三重PCR檢測黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌

高士剛， 曾 蓉， 徐麗慧， 羅金燕， 陳 磊， 戴富明

（1上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403；2上海市設施園藝重點實驗室，上海 201403；3上海市農業技術推廣服務中心，上海 201103）

三重PCR檢測黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌

高士剛1，2， 曾 蓉1，2， 徐麗慧1，2， 羅金燕3， 陳 磊3， 戴富明1，2

（1上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403；2上海市設施園藝重點實驗室，上海 201403；3上海市農業技術推廣服務中心，上海 201103）

【目的】開發一種可同時檢測黃瓜靶斑病菌（Corynespora cassiicola）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和黃瓜細菌性角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）的三重PCR快速檢測方法。【方法】根據ITS或16S rDNA序列分別設計黃瓜靶斑病原菌、黃瓜炭疽病菌和黃瓜細菌性角斑病菌特異性檢測引物；通過鑒定引物的特異性，篩選可在目標菌株中擴增出特異片段的特異引物；選擇可以組合的3種病原菌特異性引物進行三重PCR，對引物濃度、退火溫度、延伸時間和循環數分別進行優化，優化三重PCR體系。【結果】針對黃瓜靶斑病菌、黃瓜炭疽病菌和黃瓜細菌性角斑病菌分別設計出5對、7對和6對特異性引物，其中引物CC4F/CC4R 和CC5F/CC5R可特異擴增黃瓜靶斑病菌ITS，引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特異擴增黃瓜炭疽病菌ITS，引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特異擴增黃瓜細菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R擴增片段長度分別為370、275和698 bp，其混合擴增產物可在3%瓊脂糖凝膠上得到充分分離，這3對引物選擇作為三重PCR引物。在三重PCR反應體系中，當引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的終濃度分別為0.16、0.4和0.16 μmol·L-1時，3個目的片段能同時得到有效擴增；當退火溫度大于65℃時，部分目的片段不能有效擴增。最終建立并驗證了適合上述3種黃瓜主要病原菌的三重PCR檢測體系，即25 μL PCR反應體系中含有12.5 μL 2×HiffTMPCR Master Mix（With Dye）、0.16 μmol·L-1CC5F/CC5R、0.4 μmol·L-1CL3F/CL5R、0.16 μmol·L-1PS3F/PS4R。反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。【結論】建立的三重PCR方法能夠快速檢測田間采集的黃瓜發病葉片中的黃瓜靶斑病菌、黃瓜炭疽病菌和黃瓜細菌性角斑病菌，靈敏度均可達到0.4 pg·μL-1。

