獲得性免疫中也起著橋梁的作用。至今為止，在哺乳動物中已經發現的TLRs家族成員有13種，其中在人類中發現的為TLR1～TLR10［5］。TLR10基因位于染色體4p14（第4染色體短臂1區4帶），有 4個外顯子，mRNA全長 3 990 bp（NM＿030956.3），由于缺少嚙齒類動物模型，目前對TLR10基因的研究甚少，其功能以及內外源性配體仍不是很清楚。文獻［6-7］報道，TLR10基因高表達于淋巴組織系統，如脾臟、淋巴結、胸腺和扁桃體等，可能作為一種易感因素參與了人類感染以及免疫性疾病的發生。研究［8］證實，TLR10基因啟動子區rs10004195位點基因多態性與兒童IgA腎病有易感相關性。

該位點總群體3種基因型分布的頻率與亞洲地區日本人群以及歐洲地區人群的分布差異都較大，而Hp陰性組3種基因型的分布頻率與中國北京人群的分布相類似（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/SNP/snp＿ref.cgi？rs=10004195），表明不同人種中rs10004195位點各基因型分布存在很明顯的差異。本研究顯示TLR10基因rs10004195位點各基因型在Hp抗體陽性組和陰性組中的分布差異有統計學意義，與Mayerle et al［4］通過全基因組關聯分析得出的結論相一致，并且通過測序的方法檢測出TLR10基因rs10004195位點TT基因型頻率在Hp抗體陽性組中明顯高于Hp抗體陰性組，表明rs10004195位點TT基因型可能為人群感染Hp的易感因素，但確切的作用機制目前尚不清楚，有待進一步的研究。除此之外，本文還比較了rs10004195位點Hp抗體陽性組各疾病組與對照組基因型分布以及Hp抗體陰性組各疾病組與對照組基因型分布，顯示Hp抗體陽性組以及陰性組中疾病組與對照組相比較差異均無統計學意義，表明rs10004195位點單核苷酸多態性可能與胃癌、消化道潰瘍以及慢性萎縮性胃炎的發生不存在相關性。

綜上所述，本研究得出結論TLR10基因rs10004195位點TT基因型與Hp感染有易感相關性，表明了宿主的遺傳因素在Hp的感染過程中發揮了重要的作用，但確切的作用機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

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Association of rs10004195 single nucleotide polymorphisms in Toll like receptor 10 gene with helicobacter pylori infection and associated diseases

Shu Ying，Zhang Pingan，Tong Yongqing
（Dept of Laboratory Science，Renmin Hospital ofWuhan University，Wuhan 430060）

Objective To investigate the association of rs10004195 single nucleotide polymorphisms in Toll like receptor 10（TLR 10）gene with helicobacter pylori infection and associated diseases.Methods A total of 652 patients who has been examined by gastroscopy were obtained，and then peripheral blood sampleswere collected from all the patients.Immune colloidal gold method was used to test the serological Hp antibody of all the patients.TheTLR10 gene rs10004195 polymorphismswere examined by direct DNA sequencing of the PCR products.Results The frequencies of AA，TT and AT genotype on TLR10 rs10004195 were 30.98%，20.71%，48.31%；there was significant difference between Hp antibody positive group and Hp antibody negative group in the TT frequencies of TLR10 rs10004195（P＜0.05）.No significant difference between controls and Hp associated diseases groups in Hp antibody positive group or in Hp antibody negative group were observed.Conclusion There was correlation between the TLR10 rs10004195 locigenotype and the risk of Hp infection，but no correlation with Hp associated diseases.

Toll like receptor 10 gene；single nucleotide polymorphism；helicobacter pylori

A

1000-1492（2016）05-0728-04

國家臨床重點?？平ㄔO項目（編號：財社［2010］305）

武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060

舒 穎，女，技師；

張平安，男，主任技師，責任作者，E-mail：zhangpingan@ aliyun.com個循環；最后72℃延伸10 min。取10μl PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化上述DNA條帶，最后在ABI 3130測序儀上進行測序分析。