BCBP 與牛血清白蛋白相互作用熱力學

郭清蓮　何歡　潘凌立　劉義

（1武漢大學中南醫院檢驗科，武漢430071；2武漢大學化學與分子科學學院，武漢430072；3鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）急診科，湖北黃石435002）

BCBP 與牛血清白蛋白相互作用熱力學

郭清蓮1，*何歡2潘凌立3劉義2

（1武漢大學中南醫院檢驗科，武漢430071；2武漢大學化學與分子科學學院，武漢430072；3鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）急診科，湖北黃石435002）

塞來昔布衍生物是一類應用非常廣泛的治療急慢性炎癥的新型非甾體抗炎藥。本文綜合利用熒光光譜、紫外吸收光譜、圓二色譜和分子模擬等方法，研究了塞來昔布衍生物1-苯磺酰胺-3-羧基-5-苯基吡唑（BCBP）與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的熱力學行為。熒光光譜和紫外吸收光譜的分析表明：BCBP能有效猝滅BSA的內源熒光，猝滅機制為靜態猝滅。通過所獲取的相互作用熱力學參數，可知兩者之間的相互作用是一個吉布斯自由能降低的自發過程，且二者之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。圓二色譜的分析發現BCBP引起BSA的構象發生改變，其α-螺旋含量降低，無規卷曲含量升高。分子對接的結果與實驗結果相符。

塞來昔布衍生物；牛血清白蛋白；相互作用；熱力學參數

1　引言

炎癥是機體對感染的一種防御機制，主要表現為紅腫、疼痛等1。疾病的產生往往伴隨著炎癥，抗炎藥則在治療疾病和恢復健康過程中起著至關重要的作用。選擇性環氧合酶2（COX-2）抑制劑是一類應用非常廣泛的治療急慢性炎癥的新型非甾體抗炎藥（NSAIDs），具有很好的抗炎活性和較小的胃腸道不良反應2，3。塞來昔布是第一個上市的選擇性COX-2抑制劑，為1，5-二芳基-3-取代的吡唑衍生物，能夠有效地治療各種急性疼痛和各種關節炎伴發的慢性疼痛4，5。

盡管傳統的非甾體抗炎藥具有良好的抗炎活性，臨床研究表明塞來昔布等選擇性COX-2抑制劑具有中風和心肌梗死的風險5，6。發現新型的、毒副作用較低的COX-2抑制劑是當今的研究熱點，而基于塞來昔布結構進行改造是其中一種重要的途徑7，8。大量的構效關系研究9－11顯示，吡唑類化合物母核的1，3，5位取代對非甾體抗炎藥（NIAIDs）的選擇性非常關鍵，而4位取代將會使其對COX-2的選擇性下降。Abdellatif等7，11通過大鼠足跖腫脹法評估了塞來昔布衍生物的抗炎癥活性，發現C-3位羧基取代的塞來昔布系列衍生物具有良好的體內抗炎癥活性，其中BCBP（1-苯磺酰胺-3-羧基-5-苯基吡唑，圖1）的口服給藥半數抑制劑量為104.4 mg?kg－1。Abdellatif等11進一步將BCBP與NO釋放基團通過共價鍵連接，發現其抗炎癥活性提高，心血管副作用降低。

血清白蛋白（SA）是血液中最豐富的載體蛋白，對于藥物在生物體內的運輸有著重要的生理作用，許多生物活性物質，如代謝物、醫藥及其他有機物，與血清白蛋白的親和性，影響它們在體內的分布和新陳代謝12－14。研究血清蛋白與藥物的作用有助于了解藥物的體內運輸性質，對藥物化學和藥物分子設計具有重要的意義15，16?？紤]到抗炎藥物的活性與重要的醫療價值，研究其與蛋白質的相互作用，有助于在分子水平上認識抗炎藥物與蛋白質的作用機理和規律，為藥物分子的設計、修飾與篩選提供有益的啟發與指導。