黃瓜靶斑病菌；黃瓜炭疽病菌；黃瓜細菌性角斑病菌；分子檢測；三重PCR

0　引言

【研究意義】黃瓜靶斑病菌多主棒孢（Corynespora cassiicola）是半知菌亞門棒孢屬（Corynespora）的植物病原真菌，其寄主范圍十分廣泛，可危害黃瓜、茄子、番茄、煙草、橡膠等多種蔬菜和經濟作物。該病菌危害黃瓜葉片形成靶斑病，嚴重時也可侵染葉柄和莖蔓，已成為影響黃瓜生產的重要病害之一［1-2］。黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和丁香假單胞桿菌流淚病致病變種（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）也是黃瓜上另外兩個重要的病原菌，分別引起黃瓜炭疽病［3-4］和黃瓜細菌性角斑病［5］。黃瓜炭疽病從幼苗到成株期均可發病，嚴重時葉片干枯，莖蔓和葉柄染病；黃瓜細菌性角斑病主要危害葉片和瓜條。黃瓜靶斑病、炭疽病和細菌性角斑病早期在黃瓜葉片上常常會形成相似癥狀而難于區分，如黃瓜靶斑病在不同黃瓜品種上的早期癥狀表現為黃褐色小斑點，周圍有時會有黃色暈圈，易與細菌性角斑病、炭疽病混淆［6］，因此，生產上容易誤將防治炭疽病或細菌性角斑病的農藥用于靶斑病的防治，導致防治效果不佳，也耽誤了正確用藥的最佳時機。病害的早期防治對病害的發生及控制非常關鍵，因此在病害的發病初期進行準確快速的診斷具有重要意義。【前人研究進展】傳統的病害診斷方法主要是根據植株的發病癥狀、病原的形態特征和柯赫氏法則［7-10］，但是操作復雜、耗時，往往耽誤病害防治的關鍵時期。近年來，PCR分子檢測技術廣泛應用于病害的診斷，使得病害診斷更加準確、快速、便捷［7］，目前已經有利用多種PCR技術如常規PCR、實時熒光定量PCR和三重PCR快速分子檢測黃瓜病原菌的報道。陳璐等［6］利用常規PCR特異擴增actin基因片段來檢測黃瓜靶斑病菌；王偉青等［11］根據ITS序列開發出黃瓜靶斑病種子帶菌的特異性 PCR分子檢測方法，可特異檢測出帶菌種子；高葦等［12］利用實時熒光定量PCR技術，建立了快速、準確、特異檢測土壤中黃瓜靶斑病菌的方法；KUAN等［13-14］分別利用real-time PCR技術建立了特異檢測炭疽病菌的方法；王哲等［15-16］分別利用PCR技術建立了快速檢測黃瓜細菌性角斑病菌的方法；王楠等［17］利用三重 PCR技術同時特異檢測黃瓜炭疽病菌、菌核病菌和細菌性萎蔫病菌，提高了檢測效率。【本研究切入點】上述研究主要是針對黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌中的單一病菌進行 PCR分子檢測，因此開發同時檢測黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌的三重 PCR特異檢驗方法可以提高黃瓜靶斑病、炭疽病和細菌性角斑病的早期診斷效率。【擬解決的關鍵問題】分別設計黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌的特異性引物，建立三重PCR檢測方法并對其反應體系及反應條件進行優化，開發一種快速、靈敏的檢測方法，為這3種病害的早期防控提供技術支持。

1　材料與方法

試驗于2014年9月至2015年12月在上海市農業科學院生態環境保護研究所完成。

1.1供試菌株

供試菌株的種名、來源及數量見表 1，其中黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌為檢測病菌。

1.2 基因組DNA提取

1.2.1 病原真菌基因組 DNA的提取 從上海田間新采集的黃瓜白粉病和黃瓜霜霉病發病葉片表面分別刮取專性寄生真菌白粉菌和古巴假霜霉菌孢子，參照HARJU等［18］的方法提取其基因組DNA。灰葡萄孢、鏈格孢、尖鐮孢黃瓜專化型、新月彎孢霉、擬盤多毛孢、辣椒疫霉、串珠鐮孢和膠孢炭疽等兼性寄生真菌分別在PDA平板上28℃黑暗培養7 d后，用接種針挑取適量菌絲，利用CTAB法［19］提取兼性寄生真菌基因組DNA。本文提取的所有基因組DNA均采用Infinite M200 PRO NanoQuant（TECAN，瑞士）進行濃度測定。

1.2.2 病原細菌基因組 DNA的提取 分別挑取黃瓜細菌性角斑病菌丁香假單胞桿菌流淚致病變種和瓜類細菌性果斑病菌嗜酸菌西瓜亞種單菌落接種于 5 mL TSB培養基中，37℃振蕩（200 r/min）培養至穩定期，參照SUO等［20］的方法提取其基因組DNA。

1.2.3 發病組織DNA的快速提取 黃瓜在溫室大棚生長至16—18葉期時，分別接種黃瓜炭疽病菌和細菌性角斑病菌。采集發病早期即1級（病斑面積占整個葉面積的5%以下）或3級（病斑面積占整個葉面積的5%—10%）黃瓜炭疽病和細菌性角斑病的發病葉片，同時采集自然發病的1級或3級黃瓜靶斑病葉片和未發病的健康葉片。黃瓜靶斑病和炭疽病葉片病害分級標準參考國標 GB/T 17980.112—2004，黃瓜細菌性角斑病葉片病害分級標準參考國標GB/T 17980.110—2004。從新鮮發病葉片和健康葉片上分別剪取等質量的發病組織和健康葉片，根據 WANG等［21］的方法快速提取發病組織和健康葉片基因組DNA。

1.3 特異性引物設計

分別以多主棒孢、黃瓜炭疽病菌、灰葡萄孢、古巴假霜霉菌、白粉菌和鏈格孢等基因組DNA為PCR模板，用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4［22］擴增它們的ITS序列。PCR反應體系為25.0 μL：2×HiffTMPCR plus Master Mix（With Dye）（上海翊圣生物科技有限公司）12.5 μL，ITS1/ITS4（10 μmol·L-1）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。利用MEGA 4.0軟件對上述各真菌ITS序列進行序列比對，再利用引物設計軟件Primer Premier 5.0分別設計多主棒孢和黃瓜炭疽病菌的特異性引物（圖1）。

