應用微陣列比較基因組雜交技術探討顱部神經管畸形與基因組拷貝數變異的相關性

汪　靜，郭　柳，蔡春泉，陳曉麗，謝　華，趙慧智，吳佰林，張　霆，姜　宏

應用微陣列比較基因組雜交技術探討顱部神經管畸形與基因組拷貝數變異的相關性

汪靜1，郭柳2，蔡春泉3，陳曉麗4，謝華4，趙慧智5，吳佰林6，張霆4，姜宏1

目的 應用微陣列比較基因組雜交技術（Array-CGH）對顱部神經管畸形及正常流產胚胎進行基因組拷貝數變異（CNVs）篩查，探討基因組CNVs在顱部神經管畸形中的致病作用。方法 在倫理同意基礎上，采集51例顱部神經管畸形胚胎（病例組）和75例正常流產胚胎（對照組），運用高分辨率芯片篩查全基因組CNVs，針對所發現的基因組CNVs，利用國際基因組CNVs多態性數據庫過濾去除良性多態性CNVs，然后根據其是否包含參考基因將其分別命名為非多態性CNV、非多態性genic CNV及非多態性ciliogenic CNV，應用Χ2檢驗對以上基因組CNVs與顱部神經管畸形的相關性進行分析。結果 病例組和對照組分別檢測到48和33個非多態性CNVs，其中分別有37和26個為非多態性genic CNVs。病例組內含非多態性CNVs和非多態性genic CNVs的樣本比例均顯著高于對照組（52.9%vs32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05），其中非多態性genic CNVs導致顱部神經管畸形發生風險增加2.644倍（OR=2.644）。結論 全基因組CNVs研究的證據表明，基因CNVs是顱部神經管缺陷的危險因素。

微陣列比較基因組雜交；顱部神經管畸形；基因組拷貝數變異

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.034.html

神經管畸形（neural tube defect，NTDs）是一類常見的嚴重出生缺陷，由胚胎發育早期神經管閉合失敗或閉合不完全引起。NTDs是造成孕婦流產、死胎、死產和嬰幼兒終身殘疾的主要原因之一。最新統計，中國NTDs的發病率接近2.74‰，其中在山西省NTDs的發病率最高，可達13.87‰～19.94‰［1］。NTDs是一種復雜性疾病，是環境和遺傳因素共同作用的結果。研究［2］顯示人類NTDs中約70%是由遺傳因素所致。NTDs同胞發生NTDs的危險性是普通人群的50倍［3］。近年來通過對小鼠及其他NTDs動物模型的研究發現了大量NTDs相關候選基因，但迄今為止僅證實MTHFR基因多態性和平面細胞極性（PCP）核心基因的致病性突變與人類NTDs的發生相關［4］。拷貝數變異（copy number variations，CNVs）是基因組多態性的一種重要形式，在人類表型多樣性以及人類對疾病的易感性方面具有重要作用。人類基因組CNVs與人類出生缺陷疾病相關，如先天性心臟病［5］。另一方面，利用傳統的染色體核型分析確定6.5%～9.7%NTDs胎兒存在染色體異常［6］。這些表明基因組失衡是NTDs的遺傳基礎之一。過去由于傳統的染色體核型分析分辨率低，不能明確哪一個區域與NTDs發生相關。該研究應用高分辨的基因組芯片技術（microarray comparative genomic hybridization，Array-CGH）對顱部神經管畸形及正常流產胚胎進行基因組CNVs篩查，探討基因組CNVs在顱部神經管畸形中的致病作用。

1　材料與方法

1.1病例資料 采用病例對照研究，收集2004年3月～2009年4月在山西省呂梁地區醫院因死胎或畸形引產的無腦畸形和腦膨出胚胎為病例組，同時采集因非醫學原因流產的正常胚胎為對照組。胎齡、胚胎的總體發育情況及胚胎B超檢查數據由當地有經驗的婦產科醫師記錄。NTDs的病理診斷由有經驗的病理學專家根據國際疾病分類執行。對照組進行常規的產前檢查，問卷調查和尸體解剖，帶有其他病理性畸形或宮內生長發育受限的胚胎被排除。本研究通過首都兒科研究所倫理委員會批準，并獲得父母知情同意。