目前，塞來昔布與生物大分子相互作用引起了較多研究人員的關注，但對于塞來昔布衍生物的相關報道較少。Masomeh等17通過多種光譜手段以及差示掃描量熱法，研究發現塞來昔布能夠有效的與人碳酸酐酶II結合并抑制其活性，這種結合對碳酸酐酶II結構的影響不大，氫鍵和疏水作用對塞來昔布-碳酸酐酶II復合物的形成起關鍵作用。Neelam和Sonu18通過熒光光譜的手段，研究了塞來昔布與人血清白蛋白（HSA）的相互作用，結果表明塞來昔布結合在Site II位點，結合自由能為－27.92 kJ?mol－1。Pereira-Leite等19在模擬生理條件下（4-羥乙基哌嗪乙磺酸、醋酸鈉緩沖溶液，離子強度為0.1 mol?L－1）研究了塞來昔布與磷脂膜的相互作用，發現在pH=5.0條件下（炎癥細胞pH），塞來昔布結合在磷脂膜內部；而在pH=7.4條件下（血漿pH），塞來昔布主要結合在磷脂膜表面。研究塞來昔布衍生物與蛋白質的相互作用，對于了解其在體內的運輸過程以及作用機制，對發現和設計新型低毒副作用COX-2抑制劑具有重要意義。

本文選擇牛血清白蛋白（BSA）作為模型蛋白，利用多種光譜手段和分子模擬的方法，研究了牛血清白蛋白與BCBP的相互作用機制，獲取了兩者相互作用的系列熱力學參數、結合位點和作用力類型等，并研究了BCBP對牛血清白蛋白的構象的影響。

圖1　塞來昔布衍生物1-苯磺酰胺-3-羧基-5-苯基吡唑（BCBP）結構Fig.1　Structure of celecoxib derivatives 1-benzenesulfonamides-3-carboxyl-5-phenyl pyrazole（BCBP）

2　實驗部分

2.1試劑與儀器

帶恒溫系統的F-2500熒光光度計（日本日立公司）；TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；Jasco J-810圓二色光譜儀（日本Jasco公司）。

牛血清白蛋白等均為Sigma公司產品；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等均為分析純；實驗用水為三次亞沸水；BSA等溶液均用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配成。

2.2熒光光譜

熒光猝滅光譜：選定激發波長為λex=280 nm，發射狹縫分別為2.5和5.0 nm，測得研究體系的熒光光譜。在模擬人體生理條件下，測定加入不同量的BCBP時BSA的熒光發射光譜，記錄溫度在298、304、310 K下，波長290－510 nm范圍內的熒光發射光譜。

2.3紫外吸收光譜

紫外-可見吸收光譜：測定各BCBP、BSA以及BCBP與BSA物質的量之比為1:1的溶液吸收光譜，波長范圍350－200 nm。

2.4圓二色（CD）譜

持續氮氣流條件下，室溫時波長范圍為200－260 nm內樣品的CD光譜。比色皿的光路長為0.1 cm，掃描速度200 nm?min－1。在相同實驗條件下，緩沖溶液作為空白，從樣品光譜圖中扣除，實驗的結果由SELCON 3.0軟件進行處理。

2.5分子對接模擬

BSA的晶體結構來自于數據庫Protein Data Bank（PDB），本實驗選擇了蛋白編號為3v03的晶體結構數據20，原始晶體結構數據經去水、加氫、加電荷處理。BCBP三維結構由軟件Sybyl 8.1構建，并用最小能量法進行優化。

3　結果與討論

3.1熒光猝滅機制及猝滅常數

任何能夠通過相互作用（如：激發態反應，分子重排，能量轉移，形成基態復合物及碰撞猝滅等）使熒光物質熒光強度下降的現象，都可稱為熒光猝滅作用21。圖2給出了pH=7.4時在不同濃度BCBP作用下的BSA的熒光猝滅光譜?？梢钥闯觯S著BCBP的不斷加入，其濃度增大，BSA的熒光強度逐漸降低，但最大發射波長并沒有明顯的移動，表明BCBP可以有效猝滅BSA的內源熒光。

圖2　加入不同濃度BCBP之后BSA的熒光光譜Fig.2 Emission spectra of BSAin presence of various concentrations of BCBPc（BSA）=2.0×10－6mol?L－1；106c（BCBP）/（mol?L－1），a－k:0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0，20.0，respectively. F0:fluorescenceintensityof 2.0×10－6mol?L－1BSAsolution；F:fluorescenceintensityof BSAsolutioninthepresenceof variousconcentrationsof BCBP

通常，熒光猝滅過程被認為是猝滅劑和熒光團之間的碰撞過程或者是二者之間形成了復合物，即動態猝滅或者是靜態猝滅22，23。不同的猝滅機制，可以根據溫度對結合常數和粘度的影響及測定熒光壽命的方法，來加以區分。

為了判斷上述體系的猝滅機制，對猝滅過程的熒光實驗結果，按照Stern-Volmer方程24進行處理：

圖3　不同溫度下藥物BCBP與BSA作用的Stern-Volmer關系圖Fig.3Stern-Volmer plots for the quenching of BSAby BCBPat different temperatures