表1　供試菌株Table 1 Fungal and bacterial strains used in this study

分別以丁香假單胞桿菌流淚致病變種及其近緣物種嗜酸菌西瓜亞種基因組DNA為PCR模板，用細菌16S rDNA通用引物F27/R1492［23］擴增其16S rDNA，PCR反應體系及條件同上。利用上述同樣方法設計丁香假單胞桿菌流淚致病變種的特異性引物（圖 2）。本文所用引物序列如表2所示。

1.4 特異性引物篩選

圖1　黃瓜靶斑病菌和炭疽病菌的特異引物設計Fig. 1 Design of specific primers for C. cassiicola and C. orbiculare

圖2　黃瓜細菌性角斑病菌的特異引物設計Fig. 2 Design of specific primers for P. syringae pv. lachrymans

表2　引物及其序列Table 2 Primers used in this study

分別以各病菌基因組DNA做PCR模板，篩選針對多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種單一菌株的特異性引物。引物組合 CC1F/ CC1R、CC2F/CC2R、CC3F/CC3R、CC4F/CC4R、CC5F/ CC5R分別擴增多主棒孢ITS；CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、 CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R、CL3F/CL7R分別擴增黃瓜炭疽病菌ITS；PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS3F/PS4R、PS4F/PS3R、PS4F/PS4R分別擴增丁香假單胞桿菌流淚致病變種16S rDNA。PCR反應體系為25.0 μL：2×HiffTMPCR plus Master Mix（With Dye）12.5 μL，正向/反向引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，DNA模板（2 ng·μL-1）2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR反應結束后，取6 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。最終篩選出引物組合CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特異擴增多主棒孢ITS；CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特異擴增黃瓜炭疽病菌 ITS；PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特異擴增丁香假單胞桿菌流淚致病變種16S rDNA。

1.5 三重PCR反應體系建立及優化

1.5.1 引物組合的選擇 引物組合 CC5F/CC5R、CL3F/CL5R和 PS3F/PS4R擴增片段的長度分別為370、275和698 bp，其混合產物可在3%瓊脂糖凝膠上被有效分離，因此選擇作為三重PCR引物。

1.5.2 引物濃度優化 為了在同一三重PCR反應中使 3個目的片段均得到有效擴增，需要對 CC5F/ CC5R、CL3F/CL5R和PS3F/PS4R的濃度進行優化。在25 μL PCR反應體系中，設定CC5F/CC5R的3個濃度梯度為0.08、0.16和0.24 μmol·L-1，CL3F/CL5R 的 3個濃度梯度為 0.24、0.32和 0.40 μmol·L-1，PS3F/PS4R的3個梯度為0.16、0.24和0.32 μmol·L-1。根據3對引物3個不同濃度梯度，設置18個引物用量組合（表3）。三重PCR反應體系為25.0 μL：2×HiffTMPCR plus Master Mix（With Dye）12.5 μL，CC5F/CC5R （10 μmol·L-1） 0.2/0.4/0.6 μL，CL3F/CL5R（10 μmol·L-1）0.6/0.8/1.0 μL，PS3F/PS4R（10 μmol·L-1）0.4/0.6/0.8 μL，多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種基因組DNA（2 ng·μL-1）各2.0 μL，補加ddH2O至25.0 μL。三重PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR反應結束后，取6 μL PCR產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.3 退火溫度優化 設定 65、66、67和 68℃ 4個退火溫度梯度。三重PCR反應體系為25.0 μL：2× HiffTMPCR plus Master Mix（With Dye）12.5 μL，CC5F/CC5R（10 μmol·L-1）0.4 μL，CL3F/CL5R（10 μmol·L-1）1.0 μL，PS3F/PS4R（10 μmol·L-1）0.6 μL，多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種基因組DNA（2 ng·μL-1）各2.0 μL，補加ddH2O 至25.0 μL。三重PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，65/66/67/68℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR反應結束后，取6 μL PCR產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.5.4 延伸時間和循環次數優化 設定 0.5、1、1.5 和2 min 4個延伸時間；25、30、35、40和45次5個循環次數。最終確定最佳延伸時間為 2 min，最佳循環次數為35次。

