新疆地區維吾爾族人群K lotho基因多態性及血脂成分、電解質與草酸鈣腎結石關系的研究

杜廣建，阿不都賽買提·艾力，吳冠偉，袁留亞，木拉提·馬合木提

新疆地區維吾爾族人群K lotho基因多態性及血脂成分、電解質與草酸鈣腎結石關系的研究

杜廣建1，阿不都賽買提·艾力1，吳冠偉1，袁留亞2，木拉提·馬合木提1

目的 探討Klotho基因多態性及血脂、電解質與草酸鈣結石的相關性。方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）方法檢測128例草酸鈣結石患者（病例組）和94例健康志愿者（對照組）Klotho基因rs3752472、rs650439和rs1207568位點多態性，并分析病例組與對照組中基因型分布差異以及病例組中不同基因型攜帶者的電解質、血脂水平差異。結果 Klotho基因SNP rs3752472多態性，其兩組基因型分布差異有統計學意義（OR=3.707，95%CI：1.861～7.384；Χ2=14.912，P＜0.05），病例組中C/C與C/T+T/T基因型攜帶者相比較，鈣磷水平差異有統計學意義（P＜0.05），血鎂、血鈉水平差異無統計學意義；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平差異有統計學意義；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平比較差異無統計學意義；其余兩組病例組與對照組相比較基因型分布差異無統計學意義，病例組內不同基因型攜帶者電解質和血脂比較差異無統計學意義。結論

Klotho基因SNP rs3752472多態性，是與新疆地區維吾爾族人群草酸鈣結石發病風險相關的；在病例組中，C/C基因型者的血鈣、血磷及LDL-C均高于CT+TT者；Klotho基因rs3752472多態性位點可能通過調節鈣磷代謝、LDL-C水平來影響草酸鈣結石的成石。

Klotho基因；草酸鈣結石；血電解質；血脂

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.010.html

研究［1］表明Klotho基因多態性與鈣磷及維生素D代謝、氧化應激、腎臟缺血再灌注、血脂水平等密切相關。而這些因素是草酸鈣成石的機制之一。為了解Klotho基因與草酸鈣結石形成的相關因素。該實驗對Klotho基因多態性與血脂及電解質的相關性進行了研究。

1　材料與方法

1.1病例資料 選擇2013年3月～12月在新疆醫科大學第一、二附屬醫院就診的新疆地區維吾爾族草酸鈣結石患者128例（病例組），其中男91例，女37例；年齡33～53（43±10）歲，不合并其它疾病（肥胖、糖尿病、高血壓等）；以及同期的新疆維吾爾族健康體檢者94例（對照組），其中男67例，女27例；年齡37～55（46±9）歲。泌尿系結石經彩超或X線片確診，術后取得結石并經結石成分分析確定為草酸鈣結石后選取。

1.2基因組DNA提取 抽取病例組與對照組患者空腹外周靜脈血3 ml，以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用人類基因組DNA提取試劑盒（上海生物工程股份有限公司）從血中提取基因組DNA，置于-20℃環境下保存。

1.3引物設計與合成 引物設計根據GenBank所收錄的全序列，見表1。

表1　引物設計

1.4PCR擴增及基因型檢測 PCR擴增體系總體積為15μl，上下游引物各0.2μl，雙鏈DNA模板0.5μl，dNTP（10 mmol/L），dH2O 11μl，擴增條件：第一步：95℃預變性5 min，第二步：95℃變性30 s，第三步：68℃退火45 s，第四步：72℃延伸60 s；重復第2～4步20個循環；第五步：95℃變性30 s；第六步：58℃退火30 s；第七步：72℃延伸40 s，重復第5～7步20個循環；第八步：72℃延伸6 min。采用特異性限制性內切酶HaeⅢ（rs3752472）、NheⅠ（rs650439）和Hpy188Ⅲ（rs1207568）消化（37℃、12 h），3%瓊脂糖凝膠電泳并在成像系統中判斷酶切結果，并將PCR產物進行測序。