式（1）中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度；KSV表示Stern-Volmer猝滅常數；［Q］表示猝滅劑的濃度；kq表示生物大分子的猝滅速率常數；τ0表示不存在猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命。

一般情況下，對于靜態猝滅，猝滅常數Ksv隨著溫度的升高而減??；相反地，對于動態猝滅，猝滅常數Ksv隨著溫度的升高而增大25，26。

圖3為在研究濃度范圍內，不同溫度下藥物BCBP猝滅BSA熒光的Stern-Volmer關系圖。從圖中可以看出，在pH=7.4時，直線斜率在一定溫度范圍內隨著溫度升高呈明顯下降趨勢。計算各個溫度下的猝滅常數列于表1，表中數據顯示，溫度升高猝滅常數呈規律性減小，表明藥物BCBP對BSA的熒光猝滅機理為靜態猝滅。

在式（1）中，KSV=kqτ0，生物大分子的熒光平均壽命τ0為10－8s，kq可以通過式（1）計算得到，列在表1中。由上述的分析結果可知：KSV的值隨著溫度的升高而減小，且kq值遠大于生物大分子的最大碰撞猝滅速率常數（2.0×1010L?mol－1?s－1），可以判斷上述實驗中的熒光猝滅是由于形成了復合物的靜態猝滅過程。

表1　pH=7.4時不同溫度下藥物BCBP對BSA作用的Stern-Volmer猝滅常數Table 1Stern-Volmer quenching constants for the interaction of BCBPwith BSAat different temperatures and pH=7.4

為了進一步驗證BCBP對BSA的靜態猝滅機理，實驗設計了BSA與BCBP作用的紫外吸收光譜。由于靜態猝滅是由于藥物與BSA形成了基態復合物，因而對于BSA的紫外吸收光譜會發生一定的改變。圖4為T=298 K，pH=7.4時，2.0× 10－6mol?L－1的BSA溶液的紫外吸收（曲線a）、藥物BCBP與BSA的物質的量之比為1:1的混合物溶液的紫外吸收（曲線b）、藥物BCBP與BSA的物質的量之比為1:1的混合物溶液與同等濃度藥物的紫外吸收差譜（曲線c）以及藥物自身的紫外吸收（曲線d）。從圖4中可以看出，在200－300 nm之間，曲線a和c出現了較明顯的差異，說明此時有新物質生成，可以推測這是由于藥物BCBP與BSA形成了基態復合物所致。此結果進一步證明了該體系的猝滅機理為靜態猝滅。

3.2相互作用的熱力學參數和主要作用力

對于靜態猝滅，其熒光猝滅數據可用修正的Stern-Volmer方程（即Lehrer方程）進行處理27：

式（2）中fa為蛋白質（熒光基團）可接近猝滅劑的部分（分數）；Ka為有效猝滅常數，可用作結合常數；ΔF為加入猝滅劑前后熒光強度的變化。以F0/ΔF 對1/［Q］作圖（圖5），即可求得蛋白質與藥物BCBP的結合常數Ka。分別在298、304及310 K三個溫度下，固定BSA的濃度進行熒光滴定，根據方程（2）擬合計算結合常數，列于表2。

圖4　298K時BCBP對BSA紫外吸收光譜的影響Fig.4UV-Vis spectra of interaction of BSAand BCBPat 298 K drug:BCBP

圖5　不同溫度下藥物BCBP與BSA作用的修正Stern-Volmer曲線Fig.5Modified Stern-Volmer plots for the quenching of BSAby BCBPat different temperatures ΔF:F0substractthefluorescenceintensityofBSAsolutioninthe presenceofvariousconcentrationsof BCBP

藥物小分子與蛋白質等生物大分子之間的相互作用，通常包括靜電作用力、疏水作用力、氫鍵、范德華力和空間位阻排斥力等28。根據相互作用的熱力學參數，可以近似判斷活性小分子與生物大分子之間的主要作用力類型。

若在研究的溫度范圍內，反應的焓變沒有明顯變化，視為常數，利用van?t Hoff方程，可以計算相互作用的焓變ΔH和熵變ΔS，進而得到不同溫度下反應的自由能變化ΔG。

表2　不同溫度下藥物BCBP對BSA作用的結合常數及熱力學參數Table 2Binding constants and thermodynamic parameters of BCBP-BSAsystem at different temperatures

