超高液相色譜串聯質譜法測定小麥粉中真菌毒素

劉利亞，李磊，周貽兵，王婭芳（貴州省疾病預防控制中心衛生監測檢驗所，貴州貴陽550004）

超高液相色譜串聯質譜法測定小麥粉中真菌毒素

劉利亞，李磊，周貽兵，王婭芳*
（貴州省疾病預防控制中心衛生監測檢驗所，貴州貴陽550004）

建立小麥粉中雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、隱蔽型脫氧雪腐鐮刀烯醇（Deepoxy-DON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及衍生物（3A-DON、15A-DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）常見6種真菌毒素的同時測定方法。試樣用多功能凈化柱凈化，液相色譜-串聯質譜基質內標法定量測定。結果表明6種真菌毒素的檢出限在0.50 μg/kg～1.00 μg/kg之間，線性相關系數R2＞0.994，3個水平加標回收率為82.1%～108.9%，RSD為4.6%～14.5%。采用本方法參加面粉中脫氧雪腐鐮刀烯醇能力驗證樣品質控考核，統計結果Z為-1.93，結果評價為滿意。該方法準確、靈敏、高效，可適用于小麥粉中6種常見真菌毒素的定量分析。

液相色譜-串聯質譜；多功能凈化；內標法；真菌毒素；小麥粉

method；mycotoxins；wheatflour

真菌毒素也稱霉菌毒素，是霉菌等真菌在其所污染的農作物或食品原料中產生的有毒的次生代謝產物，目前發現約300多種有毒的真菌次生代謝產物，其中以黃曲霉毒素類（AFs）、伏馬毒素類（FBs）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇以及玉米赤霉烯酮毒素對經濟及人們的健康危害尤為巨大［1］。超過一定攝入量后會損壞人的肝腎功能、致癌、致畸并誘發免疫抑制性疾病［2］。我國作為糧食生產大國，是受真菌毒素污染比較嚴重的國家之一［3］，據研究調查表明，我國小麥主要為鐮刀菌毒素真菌污染，包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等，其DON檢出率在55%～100%，ZEN的陽性檢出率達到5.9%～100%，ZEN的超標率可以達到38.6%，平均值接近限量標準的3倍［4］，目前，我國的糧食衛生標準［5］規定小麥中的DON限量為1 000 μg/kg，ZEN限量為60 μg/kg。小麥粉為面食生產的主要原料，尤其我

目前食品中真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法（TIC）、酶聯免疫吸附法、氣相色譜法、免疫親和柱凈化高效液相色譜法［6-9］，上述方法大多均只能檢測單一組分或同一類的真菌毒素。近年來，液相色譜串聯質譜法由于其較好的分離度和較高的靈敏度逐漸成為同時檢測多種真菌毒素的主要手段［10-12］。本實驗室采用多功能柱凈化、內標法定量，結合液相色譜-串聯質譜技術建立了小麥粉中多種真菌毒素的定量測定方法。大大提高檢測的靈敏度和特異性，比傳統前處理方法更為簡便，并且可同時檢測多種毒素。經能力驗證質控考核確認準確可靠，采用建立的方法對國家食品安全風險監測工作中小麥粉類食品進行了檢測定量，為提高國家食品安全風險監測數據質量和工作效率提供了有效的技術支撐。

1　試驗部分

1．1儀器、試劑與材料

TSQ Quantum ultra三重四極桿質譜儀，配電噴霧離子源（ESI），Ultimate3000超高壓液相色譜儀：美國ThermoFisher科技有限公司；3-18K臺式高速離心機：德國Sigma公司；TTL－DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯科技發展有限公司；艾科浦超純水機：重慶頤洋企業發展有限公司。

玉米赤霉烯酮（ZEN）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、隱蔽型脫氧雪腐鐮刀烯醇（Deepoxy-DON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-DON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-DON）標準品：均購自美國Sigma公司；U-［13C15］-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（U-［13C15］-DON）同位素內標：均購自Romer公司。

多功能凈化柱MycosepTM112、MycosepTM226、MycosepTM228：ROMER公司；乙腈、甲醇（色譜純）：美國Merk公司；無水硫酸鎂（使用前在450℃烘烤2 h，冷卻后備用）、氯化鈉、冰乙酸、乙酸銨（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲酸（純度≥98.0%）：德國CNW公司；樣品：購自貴州全省各市（州）、縣（區）超市和農貿市場。

