β-環糊精超聲輔助提取山楂中熊果酸的研究

石瑞，張寧，李志英，何瑞瑞，余慧菁（忻州師范學院生物系，山西忻州034000）

β-環糊精超聲輔助提取山楂中熊果酸的研究

石瑞，張寧，李志英，何瑞瑞，余慧菁
（忻州師范學院生物系，山西忻州034000）

研究超聲輔助β-環糊精（β-CD）介質中提取山楂中的熊果酸，分光光度法測定山楂中熊果酸的得率。在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗，以山楂中的熊果酸含量為指標，分別考察所選的各因素對超聲波法提取工藝的影響，并研究其抗菌作用。結果表明：最佳的提取工藝條件為乙醇濃度為80%，超聲波功率240 W，超聲提取時間30 min，液料比30∶1（mL/g），溫度為50℃，β-CD的用量m（山楂）∶m（β-CD）為1∶1為最佳工藝條件。山楂中的熊果酸得率為：7.264 mg/g。β-CD的加入有效的提高了熊果酸的得率。通過對照試驗可知熊果酸對大腸桿菌，枯草桿菌具有抗菌作用。

山楂；熊果酸；超聲波法；β-環糊精

山楂為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.Var.magcr N.E.Br）及大果山楂C.pinnatifida Bge.的干燥成熟果實，主要功能為消食健胃、行氣散瘀。為藥食兩用的藥材，據文獻報道，山楂中含有熊果酸等三萜類成分［1］。

熊果酸，又名烏索酸［2］，具有廣泛的生物學活性，如抗菌瘤、抗肝炎、抗病毒、抗輻射、抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、提高免疫力、美白等［3-6］，廣泛的用于醫藥、保健食品及化妝品等領域。

環糊精（CD）具有疏水性的內腔和親水性的表面，是超分子化學中的基礎物質之一，它的包合特性使其在理論及實際應用中得到迅速發展［7］。尤其在醫藥方面，CD和CD衍生物與傳統藥物載體材料相比，具有無毒，性質穩定等特點，此外，它結構獨特，可用于提高藥物溶解度和穩定性，增強藥物利用率［8-9］。

近年來超聲波法提取方法作為一種優良的提取方法已經廣泛應用于天然植物中有效成分的提取［10-13］。本試驗通過擬使用β-環糊精的醇溶液通過超聲輔助方法提取山楂中的熊果酸，以期代替了傳統的水浸法，醇提法，以提高山楂中熊果酸的提取效率。優化超聲提取山楂中熊果酸的最佳工藝條件。

1　材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

山楂；熊果酸標準品；香草醛；高氯酸；冰醋酸；β-環糊精；試驗試劑均為分析純，試驗用水為一次蒸餾水。

0.1 mg/mL熊果酸標準溶液的制備：準確稱取熊果酸標準品0.010 0 g，以無水乙醇為溶劑，定容于100 mL容量瓶中，即得0.1 g/mL的熊果酸標準品。

0.05 g/mL的香草醛-冰醋酸溶液的制備：取2.50 g香草醛，然后用冰醋酸定容到50 mL。

電子天平（FA2204B）：上海精密科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2550）：島津公司，蘇州；HH-2型數顯恒溫水浴鍋）：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；中草藥粉碎機（FW135型）：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2原料預處理

取干山楂，去除雜質，用粉碎機粉碎。過60目篩，得到山楂粉末，儲藏備用。

1.3山楂中熊果酸的提取方法

稱取山楂粉末1 g于容量瓶中，用80%乙醇提取，超聲波功率為60%，液料比為30∶1（mL/g），溫度為50℃，β-CD的用量m（山楂）∶m（β-CD）為1∶1，超聲波輔助提取30 min。冷卻至室溫，脫色［14］。過濾，將所得濾液定容到50 mL容量瓶中作為樣品提取液。

1.4山楂中熊果酸的測定方法

使用香草醛-冰醋酸法［1］。

熊果酸得率的計算公式：得率/（mg/g）=250×1000×（吸光度A+0.015 5）/0.027 4

1.5培養基的制備

普通瓊脂培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂條20 g，水1 000 mL，滅菌前濃度2 mol/L，用氫氧化鈉調pH值至7.0～7.2。

1.6菌懸液的制備

將供試菌種接種于普通瓊脂培養基上，進行斜面活化，恒溫37℃培養18 h～24 h，用接種環挑取單個菌落分別接種于新鮮肉湯培養基中，置37℃恒溫箱中培養18 h～24 h，采用滅菌水稀釋菌懸液后備用。