1.5采集外周靜脈血 外周血1 200 r/min離心15 min后取血清，生化儀檢測血清鈣、磷、鈉、鎂水平；血三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定采用日本CL-7300全自動生化分析儀。

1.6統計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以ˉx±s表示。基因型與草酸鈣結石的關系采用Χ2檢驗；基因型與血脂、電解質的關系采用t檢驗（滿足正態分布及方差齊性時）；未滿足正態分布及方差齊性時，采用修正t檢驗。

2　結果

2.1K lotho基因位點多態性遺傳平衡檢驗Klotho基因位點多態性基因型Hardy-Weinberg平衡定律檢驗見表2。由表2可知，P＞0.05，說明3個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，所選樣本具有一定的代表性。

2.2K lotho基因單核苷酸多態性基因型的比較Klotho基因rs3752472位點有野生型C/C、雜合型C/T、突變型T/T 3種基因型；rs650439位點有野生型A/A、雜合型A/T、突變型T/T 3種基因型；rs1207568位點有野生型C/C、雜合型C/T、突變型T/T 3種基因型；分別將其野生型與雜合型、突變型之和進行多態性基因型比較（表3）。Klotho基因rs3752472位點攜帶野生型（C/C）的人群結石發病風險明顯高于攜帶有雜合型及突變型（C/T+T/T）；前者發生結石的危險性是后者的3.707倍，差異有統計學意義（Χ2=14.912，P＜0.05）。其余兩位點多態性基因型比較差異無統計學意義。

表2　K lotho基因位點多態性基因型群體遺傳學　Hardy-W einberg平衡定律檢驗

表3　K lotho基因　rs3752472、rs650439、rs1207568位點多態性基因型的比較

2.3結石患者中K lotho基因多態性與電解質、血脂關系 比較病例組中攜帶野生型基因型與攜帶雜合型、突變型基因型者血電解質以及血脂水平（表4）。Klotho基因rs3752472位點比較病例組內攜帶有C/C基因型者與攜帶有C/T+T/T基因型者電解質、血脂水平，前者血鈣（t=2.372，P=0.019）、血磷（t=2.363，P=0.02）水平均高于后者，而血鎂、血鈉水平差異無統計學意義；LDL-C（t=2.226，P= 0.028），前者水平明顯高于后者，而TG、TC、HDL-C水平相比較，差異無統計學意義；Klotho基因rs650439、rs1207568位點比較病例組中野生型基因型者與攜帶有雜合型、突變型基因型者電解質及血脂水平，各項指標差異均無統計學意義。

表4　結石患者中　K lotho基因多態性與電解質、血脂關系（ˉx±s）

3　討論

膜型klotho蛋白有調節鈣磷代謝等作用，是成纖維生長因子23（FGF23）的一個共同受體；Klotho蛋白是FGF23信號轉導通路的關鍵因子，FGF23通過Klotho蛋白的介導發揮生物學作用［2-3］。FGF23能夠抑制磷的重吸收和維生素D的生物合成，增加尿磷排泄和抑制血清1，25-（OH）2D的水平和甲狀旁腺激素合成等調節血磷水平［4-5］。另外分泌型Klotho蛋白還可通過增加腎遠曲小管上皮細胞瞬時受體勢能離子通道5（transient receptor potential vanilloid 5，TRPV5）的表達，提高鈣在腎臟的重吸收；鈣離子通過上皮細胞鈣通道TRPV5蛋白介導，經遠端腎小管后段和集合管上皮細胞頂膜入細胞質，與載體蛋白Calblindin-D28k結合并擴散至細胞外側基底膜，通過轉運蛋白NCX1和PMCA1b經基底膜入血液循環［6］。