1.2樣品提取

稱取2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中；加入含U-［13C15］-DON 500 μg/L內標混合儲備液200 μL，加1%（體積比）乙酸的乙腈/水（85∶15，體積比）提取液20 mL，超聲提取10 min后加入2 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉；渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，取上層溶液于MycosepTM228凈化柱玻璃管，將凈化柱填料管插入玻璃管并緩慢推進，取5 mL續濾液于氮吹管中50℃下氮吹至干，加入甲醇-10 mmol/L乙酸銨（1∶1，體積比）1 mL溶解，混勻后過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

按照上述方法測試后的樣品，如果未檢測到6種真菌毒素將作為空白樣品用于回收率試驗和制備基質校正溶液。在進行加標試驗時，取適量稀釋后的標準溶液加入到空白樣品中，充分混合靜置過夜后按樣品處理。

1.3標準溶液的配制

標準儲備溶液的配制：將ZEN、NIV、Deepoxy-DON、DON、3-DON、15-DON分別用甲醇稀釋成濃度為10 μg/mL的標準儲備液，－18℃下避光保存備用。

基質混合標準工作溶液：用空白樣品提取液將標準儲備溶液以甲醇-10 mmol/L乙酸銨（1∶1，體積比）稀釋成標準系列使用液，使標準使用液中內標物濃度為U-［13C15］-DON 25 μg/L，基質混合標準工作溶液應現配現用。

1.4儀器條件

液相條件：色譜柱為Thermo Hypersll GOLD C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫30℃；進樣體積為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動相A為0.1%氨水，流動相B為甲醇；梯度洗脫條件見表1。

表1　 梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution conditions

質譜條件：電噴霧負離子檢測模式；噴霧電壓3 000 V；霧化器溫度300℃；離子傳輸管溫度270℃；鞘氣壓力：276 kPa，輔助氣壓力：104 kPa，碰撞氣（Ar）壓力：0.2 Pa；監測離子對、碰撞能量和透鏡電壓等參數見表2。

2　結果

2.1檢測條件優化

2.1.1色譜柱選擇

分別考察Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Agilent Proshell 120 EC-C18（50 mm× 2.1 mm，2.7 μm）以及 Thermo Hypersll GOLD C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 μm）等C18反向色譜柱，結果表明，常見小粒徑填料C18高壓色譜柱均能滿足該分析測試要求，根據不同色譜分離要求結合監測設備自身特點，本次檢測試驗選擇Thermo Hypersll GOLD C18色譜柱。

表2　 定性定量離子參數Table 2　Qualitative and quantitative ion parameters

2.1.2流動相選擇

液質聯用技術檢測多組分目標化合物時，流動相的選擇除考慮色譜柱能將目標化合物有效分離外，還應關注待測組分進入質譜后各離子化效率，實際測試中，液相的分離和質譜的離子化效果是一對矛盾體［12］，本次流動相優化重點考察甲醇-水和乙腈-水兩種洗脫體系，試驗發現，在負離子監測模式下，單純以純水為弱洗脫流動相，無論強洗脫流動相是甲醇或乙腈，離子化效率均較差，當弱洗脫流動相純水中加入適量的氨水后，離子化效率均有較明顯的提高，考慮色譜柱和質譜耐受性，同時滿足樣品分離效果和靈敏度，最終選擇0.1%氨水和甲醇為流動相。

2.1.3提取方法選擇

根據各待測組分理化性質，真菌毒素易溶于甲醇和乙腈，故本試驗提取溶劑重點考察甲醇和乙腈。因乙腈沸點較高，在實際樣品小麥粉提取后需濃縮、轉相和定容等后續處理，氮吹時甲醇較乙腈方便，最終選擇用甲醇做提取溶劑，考慮實際樣品小麥粉的溶解性需加入一定比例純水。經試驗最終選擇樣品提取方法為：取粉碎混合均勻樣品2 g于50 mL離心管，加入內標后于室溫下加入甲醇-水（70+30）提取液10 mL，渦旋1 min，室溫超聲提取45 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至凈化柱玻璃離心管，緩慢推進凈化柱填料管，取上層凈化液5 mL于氮吹管中50℃吹干，用流動相定容后過0.22 μm微孔濾膜。

2.1.4凈化柱的選擇

參照文獻［13］資料，本試驗通過加標回收的形式分別考察了ROMER公司生產的MycosepTM112、MycosepTM226和MycosepTM228多功能凈化柱的凈化效果，結果表明MycosepTM226多功能凈化柱對6種組分回收率在82.1%～108.9%之間，MycosepTM112多功能凈化柱僅對玉米赤酶烯酮組分凈化損失較小，MycosepTM228多功能凈化柱對6種待測組分回收率與MycosepTM226比較相對較低，故本次試驗選擇MycosepTM226多功能凈化柱凈化樣品。