2　結果與分析

2.1吸收光譜的研究

按1.3的試驗方法提取，以試劑空白作參比，在400nm～800nm之間測定吸光度，所得譜圖如圖1所示。

由圖1可知，當提取介質為β-CD乙醇溶液時，山楂中熊果酸的得率最高，β-CD能夠增加熊果酸的得率，計算此條件下的熊果酸得率為：5.152 mg/g。比傳統方法得率提高1.41倍，故選擇β-CD+乙醇為山楂中熊果酸的提取介質。

2.2乙醇濃度對熊果酸得率的影響

準確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變乙醇濃度：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，按1.3的方法提取，按1.4的方法測定，結果見表1。

由表1知，隨著乙醇濃度的增大，山楂中熊果酸得率也在增大，濃度超過80%時，增大幅度不大。考慮其節省藥品及得率。故取80%的乙醇為提取溶劑。

2.3超聲波提取功率的影響

圖1　 紫外光譜圖Fig.1　The UV absorbance spectrum

準確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變超聲波功率：160、200、240、280、320 W，按1.3的方法提取，按1.4的方法測定，結果見表2。

表2　超聲波功率對熊果酸得率的影響Table 2　Effect of ultrasonic power on extraction of ursolic acid

表1　乙醇濃度對熊果酸得率的影響Table 1 Effects of ethanol concentrations on extraction of ursolic acid

由表2，隨著超聲波提取功率的增大，山楂中熊果酸得率也在增大，且有下降趨勢。考慮其節能方面及得率。故取功率240 W為最優超聲波提取功率。

2.4超聲波提取時間的影響

準確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變超聲波時間：15、20、30、45、60 min，按1.2.2的方法提取，按1.4的方法測定，結果見表3。

表3　提取時間對熊果酸得率的影響Table 3　Effects of extracting time on extraction of ursolic acid

由表3可知，隨著超聲波提取時間的增大，得率先增大，后減小。后半段時間可能是由于提取時間過長，部分熊果酸分解等原因造成。綜上，30 min為最優超聲波提取時間。

2.5液料比的選擇

準確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變液料比：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），按1.3的方法提取，按1.4的方法測定，結果見表4。

表4　 液料比對熊果酸得率的影響Table 4　Effects of liquid-solid ratio on extraction of ursolic acid

由表4可知，隨著液料比的增大，得率先增大后減小，在液料比為30∶1（mL/g）時得率最高，故選取30∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.6β-CD用量的選擇

準確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變β-CD的量m（山楂）∶m（β-CD）為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，按1.3的方法提取，按1.4的方法測定結果見表5。

表5 β-CD用量對熊果酸得率的影響Table 5　Effects of β-CD dosage on extraction of ursolic acid

由表5可知，隨著β-CD的增加，吸光度先增大后減小。綜合考慮。故選擇m（山楂）∶m（β-CD）=1∶1。

2.7溫度的選擇

準確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變溫度：30、40、50、60、70℃，按1.3的方法提取，按1.4的方法測定，結果見表6。

表6　 溫度對熊果酸得率的影響Table 6　Effects of temperature on extraction of ursolic acid

由表6知，隨著溫度的升高，得率先增加后減小，在溫度為50℃時熊果酸有最大得率，故選擇溫度為50℃。

2.8正交試驗

根據以上單因素試驗結果，選出影響熊果酸得率的4個因素：超聲波提取時間、超聲波提取功率、液料比、溫度。進行優化組合，以所測得吸光度為查考指標，采用L9（34）進行正交試驗，優選出超聲波輔助β-CD提取法提取山楂中熊果酸的最佳工藝參數。正交試驗因素水平如表7所示。

表7　正交試驗因素水平Table 7　Factors and levels in the orthogonal array design

2.9超聲波法正交試驗極差結果分析表

超聲波法正交試驗極差結果分析表見表8。

表8　超聲波法正交試驗極差結果分析表Table 8　The results of range analysis of orthogonal experiments by ultrasonic method

由極差分析可知，各因素對熊果酸提取影響因素大小為：A（時間）＞D（溫度）＞B（液料比）＞C（超聲波功率）。故最佳試驗方案是：A1B1C2D2，即超聲波時間為30 min，液料比為20∶1（mL/g），超聲波功率為240 W，溫度為50℃。計算在此條件下的熊果得率為7.264 mg/g。而單因素的最佳提取條件下得率為6.346 mg/g，二者相差不大。