表3　三重PCR反應體系中引物CC5F/CC5R、PS3F/PS4R和CL3F/CL5R的濃度Table 3 Concentration of CC5F/CC5R， PS3F/PS4R and CL3F/ CL5R used in triplex PCR

1.6 三重PCR特異性檢測

根據多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種基因組DNA的濃度，將3種病菌基因組DNA等量混勻。分別以多主棒孢、灰葡萄孢、古巴假霜霉菌、白粉菌、黃瓜炭疽病菌、丁香假單胞桿菌流淚致病變種和鏈格孢基因組DNA以及多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種混合基因組DNA做模板，利用優化好的三重PCR反應體系和條件進行三重PCR，驗證該三重PCR體系的特異性。

1.7 三重PCR靈敏度分析

在 25 μL反應體系中，將 3種目標病菌基因組DNA模板濃度 10倍梯度稀釋至 0.4 ng·μL-1、0.04 ng·μL-1、4 pg·μL-1、0.4 pg·μL-1、0.04 pg·μL-1、4 fg·μL-1、0.4 fg·μL-1和0.04 fg·μL-1。利用優化好的三重PCR體系和條件進行擴增，根據擴增產物的 3%瓊脂糖凝膠電泳結果確定三重PCR反應的靈敏度。

1.8 黃瓜發病葉片DNA的特異檢測

根據黃瓜靶斑病、黃瓜炭疽病和黃瓜細菌性角斑病發病葉片的基因組DNA濃度，將3種發病葉片基因組DNA等量混勻以及兩兩混勻，分別作為三重PCR特異檢測體系的DNA模板，同時以健康葉片基因組DNA作為對照。利用優化好的三重PCR體系進行擴增，特異檢測發病葉片中的黃瓜靶斑病菌、黃瓜炭疽病菌和黃瓜細菌性角斑病菌，驗證該三重PCR特異檢測體系。

2　結果

2.1 引物組合CC5F/CC5R、CL3F/CL5R和PS3F/PS4R

的特異性檢測

CC5F/CC5R、CL3F/CL5R和PS3F/PS4R分別在多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種基因組DNA中擴增出370、275和 698 bp的特異性目的片段，而在灰葡萄孢、古巴假霜霉菌、白粉菌、鏈格孢、嗜酸菌西瓜亞種、尖鐮孢黃瓜專化型、新月彎孢、擬盤多毛孢、辣椒疫霉、串珠鐮孢、膠孢炭疽等非目標病菌基因組DNA和陰性對照中沒有擴增出條帶（圖3）。

2.2 三重PCR反應體系及條件優化

圖3　引物CC5F/CC5R、CL3F/CL5R和PS3F/PS4R的特異性檢測Fig. 3 Specificity test of CC5F/CC5R， CL3F/CL5R and PS3F/PS4R primer pairs

通過對三重PCR反應體系中引物CC5F/CC5R、CL3F/CL5R和PS3F/PS4R的濃度進行優化，發現25 μL 反應體系中 CC5F/CC5R、CL3F/CL5R 和PS3F/PS4R的終濃度分別為0.16、0.4和0.16 μmol·L-1時能同時有效擴增3個目的片段（圖4）。當三重PCR退火溫度大于 65℃時，部分目的片段不能有效擴增（圖5）。最終優化的三重PCR反應體系：2×HiffTMPCR Plus Master Mix（With Dye）12.5 μL，CC5F/CC5R、CL3F/CL5R和PS3F/PS4R的終濃度分別是0.16、0.4 和0.16 μmol·L-1，3種目標病菌基因組DNA模板（2 ng·μL-1）各2.0 μL，補加ddH2O至25.0 μL；優化的三重PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。

圖4　三重PCR引物濃度優化Fig. 4 Optimization for the concentration of primers used in triplex PCR

圖5　三重PCR退火溫度優化Fig. 5 Optimization for the annealing temperature of triplex PCR

2.3 三重PCR特異性檢測

利用優化的三重PCR，同時擴增目標和非目標病菌基因組DNA，以檢測該三重PCR擴增目標病菌基因組DNA的特異性。結果表明，該三重PCR可在目標菌株的混合或非混合基因組DNA中擴增出清晰的特異性目的條帶，即在多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種基因組DNA中分別擴增出長度為370、275和698 bp的特異條帶，而在灰葡萄孢、古巴假霜霉菌、白粉菌、鏈格孢、嗜酸菌西瓜亞種、尖鐮孢黃瓜專化型、新月彎孢、擬盤多毛孢、辣椒疫霉、串珠鐮孢、膠孢炭疽等非目標病菌基因組DNA和陰性對照中沒有擴增出條帶（圖6）。