2.1.5質譜條件選擇

根據各真菌組分化學電離性質，分別選用ESI+和ESI-模式，將真菌毒素標準儲備液直接進樣，通過優化質譜監測條件，確定各毒素的母離子質量數，結果發現玉米赤霉烯酮、雪腐鐮刀菌烯醇、隱蔽型脫氧雪腐鐮刀烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和U-［13C15］-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在ESI-模式下的靈敏度明顯高于ESI+模式，故本方法采用ESI-模式監測。確定母離子質量數以后，根據歐盟2002657/EC檢測組分確認規則，還需根據碰撞能量和碰撞電壓來確認和優化兩個以上子離子。最終6種真菌毒素及內標定性定量離子參數見表2，標準多反應監測（MRM）色譜圖見圖1。

2.2方法線性范圍與定量下線

以空白小麥粉基體提取液配制標準系列使用液，以標準液與內標峰面積積分比值為縱坐標，以標準使用液標示濃度為橫坐標進行自動積分，得到各檢測組分線性回歸方程、相關系數和線性范圍，根據低濃度標準使用液監測離子峰，按照3倍信噪比（S/N）為最低檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）計算定量線（LOQ），結果見表3。

從表3結果可以看出，采用內標法定量，各組分線性關系良好，相關系數R2均大于0.994，6個組分定量限在1.50 μg/k～3.00 μg/kg之間，遠遠低于我國糧食衛生標準對該類真菌毒素限值要求，能夠滿足該類產品的樣品檢測。

圖16　種真菌毒素標準及U-DON內標多反應監測圖譜Fig.1　MRM chromatograms for six kinds of mycotoxin standards and U-DON Internal standard

表3　6種真菌毒素的濃度范圍、線性方程、相關系數、檢出限與定量下線Table 3　Concentrations range，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and quantification limit for six kinds of mycotoxin

2.3方法加標回收與精密度

選擇空白基質小麥粉樣品，按照0.1C、0.5C和0.8C（C：為組分濃度范圍上限）3個水平每個水平加標6個平行樣品，添加真菌毒素混合標準溶液，震蕩混勻后靜置過夜，按優化樣品處理和檢測方法進行檢測，結果見表4。

由表4可知，6種真菌毒素在50 μg/kg～400 μg/kg范圍內樣品加標回收率在82.1%～108.9%，相對標準偏差為4.6%～14.5%之間，能夠滿足實際樣品檢測要求。

2.4方法驗證

國家風險評估中心于2014年8月對全國32個省級疾控中心及15個國家糧食質量檢測中心開展了國家食品安全風險監測質控考核項目“面粉中脫氧學府鐮刀菌烯醇檢驗”，結果用Z比分數法分析和評估，結果中位值為1.051 mg/kg，按照≤2為滿意結果方式評價，本次質控考核全國總體滿意率為68.1%（4個機構未上報），本實驗室按照該方法對樣品進行處理、檢測，上報結果為0.916 mg/kg，經統計標準化IQR為0.076，Z值為-1.93，結果判定為滿意。標明用該方法對面粉中該類真菌毒素檢測結果可靠。

表4　6種真菌毒素的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 4　The recovery rate and relative standard deviation for six kinds of mycotoxins

2.5實際樣品檢測

按照國家食品安全風險監測方案要求，2014年貴州省采用建立的方法在全省共采集158份小麥粉樣品，對其玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-DON）和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-DON）4種真菌毒素進行監測測定。結果48個樣品中檢出不同濃度水平的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，樣品檢出率為30.38%，含量從24.6 μg/kg至1 206 μg/kg不等，其中有1份樣品超過國家標準規定的限量要求，檢出樣品平均含量為256.7 μg/kg；共15份樣品中檢出玉米赤霉烯酮，樣品檢出率為9.49%，含量分別為6.4 μg/kg至32.4 μg/kg，檢出樣品平均含量為15.4 μg/kg，無超標樣品；除此以外的其余毒素均未檢出。

續表4　6種真菌毒素的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Continue table 4　The recovery rate and relative standard deviation for six kinds of mycotoxins