3　抗菌作用的研究

3.1熊果酸抗菌效果

在超凈工作臺上用接種環挑取各供試菌的單個菌落劃線于藥物平板上，同時以不加藥物、只加菌懸液的瓊脂平板作陽性對照，加無菌水于陰性平板上作陰性對照。然后將平板倒置于37℃恒溫箱中培養18 h～24 h，取出觀察結果。結果見圖2～圖3及表9。

圖2　熊果酸對枯草桿菌的抑菌效果圖Fig.2　The antibacterial effect of Bacillus subtilis

圖3　熊果酸對大腸桿菌的抑菌效果Fig.3　The antibacterial effect of Escherichia coli

表9　 生長抑制試驗結果Table 9　Results of growth inhibition test

由表9可知，熊果酸對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抗菌作用，且熊果酸對枯草芽孢桿菌的抑菌效果強于大腸桿菌的抑菌效果。

4　結論

在單因素試驗的基礎上通過正交法試驗的優化，獲得超聲波提取山楂中熊果酸的最佳工藝條件：乙醇濃度為80%，超聲波功率240 W，提取時間30 min，溫度為50℃，液料比30∶1（mL/g），m（β-CD）∶m（山楂）=1∶1，此時山楂中熊果酸的提取得率達7.264 mg/g。β-CD的加入有效地增加了山楂中熊果酸的得率。

［1］趙愛云，張立新，王能飛，等.山楂中熊果酸的提取工藝研究［J］.食品工業科技，2006，27（11）：127-128

［2］李滿秀，劉美云.山楂中熊果酸的超聲提取及抗氧化性研究［J］.食品工業科技，2010，31（4）：280-282

［3］彭雪萍，王花俊，縱偉，等.β-環糊精與熊果酸在乙醇溶液中的包合效果研究［J］.中國食品添加劑，2010，5（3）：157-159

［4］占豪，姜子濤，李榮.紫外光譜法研究羅勒精油與β-環糊精的包合作用［J］.中國調味品，2008，15（1）：13-17

［5］關皓月，張純，顧偉峰.紫外分光光度法測定鹽酸奈福泮-β-環糊精包合物的含量［J］.藥學實踐雜質，2008，26（4）：291-293

［6］Valerian T D，K enny.B L Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry［J］.Chem Rev，1998，98（5）：1741-1742

［7］童林薈.環糊精化學—-基礎與應用［M］.北京：科學出版社，2001：1-8

［8］張鈺，程度勝.β-環糊精及衍生物再生物制藥領域中的應用［J］.生物技術通訊，2003，14（5）：433-435

［9］任光明，徐芬，李志英.微波提取生地多糖的工藝研究［J］.現代食品科技，2010，23（3）：51-52

［10］王延峰，李延清，郝永紅，等.超聲波法提取銀杏葉黃酮的研究［J］.食品科學，2002，23（8）：166-167

［11］馮濤.竹葉總黃酮提取及純化工藝的研究［D］.天津：天津科技大學，2003：19-22

［12］周斌.用超聲波提取中藥材［J］.安徽科技，2005（4）：23-24

［13］胡忠澤，譚志靜，楊久峰，等．超聲提取姜黃素最佳工藝研究［J］.中國實驗方劑學志，2005，11（2）：6-7

［14］李躍忠，縱偉，董海麗，等．枇杷葉中熊果酸的提取、分離工藝研究［J］.食品與生物，2008，112（3）：5-6

Study on the Ursolic Acid Ultrasonic-assisted Extraction of β-Cyclodextrin from the Hawthorn

SHI Rui，ZHANG Ning，LI Zhi-ying，HE Rui-rui，YU Hui-jing
（Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

To study the extraction of ursolic acid from Hawthorn by ultrasonic-assisted β-CD.The yield of the ursolic acid was determined by UV-spectrophotometry，based on the single factor test and orthogonal test using ursolic acid as an index.The influence of various factors on the extraction process of ultrasonic wave was detected.The optimum extraction conditions were 80%ethanol concentration，ultrasonic power of 240 W，extraction time of 30 min，liquid-solid ratio of 30∶1（mL/g），the temperature of 50℃，β-CD of the amount m（hawthorn）∶m（β-CD）of 1∶1.Ursolic acid yield of Hawthorn：7.264 mg/g.The yield of ursolic acid was obviously increased in the presence of β-CD.The results shows of contrast test：ursolic acid on escherichia coli，bacillus subtilis has antibacterial effect.

crataegus；ursolicacid；ultrasonic-assisted；β-cyclodextrin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.022

忻州師范學院青年基金項目（20126）

石瑞（1985—），女（漢），助教，碩士，主要從事植物營養及逆境生理生化研究。

2016-01-04