Telci et al［7］用聚合酶鏈反應法分別對108例腎結石患者和51例年齡匹配的健康志愿者的Klotho基因第2外顯子F252V區域G395A基因多態性和第4外顯子C1818T基因多態性進行研究，發現G395A位點基因型G/G比G/A和 A/A基因型更易患腎結石。研究［8］顯示Klotho基因rs3752472位點CC基因型多態性與雜合子T/C和純合子T/T相比腎結石的風險增加了兩倍。Klotho基因多態性是腎結石形成的危險因素之一。Klotho基因G395A多態性與TRPV5、維生素D受體以及鈣敏感受體多態性與腎結石形成有關。Klotho基因通過改變腎臟的離子通道轉運和腸道吸收在調節鈣磷代謝方面起著重要作用。

據此本研究比較了Klotho基因多態性與血清電解質的關系，本研究顯示在Klotho基因rs3752472多態性C/C基因型病例組中所占比例（88.3%）明顯高于對照組（67%）；攜帶有野生型（C/C）基因型者結石發病風險與攜帶有突變型及雜合型（T/T+ C/T）發病風險差異有統計學意義；且前者發生結石的風險是后者的3.707倍。在病例組中C/C基因型的比例明顯高于對照組，在病例組中所占比例為88.3%。

為了解Klotho基因rs3752472多態性影響草酸鈣結石的因素，本研究比較了病例組中C/C基因型與C/T+T/T基因型結石患者的血電解質水平，得出C/C基因型攜帶者與C/T+T/T基因型攜帶者相比血鈣、血磷水平差異有統計學意義，血鎂及血鈉差異無統計學意義。而在Klotho基因rs650439、rs1207568病例組與對照組比較兩組基因多態性差異無統計學意義，前者病例組中A/A基因型與A/T +T/T基因型結石患者的電解質水平比較差異無統計學意義；后者病例組中C/C基因型與C/T+T/T基因型結石患者的電解質水平比較差異無統計學意義。Klotho基因rs3752472多態性可能通過影響血鈣、血磷水平來影響新疆地區維吾爾族人群草酸鈣結石的形成。

不同的遺傳基因控制和影響著不同個體的脂質代謝過程。不同種族間的血脂水平差異始于兒童階段，認為可能與遺傳因素有關［9］。Kang et al［10］認為高TG的結石患者尿鈣、尿鈉、尿酸、尿鎂、尿鉀的排泄會增多；HDL-C較低的結石患者尿鈉、尿鎂以及尿鉀的排泄會增多；而LDL-C水平較高的結石患者尿鈉排泄較低。Soldati et al［11］認為結石患者與非結石患者比較血清TG、血糖和谷草轉氨酶水平通常較高。然而其并未能夠從遺傳的角度解釋導致結石患者血脂水平高于非結石患者的原因。本研究病例組中C/C基因型的比例明顯高于對照組，且在病例組中所占比例為88.3%；本研究比較病例組中C/ C基因型與C/T+T/T基因型結石患者的血脂水平，得出C/C基因型攜帶者與C/T+T/T基因型攜帶者相比LDL-C水平差異有統計學意義，而TG、TC、HDL-C水平差異無統計學意義。而對于病例組與對照組比較差異無統計學意義的Klotho基因rs650439、rs1207568位點基因多態性，前者病例組中A/A基因型與A/T+T/T基因型結石患者的血脂水平比較差異無統計學意義；后者病例組中C/C基因型與C/T+T/T基因型結石患者的血脂水平比較差異亦無統計學意義。因此Klotho基因rs3752472多態性可能通過影響LDL-C水平來影響草酸鈣結石的形成和發展。

推測Klotho基因rs3752472多態性可能通過某種分子機制調節血鈣、血磷、LDL-C水平來影響新疆地區維吾爾族人群草酸鈣結石的成石過程。為進一步的明確上述結論仍需要大樣本來進一步研究證實。

［1］ 孫 昕，陳 林，董曉慧，等.Klotho蛋白與疾病的研究進展［J］.中國藥理學通報，2014，30（2）：153-5.

［2］ Hu M C，Kuro-o M，Moe OW.Klotho and kidney disease［J］.J Nephrol，2010，23 Suppl 16：S136-44.