式（3）中K為對應溫度下的結合常數，R為摩爾氣體常數。以lnK對1/T作圖，由斜率與截距分別可以計算出焓變ΔH和熵變ΔS，再由下式計算出反應的自由能變：

根據關系式（3）作圖（圖6），并計算出BCBP與BSA相互作用的熱力學參數，結果列于表2。結果表明此過程為焓驅動的自發過程，但負熵變對此過程較為不利。另外，根據ΔH和ΔS均小于0，我們可以推測，BCBP與BSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華力29。

3.3BCBP對血清白蛋白二級結構的影響

圓二色譜在研究蛋白質結構方面具有獨特的優勢，不僅可以在接近生理條件下對蛋白質進行低濃度、無損傷的分析，為蛋白質的構象變化提供相關信息，而且還可以定量推算出其分子中α-螺旋、β-折疊以及無規則卷曲的含量等30。因此該方法在蛋白質結構分析中發揮著重要作用，成為解析蛋白質構象變化的最理想、最常用的方法之一。為了考察BCBP對血清白蛋白二級結構的影響，實驗設計并測試了不同濃度BCBP與BSA相互作用的CD譜。

圖6　藥物BCBP與BSA相互作用的Van?t Hoff關系圖Fig.6Van?t Hoff plot for the interaction of BSAand BCBP

圖7　BCBP與BSA作用的圓二色譜Fig.7CD spectra of BCBP-BSAsystemFrom a to f，［BCBP］:［BSA］=0:1，0.5:1，1:1，2:1，5:1，10:1，respectively.color online

表3　BSA二級結構在不同濃度BCBP作用下的變化Table 3Change of secondary structures of BSAunder the action of different concentrations of BCBP

如圖7所示，隨著BCBP濃度的增加（圖7中a－f），BSA分子典型二級結構的208和222 nm處負的橢圓峰變化不明顯。當加入BCBP時，BSA的負橢圓率峰較未加藥物前總體趨勢是降低的，說明BCBP的加入使BSA的分子結構發生了變化，其α-螺旋含量有所減少，肽鏈結構有所伸展。利用程序SELCON 3.0，可以方便地計算出蛋白質各二級結構的百分比，如表3所示，在BCBP與BSA的摩爾比為1:1時，體系（在實驗濃度范圍內）負橢圓率峰最小，α-螺旋度最低。

3.4BCBP與牛血清白蛋白結合距離

熒光共振能量轉移理論（FRET）被稱作“光譜尺”，廣泛應用于研究生物體系或大分子體系與其它分子間相互作用的結合距離31。當蛋白質與藥物分子的光譜特性符合能量轉移條件時，它們之間就可能發生有效的能量轉移，反映在熒光光譜上是蛋白質的熒光被部分猝滅，猝滅程度取決于蛋白質（供體）與猝滅劑（受體）間的距離及能量轉移效率32，并有：

式（5）中E是供體-受體間能量轉移效率；F和F0分別為存在和不存在能量受體時，供體的熒光發射強度；R為供體與受體之間的真實距離，R0是轉移效率為50%時的臨界距離，其值可由下式求得：

式（6）中K2為偶極空間取向因子，n為介質的折射指數，?為給體的熒光量子產率，J為給體的熒光發射光譜與受體吸收光譜間的光譜重疊積分，即：

圖8　BCBP與BSA的熒光光譜和吸收光譜重疊圖Fig.8Overlapping of the fluorescence spectra of BSA with the absorption spectra of BCBP c（BSA）=c（BCBP）=1.0×10－5mol?L－1

圖9?。╝）BCBP與BSA對接模型；（b）BCBP周圍0.5 nm范圍內的氨基酸殘基Fig.9（a）Docking model of BCBPand BSA；（b）amino acid residues around BCBPin 0.5 nm

式（7）中，F（λ）為熒光授體在波長λ處的熒光強度，ε（λ）為受體在波長λ處的摩爾吸光系數。圖8為BCBP與BSA的物質的量之比為1:1時，BCBP的吸收光譜與BSA的重疊圖。將圖中的光譜重疊部分按式（7）積分，即可求算出J為8.180×10－17cm3?L?mol－1。在上述實驗體系中，取向因子K2取供體和受體各向隨機分布的平均值2/3，折射指數n取水和有機物的平均值1.36，色氨酸的量子產率為?=0.1533，將這些數值帶入式（6）和（7）中，即可求出臨界距離R0為1.69 nm，根據據R0的值，由式（5）計算得BSA內色氨酸殘基與已結合的BCBP分子間距離R為2.60 nm。