1.2實驗方法

1.2.1DNA制備 無腦畸形胚胎選擇頭顱內剩余腦組織或者脊髓組織提取基因組DNA，腦膨出胚胎選擇腦組織提取基因組DNA，采用DNeasy Blood& Tissue kit試劑盒（德國 QIAGEN公司）提取DNA。取2.0μl已提取的基因組DNA，應用紫外分光光度儀NanoDrop2000（美國 Thermo Fisher公司）測量DNA濃度，計算基因組DNA含量。

1.2.2Array-CGH 嚴格按照Agilent寡核苷酸Array-CGH試劑盒說明書進行操作。取3～6μg DNA于50μl體系，37℃下AluⅠ和RsaⅠ聯合消化2 h，QIAprep Spin Mini prep Kit進行DNA純化，重新測定濃度值后，取2 500 ng DNA，用Bio Prime labeling kit進行熒光標記（cy 5標記對照DNA，cy 3標記待測DNA），37℃、2 h后終止反應；再次MicroCon YM-30純化熒光標記 DNA后，將參考DNA和本研究標本DNA等量混合后加入雜交體系，94℃變性3 min，37℃孵育0.5 h，上樣到Oligo244 K芯片上，65℃雜交爐孵育72 h后先用洗脫液1洗脫5 min，再用洗脫液2洗脫1 min，迅速進行微陣列掃描，采用Feature Extraction 9.0進行數據提取至DNA Analystic 5.0軟件進行全基因組CNVs分析。實驗儀器和試劑均購自美國Invitrogen公司和美國Agilent公司，男女性對照DNA樣本購自美國Invitrogen公司。

1.2.3NTDs相關CNVs評估方法 Feature Extraction 9.0獲取探針雜交結果并分析染色體重復或缺失片段，查詢國際基因組拷貝數變異多態性數據庫（database of genomic variants，DGV，http：//projects. tcag.ca/variation/），若檢測的CNV與數據庫沒有重疊或重疊少于20%，則認為這是個非多態性CNV；若非多態性CNV中包含一個及以上的基因或基因的外顯子區域則認為這是個非多態性genic CNV，若非多態性genic CNV中存在纖毛基因則認為這是個非多態性ciliogenic CNV（圖1）。

1.2.4NTDs相關CNVs的驗證方法 long-range PCR驗證雜合缺失：挑選3個基因組缺失，通過primer 3設計多個斷點特異性引物進行擴增（Platinum PCR SuperMix High Fidelity kit，美國Invitrogen公司），對最終得到大小為1 000～2 000 bp擴增產物進行sanger測序。real-time定量PCR驗證重復：挑選1個基因組重復，通過primer 3在CNV的兩側和中間部分設計引物進行擴增，正常男性為對照，每個反應重復3次（美國Applied Biosystems公司）。見表1。

1.3統計學處理 應用SPSS 10.0軟件進行分析，計數資料的組間比較采用Χ2檢驗。

2　結果

2.1研究對象的一般情況 共收集51例無腦畸形和腦膨出胚胎為病例組，其中男25例，女26例，均為散發NTDs，無家族病史。75例正常流產胚胎為對照組，其中男38例，女37例。病例組與對照組性別分布差異無統計學意義（P=0.856）。

2.2Array-CGH結果及數據比對分析 針對軟件所篩查出的基因組CNVs，首先對兩組的全基因組CNVs數目、全基因組CNVs平均長度進行對比分析（圖2、3），病例組與對照組之間差異無統計學意義。接著利用國際基因組拷貝數變異多態性數據庫，過濾去除良性多態性CNVs，27個顱部 NTDs胚胎中發現48個非多態性CNVs，24個正常流產胚胎中發現33個非多態性CNVs。病例組與對照組非多態性CNVs無重疊。對于以上發現的非多態性CNVs，比對美國波士頓兒童醫院臨床分子診斷實驗室芯片數據庫和首都兒科研究所實驗室300個智力低下及正常父母的CNVs數據庫，均未發現重復，說明病例組非多態性CNVs屬于罕見或顱部NTDs特有的。其中有63個非多態性CNVs為非多態性genic CNVs，病例組和對照組分別包含37和26個。隨機挑選4個非多態性genic CNVs用PCR方法驗證，結果與Array-CGH相符。病例組平均每個樣本攜帶非多態性CNVs數目是對照組2.14倍（0.94 vs 0.44），非多態性genic CNVs數目是對照組2.06倍（0.72 vs 0.35）。病例組含非多態性CNVs和非多態性genic CNVs的樣本比例均顯著高于對照組（52.9%vs 32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05），并且非多態性genic CNVs比非多態性CNVs的差異更顯著（0.010 vs0.019）。非多態性CNVs導致NTDs發生風險增加2.391倍［比值比（odd ratio，OR）= 2.391，95%置信區間（confidenceinterval，CI）：1.148～4.977］，非多態性genic CNVs導致NTDs發生風險增加 2.644倍（OR=2.644，95%CI：1.248～5.601）。同時比較樣本攜帶非多態性CNVs和多態性genic CNVs的平均長度，病例組與對照組之間差異無統計學意義。