［3］ Bernheim J，Benchetrit S.The potential roles of FGF23 and Klotho in the prognosis of renal and cardiovascular diseases［J］. Nephrol Dial Transplant，2011，26（8）：2433-8.

［4］ Prie D，Urena Torres P，Friedlander G.Latest findings in phosphate homeostasis［J］.Kidney Int，2009，75（9）：882-9.

［5］ Ramon I，Kleynen P，Body JJ，et al.Fibroblast growth factor23 and its role in phosphate homeostasis［J］.Eur J Endocrinol，2010，162（1）：1-10.

［6］ 何錦園，曾國華，吳文起，等.含鈣腎結石患者腎組織TRPV5的表達及意義［J］.臨床泌尿外科雜志，2010，25（11）：805-8，811.

［7］ Telci D，Dogan A U，Ozbek E，et al.KLOTHO gene polymorphism of G395A is associated with kidney stones［J］.Am JNephrol，2011，33（4）：337-43.

［8］ Xu C，Song R J，Yang J，et al.Klotho gene polymorphism of rs3752472 is associated with the risk ofurinary calculi in the population of Han nationality in Eastern China［J］.Gene，2013，526（2）：494-7.

［9］ 葉任高.內科學［M］.5版.北京：人民衛生出版社，2002：834 -7.

［10］Kang HW，Seo SP，Kim W T，et al.Hypertriglyceridemia is associated with increased risk for stone recurrence in patients with urolithiasis［J］.Urology，2014，84（4）：766-71.

［11］Soldati L，Bertoli S，Terranegra A，et al.Relevance ofMediterranean diet and glucosemetabolism for nephrolithiasis in obese subjects［J］.JTransl Med，2014，12：34.

Effect of K lotho gene polymorphism on the formation of calcium oxalate calculus by regulating lipid and electrolyte Uighur population of Xinjiang region

Du Guangjian，Abudusaimaiti·Aili，Wu Guanwei，et al
（Dept of Urology，The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830028）

Objective To investigate the effect of Klotho gene polymorphism on the formation of calcium oxalate calculus by regulating the lipid and electrolyte.Methods Klotho gene rs3752472，rs650439 and rs1207568 polymorphisms weregenotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis（PCRRFLP）method in 128 patientswith calcium oxalate stone patients（case group）and 94 cases of healthy volunteers（control group）and the genotype distribution was compared between the two groups.The electrolytes and blood lipid levelswere compared among different genotypes in the case groups.Results For Klotho gene rs3752472 polymorphisms，the statistical results of itsgenotype were odds ratio（OR）=3.707，95%confidence interval（CI）：1.861～7.384，Χ2=14.912，P＜0.05.In the case group compared C/Twith C/T+T/T genotype carriers，blood calcium，phosphorus and low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）levels had significant difference（P＜0.05）. Serum magnesium，serum sodium，triglyceride（TG），total cholesterol（TC）and high density lipoprotein（HDLC）levels have no statistical difference.There was no difference in genotype distribution between the case group and the control group in the other two groups and the electrolytes and blood lipid levels had no significant difference among different genotype in the other two cases group.Conclusion The rs3752472 polymorphisms of Klotho Gene is associated with the risk of caicium oxalate urolithiasis in Xinjisng region.In addition，in the case group，blood calcium，phosphorus and low density lipoprotein levelswith C/C genotype carriers are higher than thosewith C/T+T/ T genotype carriers.The results show that the Klotho gene rs3752472 polymorphism may regulate themetabolism of blood calcium and phosphorus and low density lipoprotein levels to influence the formation of calcium oxalate calculus.

Klotho gene；calcium oxalate calculus；electrolyte；blood lipids

R 691.4

A

1000-1492（2016）05-0629-04

2016-02-22接收

國家自然科學基金資助項目（編號：81460139）

1新疆醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，烏魯木齊830028

2蘭州大學第一醫院泌尿外科，蘭州 730000

杜廣建，男，碩士研究生；

木拉提·馬合木提，男，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：mekit@126.com