2.4 三重PCR檢測體系靈敏度分析

為了確定優化后三重PCR的靈敏度，將25 μL反應體系中多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種基因組DNA的濃度從0.4 ng·μL-1依次10倍梯度稀釋至0.04 fg·μL-1，并用優化的反應體系及條件進行擴增。結果表明，三重PCR同時擴增3個模板時，能夠檢測到0.4 pg·μL-1的基因組DNA（圖7）。

2.5 黃瓜發病葉片的三重PCR快速檢測

在25 μL PCR反應體系中，分別以發病黃瓜葉片基因組DNA做模板，同時以多主棒孢、黃瓜炭疽病菌和丁香假單胞桿菌流淚致病變種等量混合基因組DNA做陽性對照，利用三重PCR特異檢測這3種病菌。結果顯示，在黃瓜靶斑病、黃瓜炭疽和黃瓜細菌性角斑病的黃瓜發病葉片基因組DNA中分別能擴增出長度為370、275和698 bp的特異片段，其長度與陽性對照一致，而在健康黃瓜葉片DNA和陰性對照中沒有擴增出條帶（圖8），說明該三重PCR檢測體系可以對發病葉片中的目標病菌進行特異檢測，可以同時對黃瓜靶斑病、黃瓜炭疽病和黃瓜細菌性角斑病進行早期快速分子診斷。

圖6　三重PCR特異檢測病菌Fig. 6 Specific detection of triplex PCR for pathogens

圖7　三重PCR靈敏度分析Fig. 7 Sensitivity assay of triplex PCR

圖8　三重PCR特異擴增病菌侵染的黃瓜葉片DNAFig. 8 Specific amplification for the mix of pathogen-infected cucumber tissues DNA by triplex PCR

3　討論

多重 PCR主要應用于多種病原微生物的同時檢測，具有省時、成本低、效率高的優點［24］。黃瓜靶斑病、炭疽病和細菌性角斑病在癥狀上存在相似之處，在病害診斷上容易將這3種病害混淆。此外，針對單一病害的分子檢測不能快速、準確對病害進行甄別，往往錯用防治藥劑或耽擱病害的最佳防治時期。因此，亟需開發一種同時檢測這3種病害的多重PCR檢測技術。

目前，針對瓜類黑星病菌、枯萎病菌和蔓枯病菌以及黃瓜炭疽病菌、菌核病菌和細菌性萎蔫病菌的三重PCR檢測已經有報道［17，25］，但針對黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌的三重 PCR檢測方法未見相關報道，只是對單一病菌進行特異分子檢測［6，16］。多重PCR體系中存在兩對以上引物，因此必須保證多對引物之間不形成引物二聚體；同時又要確保擴增產物的片段長度不能太接近，否則難以在瓊脂糖凝膠上得到充分的分離；由于在擴增時不同引物對之間競爭其他反應組分，必須對反應體系中不同引物對的濃度進行優化［26］。除了引物之外，Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、退火溫度、延伸時間和循環次數等對多重PCR結果也均有影響［24，26］。為了簡化多重PCR操作過程，本試驗選用2×HiffTMPCR Plus Master Mix來替代Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2，不需要對Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2進行優化。因此本試驗對引物濃度、退火溫度、延伸時間和循環次數進行了優化，摸索出可同時檢測黃瓜靶斑病菌、黃瓜炭疽病菌和黃瓜細菌性角斑病菌最優的三重PCR反應體系及條件。

該三重PCR檢測體系的靈敏度可達0.4 pg·μL-1，與高永洋等（1 pg·μL-1）［25］和王楠等（0.4 pg·μL-1）［17，27］開發的三重PCR檢測方法接近，處于同一數量級上；比陳璐等（4 pg·μL-1）［6］的黃瓜靶斑病菌PCR檢測方法高1個數量級，但比王偉青等（50—100 fg·μL-1）［11］的黃瓜靶斑病種子帶菌PCR分子檢測低約1個數量級，可能是由于引物擴增效率和引物擴增序列的拷貝數不同導致這種差異［28］。