表2　病例組和對照組　CNVs比較分析

圖3　病例組與對照組CNV平均長度比較A：病例組；B：對照組

圖3　病例組與對照組CNV平均長度比較A：病例組；B：對照組

病例組攜帶的非多態性genic CNVs中共發現77個基因，是對照組的1.75倍（77 vs 44），見表2。尤其，在77個基因內，發現一個microRNA-miR223（圖4）。另外有7個基因是已報道的NTDs候選基因的同源基因（表3），提示NTDs特有非多態性genic CNVs中某些基因可能是部分NTDs的致病原因。CALR基因缺陷型小鼠具有NTDs表型，本研究中CALR3缺失（圖5）患者表型有無腦畸形，具有表型一致性。同時發現18例樣本攜帶非多態性ciliogenic CNVs，但病例組和對照組間的非多態性ciliogenic CNVs的樣本數差異無統計學意義（P= 0.054）。

圖4　Array-CGH顯示一例顱部NTDs患者攜帶m iR223重復

圖5　Array-CGH顯示一例顱部　NTDs患者攜帶　CALR3基因缺失

表3　已報道神經管畸形候選基因的同源基因

3　討論

NTDs是胎兒致死及致殘的常見病因，明確其病因對治療、隨訪以及再次生育風險咨詢均有重要意義。CNVs一般指長度為1 000 bp以上的基因組大片段的拷貝數增加或者減少，是引起人類遺傳和表型多樣性的重要因素之一。研究［6］表明采用細胞遺傳學方法即染色體核型分析方法進行產前診斷的顱部NTDs中發現6.5%存在染色體異常，其中三體型最常見。但通過染色體核型分析檢測出的基因組失衡片段都在5×106bp以上，不利于定位NTDs致病基因。Array-CGH技術具有自動化、高通量、高密度探針等特點，可以篩查小于5×105bp，甚至1× 104bp的基因組微失衡，從而可以發現片段更小的NTDs相關CNVs，便于尋找新的NTDs致病基因。經過檢測與分析，本研究所有樣本攜帶的CNVs均小于3×106bp，大部分集中于1×105～5×105bp之間，且未發現三體型。而西方國家NTDs患者中相當一部分攜帶大片段染色體異常，包括三體型［6］。這種現象可能提示山西地區和以往研究病例采集地區之間存在遺傳差異。同時在病例組發現一類非多態性CNVs，以往未見報道，并且在非NTDs的智力低下患者CNVs數據庫中未發現，表明該類CNVs是顱部NTDs特有的，對發現NTDs致病基因至關重要。由于缺少父母樣本，無法評估這些非多態性CNVs是否為新生。故采用病例-對照研究方法，對病例組和對照組樣本攜帶非多態性CNVs的數目進行比較，特別是非多態性genic CNVs，發現顱部NTDs患者存在非多態性genic CNVs富集現象。但本研究沒有在病例組內發現像16p11.2這樣的再發性基因組（recurrent CNV）［10］。

本研究對非多態性genic CNVs內基因進一步研究，病例組有1例樣本攜帶非多態性genic CNV重復，其中包括miR223基因。miRNA是一類廣泛存在于真核系統中的非編碼小RNA，在基因表達和基因調控的整個過程中起重要作用。Chen et al［11］在研究造血系統分化相關的miRNA時首次發現miR223，并且在骨髓中優勢表達。隨后，相關文獻［12］報道miR223與造血系統增殖分化密切相關，如髓系祖細胞增殖和招募紅系祖細胞及維持其干性等；miR223異常表達與免疫系統疾病/血液系統及實體性惡性腫瘤相關，如風濕性關節炎，急性淋巴細胞白血病，胃癌等。目前尚未見miR223與神經發育相關的報道。本研究首次在NTDs患者中發現該基因，提示miR223可能在神經管發育方面起重要作用。