3　結論

本文建立了超高液相色譜串聯質譜法測定小麥粉中真菌毒素含量。對樣品提取方式、液相色譜分離和質譜監測條件等關鍵因素進行優化，通過方法學考察、實驗室能力驗證和實際樣品檢測證明，該方法具有簡便、快速、準確、可靠等特點，可適用于國家食品安全風險監測項目小麥粉中真菌毒素監測項目檢測。

［1］Dragan R Milicevic ，Tatjana Baltic .Real and Perceived Risks for Mycotoxin Contamination in Foods and Feeds：Challenges for Food Safety Control［J］.Toxins，2010，2（4）：572-592

［2］Tchana N A，Moundipa P F，Tchouanguep F M．Aflatoxin contamination in food and body fluids in relation to malnutrition and cancer status in Cameroon［J］．Int J Environ Res，2010，7（1）：178-180

［3］李娜，孫輝，唐朝暉，等．小麥及其制品加工過程主要真菌毒素含量的變化［J］．糧油食品科技，2014，22（2）：30-35

［4］熊凱華．糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的污染調查及降解毒素微生物的篩選［D］．南昌：南昌大學，2010

［5］中華人民共和國衛生部．GB 2761-2011食品安全國家標準食品中真菌毒素限量［S］．北京：中國標準出版社：2011

［6］Tanaka T，Yoneda A，Inoue S，et al.Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2000，882（1）：23-28

［7］李軍，于一茫，田苗，等．免疫親和柱凈化-柱后光化學衍生-高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］．色譜，2006，24（6）：581-584

［8］Chan D，MacDonald S J，Boughtflower V，et al.Simultaneou determination of aflatoxins and ochratoxin A in food using a fully automated immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography-fluorescence detection［J］.J Chromatogr A，2004，1059（1/2）：13-16

［9］Ndube N，Vander Westhuizen L，Green I R，et al.HPLC determination of fumonisin mycotoxins in maize：A comparative study of naphthalene-2，3-dicarboxaldehy-de and o-hthaldialdehyde derivatization reagents for fluorescence and diode array detection［J］. J Chromatography B-Anal Technol Biomed Life Sci，2011，879（23）：2239-2243

［10］Frenich A G，Vidal J L M，Romero-Gonzalez R，et al.Aguilera-Luiz M DSimple and high-throughput method for the multimycotoxin analysis in cereals and related foods by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Food Chem，2009，117（4）：705-712

［11］孟娟，張晶，張楠，等．固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮類真菌毒素［J］．色譜，2010，28 （6）：601–607

［12］宮小明，任一平，董靜，等．超高效液相色譜串聯質譜法測定花生、糧油中18種真菌毒素［J］．分析測試學報，2011，30（1）：6-12

［13］揚大進，李寧．國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊［M］．北京：中國質檢出版社，2014：225-230

Determination of Mycotoxins in Wheat Flour by UPLC-MS/MS

LIU Li-ya，LI Lei，ZHOU Yi-bing，WANG Ya-fang*
（Institute of Health Surveillance and Inspection of Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China）

The method to simultaneously determinate six kinds of common mycotoxins，included nivalenol （NIV），deoxynivalenol concealed（Deepoxy-DON），deoxynivalenol（DON），deoxynivalenol derivatives（3ADON，15A-DON）and zearalenone（ZEN）in wheat flour was established.The samples were purified with multifunctional purifying column，then determinated by liquid chromatography tandem mass spectrometry with internal standard method.The results showed detection limits of six kinds mycotoxin were between 0.50 μg/kg and 1.00 μg/kg，the linear correlation coefficient R2＞0.994，three levels recovery were 82.1%-108.9%，RSD were 4.6%-14.5%.The method used to ability verification and quality control assessment of deoxynivalenol in wheat flour，statistical results Z score was-1.93，the result was evaluated as satisfactory.The method is accurate，sensitive and efficient and applicable to quantitative analysis of six kinds of common mycotoxin in wheat flour.

liquidchromatography-tandemmassspectrometry；multifunctionpurification；internalstandard

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.040國北方在居民膳食攝入中占比重較大，小麥粉中常見真菌毒素檢測是食品生產原料質量控制的最后程序，對保障居民身體健康至關重要，因此目前我國將小麥粉中常見真菌毒素監測作為食品安全風險監測工作的常規檢測內容。

貴州省傳染病預防與控制人才基地（黔人領發［2013］15號）作者簡介：劉利亞（1978—），男（漢），副主任技師，大學本科，從事環境及食品衛生檢驗。

王婭芳（1976—），女，主任醫師，從事營養及食品衛生檢驗。

2015-08-14