4　結論

三重PCR反應體系25 μL：12.5 μL 2×HiffTMPCR Plus Master Mix（With Dye），0.16 μmol·L-1CC5F/ CC5R、0.4 μmol·L-1CL3F/CL5R和0.16 μmol·L-1PS3F/ PS4R；三重 PCR反應程序：95℃預變性 3 min，35個循環（95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min），最后72℃延伸10 min。該檢測體系可在4 h內從田間病株葉片中檢測出黃瓜靶斑病菌、炭疽病菌和細菌性角斑病菌，其靈敏度可達0.4 pg·μL-1。

References

［1］ 曾蓉， 陸金萍， 戴富明. 上海地區黃瓜靶斑病病原鑒定及ITS的分析. 上海交通大學學報 （農業科學版）， 2011， 29（4）： 13-16. ZENG R， LU J P， DAI F M. Pathogen identification of cucumber target spot diseae in Shanghai and its sequence analysis. Journal of Shanghai Jiaotong University （Agricultural Science）， 2011， 29（4）：13-16. （in Chinese）

［2］ SHIMOMOTO Y， SATO T， HOJO H， MORITA Y， TAKEUCHI S，

MIZUMOTO H， KIBA A， HIKICHI Y. Pathogenic and genetic variation among isolates of Corynespora cassiicola in Japan. Plant Pathology， 2011， 60（2）： 253-260.

［3］ IRIEDA H， TAKANO Y. Identification and characterization of virulence-related effectors in the cucumber anthracnose fungus Colletotrichum orbiculare. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2016， 95： 87-92.

［4］ FUKADA F， KUBO Y. Colletotrichum orbiculare regulates cell cycle G1/S progression via a two-component GAP and a GTPase to establish plant infection. The Plant Cell， 2015， 27（9）： 2530-2544.

［5］ CHOJAK J， KU?NIAK E， ?WIERCZ U， SEKULSKA- NALEWAJKO J，GOC?AWSKI J. Interaction between salt stress and angular leaf spot （Pseudomonas syringae pv. lachrymans） in cucumber. Vegetable Crops Research Bulletin， 2012， 77： 5-16.

［6］ 陳璐， 石延霞， 謝學文， 柴阿麗， 李寶聚. 黃瓜棒孢葉斑病菌 PCR檢測方法的建立. 園藝學報， 2014， 41（3）： 585-592. CHEN L， SHI Y X， XIE X W， CHAI A L， LI B J. PCR assay for detection of Corynespora cassiicola， the causal agent of Corynespora leaf spot of cucumber. Acta Horticulturae Sinica， 2014， 41（3）：585-592. （in Chinese）

［7］ MA Z H， MICHAILIDES T J. Approaches for eliminating PCR inhibitors and designing PCR primers for the detection of phytopathogenic fungi. Crop Protection， 2007， 26（2）： 145-161.

［8］ LIEVENS B， THOMMA B P. Recent developments in pathogen detection arrays： implications for fungal plant pathogens and use in practice. Phytopathology， 2005， 95（12）： 1374-1380.

［9］ ALVAREZ A M. Integrated approaches for detection of plant pathogenic bacteria and diagnosis of bacterial diseases. Annual Review of Phytopathology， 2004， 42： 339-366.

［10］ 劉志恒， 鄭川， 黃欣陽， 唐爽爽， 李健冰， 焦俊. 茄子絨菌斑病病原菌鑒定及生物學特性研究. 植物保護， 2014， 40（3）： 58-64. LIU Z H， ZHENG C， HUANG X Y， TANG S S， LI J B， JIAO J. Pathogen identification and biological characteristics of eggplant leaf mold. Plant Protection， 2014， 40（3）： 58-64. （in Chinese）

［11］ 王偉青， 岳瑾， 董杰. 黃瓜棒孢葉斑病種子帶菌PCR分子檢測. 中國植保導刊， 2013， 33（8）： 13-17. WANG W Q， YUE J， DONG J. Molecular detection of Corynespora cassiicola in cucumber seed by PCR. China Plant Protection， 2013，33（8）： 13-17. （in Chinese）

［12］ 高葦， 李寶聚， 王萬立， 郝永娟， 石延霞. 土壤中黃瓜棒孢葉斑病病原菌實時熒光定量PCR檢測技術研究. 華北農學報， 2014， 29（2）：71-74. GAO W， LI B J， WANG W L， HAO Y J， SHI Y X. Detection of Corynespora cassiicola in soil with real-time quantitative PCR. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2014， 29（2）： 71-74. （in Chinese）

［13］ KUAN C P， WU M T， HUANG H C， CHANG H. Rapid detection of Colletotrichum lagenarium， causal agent of anthracnose of cucurbitaceous crops， by PCR and real-time PCR. Journal of Phytopathology， 2011，159（4）： 276-282.