3.5分子模擬

大量的研究工作表明：大多數藥物分子與血清白蛋白的作用位置，位于由亞結構域II A和亞結構域III A的疏水腔內，即site I和site II34。BCBP 和BSA分子對接結果的最佳構象見圖9（a），可以看出：BCBP和BSA的作用區域更趨于位于site II，即布洛芬位點。在0.5 nm范圍內，BCBP周圍的氨基酸殘基主要有13個，如圖9（b）所示：LEU386、ILE387、GLN389、PHE402、LEU406、TYR410、LYS413、ARG444、THR448、LEU452、ARG484、PHE487、SER488。此外，BCBP分子磺胺基上的―NH2與ILE387主鏈上的O原子形成了氫鍵（圖9 （b）黑色虛線），這有助于BCBP在BSA疏水腔中穩定存在，這也與前面熱力學數據分析的結果相符合。進一步計算發現，BCBP與BSA發光殘基TRP213的距離（質心間距）為2.43 nm，與前面利用熒光共振能量轉移理論計算出的結果R=2.60 nm非常接近，說明了計算結果的準確性。

4　結論

在模擬人生理條件下，采用光譜和分子對接法，研究了BCBP與BSA相互作用的熱力學行為。由變溫滴定實驗可知，Stern-Volmer猝滅常數KSV隨著溫度的升高而減小，BSA的吸收光譜也在BCBP加入之后發生變化，說明BCBP對BSA的猝滅是生成了復合物的靜態猝滅過程。在獲取的熱力學參數中，焓變和熵變均為負值，說明BCBP與BSA之間相互作用力類型主要是氫鍵和范德華力。CD光譜的結果表明BCBP與BSA的結合會引起BSA構象發生一定的改變，但不顯著。通過熒光共振能量轉移理論，計算出了BCBP與BSA色氨酸的距離約為2.60 nm。分子對接結果與實驗結果相一致。與塞來昔布相比，BCBP與血清白蛋白的結合自由能更低，結合常數相對較小，表明羧基的引入降低了其與血清白蛋白的結合能力，這可能有利于其在體內的快速結合和釋放。同時，BCBP與塞來昔布均結合在血清白蛋白的site II位點，結合的作用力類型也一致，表明C-3位羧基取代對其結合模式影響不大。這些研究結果為了解塞來昔布衍生物在體內的運輸過程以及作用機制，提供了一些重要的理論信息，對發現和設計新型低毒副作用COX-2抑制劑，也具有重要的意義。

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Thermodynamics of the lnteraction of BCBP with Bovine Serum Albumin

GUO Qing-Lian1，*HE Huan2PAN Ling-Li3LIU Yi2
（1Department of Clinical Laboratory，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan 430071，P.R.China；2College of Chemistry and Molecular Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，P.R.China；3Department of Emergency，Huangshi Central Hospital （Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University），Edong Healthcare Group，Huangshi 435002，Hubei Province，P.R.China）

Celecoxib derivatives are widely used，non-steroidal，anti-inflammatory drugs for the treatment of acute or chronic inflammation.Under simulated physiological conditions，we used fluorescence and ultraviolet absorption spectroscopy，circular dichroism，and methods of molecular simulation to study the thermodynamics of the interaction between the celecoxib derivative 1-benzenesulfonamides-3-carboxyl-5-phenyl pyrazole （BCBP）and bovine serum albumin（BSA）.The fluorescence quenching of BSAby BCBP was a static process，which was confirmed by the UV-Vis absorption spectra.The calculated enthalpy（ΔH）and entropy（ΔS）changes implied that hydrogen bonds and van der Waals forces played a predominant role in the binding process.The circular dichroism demonstrated that the secondary structure of BSA changed after its interaction with BCBP，causing the α-helix content to decrease，accompanied by an increase in an unordered structure.Molecular docking results confirmed the experimental results.

Celecoxib derivative；Bovine serum albumin；Interaction；Thermodynamics parameter

January 14，2016；Revised:March 8，2016；Published on Web:March 9，2016.

O642

［Article］10.3866/PKU.WHXB201603093www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding author.Email:yunjiang716@hotmail.com.

The project was supported by the Key Project of Health and Family Planning Commission of Hubei Province，China（WJ2015MB097）and Wuhan Yellow Crane Talents Program for Science and Technology，China（2014［10］）.

湖北省衛生計生委重點項目（WJ2015MB097）和武漢黃鶴英才（科技）計劃（2014［10］）資助

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