同時發現1例NTDs樣本攜帶非多態性genic CNV缺失，其中包括CALR3基因。CALR3屬于鈣網蛋白基因。目前研究［13］證實CALR3突變（R73Q/K82R）可導致肥厚性心肌病的發生。對其同源基因CALR研究［7］顯示，50%的CALR基因敲除小鼠有心肌病的表型，16%有無腦兒表型。CALR3呈顯性遺傳模式，目前發現的變異均為新發突變。本研究該樣本為無腦兒，因缺少父母樣本，無法排除其父母來源。但在美國波士頓兒童醫院臨床分子診斷實驗室CNVs數據庫和首都兒科研究所分子遺傳實驗室300個智力低下及正常父母CNVs數據庫及對照組中均未發現該片段的缺失或者重復，這些表明CALR3基因可能是神經管發育畸形新的候選基因，有必要做進一步的人群驗證研究。

綜上所述，本研究應用Array-CGH方法發現非多態性genic CNVs的富集是NTDs發生的危險因素。Array-CGH方法作為一種細胞遺傳學方法在研究NTDs的發病原因上具有重要的應用價值，可以幫助尋找新的人類NTDs候選基因。province：a combined epidemiological approach［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2007，79（10）：702-7.

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Application ofm icroarray com parative genom ic hybridization to investigate the relationship between cranial neural tube defects and genom ic copy number variations

Wang Jing1，Guo Liu2，Cai Chunquan3，et al
（1Reproductive Medicine Center，Clinical College of PLA Affiliated AnhuiMedical University，The 105th Hospital of PLA，Hefei 230031；2Dept of Neurology，Children Hospital of Capital Institute of Pediatrics，Beijing 100020；3Dept of Neurosurgery，Children's Hospital of Tianjin，Tianjin 300074）

Objective To investigate the pathogenic role of genomic copy number variations（CNVs）in the cranialneural tube defects，the genomic CNVswere screened in the caseswith cranial neural tube defects and matched controls usingmicroarray comparative genomic hybridization（Array-CGH）.Methods The genomic DNA from 51 cases with cranial neural tube defects cases and 75 matched controlswere subjected for whole genome CNVs analysis via the Oligo 244 k microarray chip.For genomic CNVs detected，the database of genomic variantswas used as a filter to remove the benign polymorphic CNVs.To the remained non-polymorphic CNVs，non-polymorphic genic CNVs or non-polymorphic ciliogenic CNVswere named depending on whether the non-polymorphic CNVs contained a reference gene or a cilia gene.ThenΧ2test was applied to analyze the correlation between genomic CNVs and cranial neural tube defects.Results 48 and 33 non-polymorphic CNVswere detected in cases and controls respectively.Among them，37 and 26 CNVs involved genes（non-polymorphic genic CNVs）.Significantly more nonpolymorphic CNVs and non-polymorphic genic CNVs were detected in cranial neural tube defects patients than in the control（52.9%vs32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05）.Non-polymorphic genic CNVswere associated with a 2.644-fold increased risk for cranial neural tube defects（OR=2.644）.Conclusion Evidence from the genome-wide CNV study suggests that genic CNVs are associated with cranial neural tube defects.

array comparative genomic hybridization；cranial neural tube defects；genomic copy number variations

R 714.7；R 715.5

A

1000-1492（2016）05-0686-06

2013-03-14接收

國家自然科學基金（編號：81370708、81401207）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（編號：14JCYBJC25000）；天津市衛生行業重點攻關項目（編號：12KG116）；天津市衛計委科技基金（編號：2015K1212）

1安徽醫科大學附屬解放軍臨床學院生殖中心，合肥230031

2首都兒科研究所附屬兒童醫院神經科，北京 1000203天津市兒童醫院神經外科，天津 300074

4首都兒科研究所北京市兒童發育和營養組學重點實驗室，北京 100020

5鄭州大學生命科學學院，鄭州450001

6哈佛醫學院波士頓兒童醫院，麻省，美國 02112

汪 靜，女，碩士研究生；

姜 宏，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：jiangh105@sina.com