［14］ YANG H C， HAUDENSHIELD J， HARTMAN G. Multiplex real-time PCR detection and differentiation of Colletotrichum species infecting soybean. Plant Disease， 2015， 99（11）： 1559-1568.

［15］ 王哲， 陳青， 田茜， 李志紅， 朱水芳， 趙文軍. 應用 PCR方法快速檢測黃瓜細菌性角斑病菌. 植物檢疫， 2011， 25（6）： 29-32. WANG Z， CHEN Q， TIAN Q， LI Z H， ZHU S F， ZHAO W J. Using PCR for rapid detection of Pseudomonas syringae pv. lachrymans. Plant Quarantine， 2011， 25（6）： 29-32. （in Chinese）

［16］ 王平， 樊金娟， 劉長遠， 趙奎華， 梁春浩. 黃瓜細菌性角斑病的分子檢測. 中國農學通報， 2012， 28（25）： 150-153. WANG P， FAN J J， LIU C Y， ZHAO K H， LIANG C H. The detection of Pseudomonas syringae pv. based on PCR. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2012， 28（25）： 150-153. （in Chinese）

［17］ 王楠， 王偉. 三重 PCR檢測黃瓜炭疽病菌、菌核病菌和細菌性萎蔫病菌. 植物病理學報， 2014， 44（2）： 129-138. WANG N， WANG W. Triplex PCR detection of Colletotrichum orbiculare， Sclerotinia sclerotiorum and Erwinia tracheiphila in infected cucumber tissues. Acta Phytopathologica Sinica， 2014， 44（2）：129-138. （in Chinese）

［18］ HARJU S， FEDOSYUK H， PETERSON K R. Rapid isolation of yeast genomic DNA： Bust n' Grab. BMC Biotechnology， 2004， 4： 8.

［19］ GAO S G， ZHOU F H， LIU T， LI Y Y， CHEN J. A MAP kinase gene，Clk1， is required for conidiation and pathogenicity in the phytopathogenic fungus Curvularia lunata. Journal of Basic Microbiology， 2013， 53：214-223.

［20］ SUO Y J， HUANG Y Y， LIU Y H， SHI C L， SHI X M. The expression of superoxide dismutase （SOD） and a putative ABC transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G. PLoS ONE， 2012， 7（10）： e48467.

［21］ WANG H， QI M， CUTLER A J. A simple method of preparing plant samples for PCR. Nucleic Acids Research， 1993， 21（17）： 4153-4154.

［22］ WHITE T J， BRUNS T， LEE S， TAYLOR J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics//INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， WHITE T J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. London， USA： Academic Press，1990： 315-322.

［23］ LANE D J. 16S/23S rRNA sequencing//STACKEBRANDT E，GOODFELLOW M. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. NY， USA： John Wiley & Sons New York， 1991： 115-175.

［24］ 趙紅慶， 苑錫銅， 黃留玉. 多重PCR技術在病原檢測中的應用. 生物技術通訊， 2007， 18（5）： 863-865. ZHAO H Q， YUAN X T， HUANG L Y. Application of multiplex PCR in detection of pathogens. Letters in Biotechnology， 2007， 18（5）：863-865. （in Chinese）

［25］ 高永洋， 王楠， 高觀朋， 王偉. 瓜黑星病菌、枯萎病菌和蔓枯病菌的三重PCR檢測. 植物病理學報， 2010， 40（4）： 343-350. GAO Y Y， WANG N， GAO G P， WANG W. Triplex PCR detection of Cladosporium cucumerinum， Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues. Acta Phytopathologica Sinica， 2010， 40（4）： 343-350. （in Chinese）

［26］ MARKOULATOS P， SIAFAKAS N， MONCANY M. Multiplex polymerase chain reaction： a practical approach. Journal of Clinical Laboratory Analysis， 2002， 16（1）： 47-51.

