碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌中KPC基因分布

楊 朵，胡智穎，辛續麗

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌中KPC基因分布

楊 朵，胡智穎*，辛續麗*

目的 檢測碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌中KPC基因分布情況，為此類菌感染的預防與控制提供理論依據。方法 改良Hodge試驗檢測醫院臨床分離肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶表型；PCR法檢測KPC基因的攜帶率。結果 642株碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌中，Hodge 試驗陽性率為96.6 %。KPC基因的攜帶率為50.9 %，均為KPC-2型。結論 該醫院臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌中KPC基因主要為KPC-2基因。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶； KPC基因； Hodge試驗

肺炎克雷伯菌是常見的醫院感染病原菌，碳青霉烯類抗生素是治療包括產ESBL在內肺炎克雷伯菌感染的重要抗菌藥物。但近年來碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的出現，給臨床感染控制提出了嚴重挑戰。目前研究認為，對碳青霉烯類抗生素產生耐藥機制主要包括細菌外膜蛋白通透性下降、產碳青霉烯酶等［1］，其中產碳青霉烯酶，特別是KPC型酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥的重要機制。我院從2009年首次檢出碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，近年來此類菌已成為本院感染的重要致病菌，了解其對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制，了解KPC基因的分布情況，將有助于此類菌醫院感染的有效控制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 642株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分離自本院2011年1月-2013年12月臨床標本（剔除同一患者的同一部位重復菌株）。

1.1.2質控菌株 Hodge試驗陽性肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，Hodge試驗陰性肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、大腸埃希菌ATCC 25922。產KPC-2陽性肺炎克雷伯菌為檢驗科自存。

1.1.3儀器與試劑 菌株鑒定采用經VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定/藥敏分析系統鑒定；PCR儀為美國AB公司Veriti型；所用培養基均為天津金章公司產品；亞胺培南及美羅培南等藥敏紙片為英國OXOID公司產品；PCR通用試劑盒Easy-DoTMPCR PreMix、DNA分子量標準及引物均購自北京賽百盛基因技術有限公司。

1.2方法

1.2.1改良Hodge試驗 依據CLSI 2011版推薦方法完成［2］。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705為陽性對照，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706為陰性對照。

1.2.2細菌DNA模板制備 挑取10～15個新鮮菌落，加入pH8.0的ddH2O 100 μL，充分震蕩混勻后沸水浴5 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，留取上清液為DNA模板，-20 ℃保存。

1.2.3耐藥基因檢測 所有樣本采用KPC通用基因引物進行檢測，引物序列由本實驗室設計，經本室自存KPC-2陽性肺炎克雷伯菌驗證。 見表1。

表1　KPC基因引物序列Table 1 The primer sequences of KPC genes

PCR循環參數 95 ℃預變性2 min；94 ℃10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃ 30 s，30個循環；最后72 ℃延伸2 min。PCR產物電泳觀察條帶，陽性產物送上海生工生物工程公司測序，測序結果與NCBI網站（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST比對，確認基因型。

2　結果

2.1改良Hodge試驗結果

642株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，經改良Hodge試驗檢測后620株陽性，陽性率為96.6 %。

2.2PCR擴增檢測結果

642株肺炎克雷伯菌中，KPC基因通用引物陽性327株，測序結果確認為KPC-2基因型，KPC-2基因檢出率為50.9 %。部分KPC基因產物電泳圖見圖1。

3　討論

肺炎克雷伯菌是最常見的醫院感染病原菌，近年來，國內陸續報道出現碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌［3］，由于碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌呈現多重耐藥甚至泛耐藥，導致此類感染臨床治療困難。了解本地區此類感染菌的主要耐藥機制，將有助于控制該菌感染。

圖1　部分KPC基因PCR產物電泳圖Figure 1 Electrophoretic analysis of the PCR products of KPC gene in some strains

目前研究認為，細菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥的機制主要包括，產水解碳青霉烯酶如KPC酶；產染色體AmpC酶加外膜蛋白缺失或改變；青霉素結合蛋白（PBP）親和力降低和主動外排系統增加等［2-3］。肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的機制是產碳青霉烯酶，特別是KPC型酶［4-5］。KPC酶通常為質粒介導，能夠水解包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類，這種活性可被β內酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制［6］。自1996年首次從美國加州的1株肺炎克雷伯菌中分離到KPC-1后，現已發現14種變異酶，在肺炎克雷伯菌中發現11種均具有碳青霉烯酶活性，它們相互之間有1～3個氨基酸的替換。目前報道的流行病學研究顯示，美洲、歐洲、以色列、東亞等地流行的KPC酶型別主要為KPC-2［6］。我國在2007年首次報道在肺炎克雷伯菌中分離到KPC酶（KPC-2型），近年來也有流行的報道［7-8］。本研究結果發現，我院碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌中KPC-2型酶攜帶率為50.9 %，顯示KPC-2酶確實在碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌中有較高流行。在碳青霉烯酶表型篩選中，本研究采用了CLSI推薦的Hodge試驗方法。結果顯示，Hodge試驗的陽性率為96.6 %，KPC酶基因檢測率為50.9 %，有293株Hodge試驗陽性而未檢測到KPC酶基因，其原因可能為：①產生其他類型的金屬酶如VIM、IMP、SPM、GIM、SIM或攜帶有D型碳青霉烯酶如OXA系列等；②改良Hodge試驗出現一定的假陽性，尤其是當菌株產生較多ESBL或AmpC酶時，可導致Hodge試驗出現假弱陽性［9］。本試驗菌株是否攜帶有其他類型的碳青霉烯酶還有待進一步研究確認。此外，全部642株菌均未檢出NDM-1基因（NDM-1基因檢測結果未在本文中顯示），提示本研究中碳青霉烯類抗生素耐藥機制與NDM-1無關。

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Prevalence of KPC gene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates

YANG Duo，HU Zhiying，XIN Xuli. （Central Laboratory，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

Objective To investigate the prevalence of KPC gene in carbapenem-resistant K. pneumoniae isolates for better control of the relevant infections. Methods The carbapenemases were detected by Hodge test. KPC gene was tested by PCR. Results The results of Hodge test showed that 96.6 % of the 642 strains of carbapenem-resistant K. pneumoniae could produce carbapenemases. And 50.9 % of the isolates were positive for KPC-2 gene. Conclusions KPC-2 gene is the primary KPC gene in carbapenemresistant K. pneumoniae in this hospital.

Klebsiella pneumoniae； carbapenemase； KPC gene； Hodge test

R378

A

1009-7708（2016）04-0465-03

10.16718/j.1009-7708.2016.04.015

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院中心實驗室，北京 100038，*檢驗科。

楊朵（1970—），女，醫學博士，副主任技師/副教授，主要從事細菌耐藥機制、耐藥菌分子流行病學、微生物檢驗診斷。

楊朵，E-mail：yangduo@bjmu.edu.cn。

2015-10-09

2015-12-07