［27］ 王楠， 王劍， 尹丹韓， 高觀朋， 王偉. 三重 PCR檢測草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黃萎病菌. 中國農業科學， 2010， 43（21）： 4392-4400. WANG N， WANG J， YIN D H， GAO G P， WANG W. Triplex PCR detection of Botrytis cinerea， Colletotrichum gloeosporioides and Verticillium dahliae in infected strawberry plant tissues. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（21）： 4392-4400. （in Chinese）

［28］ EDWARDS M C， GIBBS R A. Multiplex PCR： advantages development， and application. PCR Methods and Applications， 1994，3（4）： 65-75.

（責任編輯 岳梅）

Triplex PCR Detection for Corynespora cassiicola， Colletotrichum orbiculare and Pseudomonas syringae pv. lachrymans

GAO Shi-gang1，2， ZENG Rong1，2， XU Li-hui1，2， LUO Jin-yan3， CHEN Lei3， DAI Fu-ming1，2
（1Institute of ECO-Environment and Plant Protection， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201403；2Key Laboratory of Horticultural Facilities in Shanghai， Shanghai 201403；3Shanghai City Agricultural Technology Extension and Service Center， Shanghai 201103）

【Objective】The objective of this study is to develop a rapid triplex PCR detection method of Corynespora cassiicola， Colletotrichum orbiculare and Pseudomonas syringae pv. lachrymans. 【Method】 Specific primers for the three pathogens were designed based on ITS sequences of C. cassiicola and C. orbiculare and 16S rDNA sequence of P. syringae pv. lachrymans， which were confirmed by amplifying specific fragments. Three pairs of primers specific to C. cassiicola， C. orbiculare or P. syringae pv. lachrymans were suitable for triplex PCR and selected for triplex PCR. Primer concentration， annealing temperature， extension time and cycle number were optimized to develop the triplex PCR detection system. 【Result】Five， seven andsix pairs of primers were designed specific to C. cassiicola， C. orbiculare and P. syringae pv. lachrymans， respectively. CC4F/CC4R and CC5F/CC5R primers could specifically amplify ITS sequence of C. cassiicola； CL1F/CL1R， CL2F/CL2R， CL3F/CL3R，CL3F/CL4R， CL3F/CL5R， CL3F/CL6R and CL3F/CL7R could specifically amplify ITS sequence of C. orbiculare； PS3F/PS4R and PS4F/PS4R primers could specifically amplify 16S rDNA sequence of P. syringae pv. lachrymans. Fragments in lengths of 370， 275 and 698 bp were amplified by CC5F/CC5R， CL3F/5R and PS3F/4R， respectively， which were separated fully by 3% agarose gel electrophoresis， and the three pairs of primers were used for triplex PCR. Three target fragments were amplified effectively with 0.16 μmol·L-1of CC5F/CC5R， 0.4 μmol·L-1of CL3F/5R and 0.16 μmol·L-1of PS3F/4R in 25 μL of triplex PCR system. Part target fragments were not amplified effectively at ＞65℃ of annealing temperature. Finally， the triplex PCR system suitable for the detection of C. cassiicola， C. orbiculare and P. syringae pv. lachrymans were developed and confirmed. This PCR system contained 12.5 μL of 2×HiffTMPCR Master Mix （With Dye）， 0.16 μmol·L-1of CC5F/CC5R， 0.4 μmol·L-1of CL3F/CL5R and 0.16 μmol·L-1of PS3F/PS4R. The PCR program was as follows： an initial denaturation at 95℃ for 3 min followed by 35 cycles of denaturation （95℃for 30 s）， annealing （65℃ for 30 s） and extension （72℃ for 2 min）， and a final extension at 72℃ for 10 min. 【Conclusion】The detection method could rapidly detect C. cassiicola， C. orbiculare and P. syringae pv. lachrymans from leaves infected by the three pathogens， the sensitivity of which was 0.4 pg·μL-1.

Corynespora cassiicola； Colletotrichum orbiculare； Pseudomonas syringae pv. lachrymans； molecular detection；triplex PCR

2016-01-28；接受日期：2016-02-24

上海市科技興農重點攻關項目［滬農科攻字（2012）第2-10號，滬農科攻字（2013）第5-3號］、上海市科技興農重大項目［滬農科重字（2010）第4-1號］

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