NLRP3炎性小體在金黃色葡萄球菌血流感染小鼠免疫反應中的作用

吳 丹 ，周樹生，胡仕靜，劉 寶

NLRP3炎性小體在金黃色葡萄球菌血流感染小鼠免疫反應中的作用

吳 丹 ，周樹生，胡仕靜，劉 寶

目的 探討NLRP3炎性小體在金黃色葡萄球菌（金葡菌）血流感染小鼠模型免疫反應中的作用機制。方法 對C57BL/6小鼠分別經尾靜脈注射金葡菌菌液或磷酸鹽緩沖液（PBS）作為血流感染組和對照組，在處理后的24 h、48 h處死小鼠并檢測相關指標。小鼠血液及組織勻漿（肝、肺、腎）經24～48 h細菌培養后檢測其細菌計數；酶聯免疫吸附法檢測血清及組織勻漿中細胞因子IL-1β和IL-18含量；熒光定量-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）及Western blot方法分別檢測組織勻漿中NLRP3、ASC、caspase-1中mRNA及蛋白的含量；HE染色定性觀察組織中炎性改變以及免疫組化方法半定量觀察組織中炎性小體表達情況。結果 血流感染組血液及組織勻漿中細菌計數在感染后24 h及48 h后顯著增加，HE染色觀察組織見大量炎性細胞浸潤甚至有膿腫或壞死，并隨感染時間而加重；所有組織勻漿中IL-1β和IL-18的水平顯著提高；3種組織勻漿中的ASC 和caspase-1 mRNA表達水平均在感染后48 h顯著升高，而肝臟及肺臟中NLRP3 mRNA表達水平在感染后24 h就顯著升高；而且，感染組各組織勻漿中的NLRP3、ASC、pro-caspase-1 以及 caspase-1 p20 蛋白水平均有顯著升高。結論 金葡菌血流感染與炎性小體的激活有關，并且炎性小體表達水平與感染嚴重程度有關。研究結果可能為血流感染或膿毒癥的發病機制提供一個新的研究方向，并為其治療帶來新的方法。

NLRP3炎性小體； 金黃色葡萄球菌； 血流感染

金黃色葡萄球菌（金葡菌）所致的血流感染越來越成為影響ICU嚴重感染發生率和死亡率的重要因素［1］。最近，研究發現NOD樣受體（NLRs）與自身免疫性疾病、腫瘤及炎癥相關，而這一類NLR的蛋白復合物稱為炎性小體［2］。其中，應答于多種刺激因子諸如病毒、細菌、真菌以及壞死細胞碎片的炎性小體是NLRP3炎性小體，其是由NLRP3、caspase-1、ASC 3種蛋白組成［3］。NLRP3蛋白的激活以及對ASC及caspase-1前體（procaspase-1）的招募，導致caspase-1的激活，隨后調節促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟［4］。盡管之前的一些研究已經探討了NLRP3炎性小體在許多炎癥性疾病，例如急性重癥肺炎、急性鼻竇炎以及腎臟炎性疾病中的作用，但是其在金葡菌誘導血流感染中的作用研究尚少［5-7］。因此，我們建立了金葡菌所致血流感染的小鼠模型來探討NLRP3炎性小體在發病過程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 金葡菌標準菌株ATCC 29213由安徽醫科大學附屬省立醫院臨床微生物實驗室惠贈。

1.1.2實驗動物 SPF級C57BL/6 雄性小鼠（20～25 g，6～8 周） ，購自安徽省實驗動物中心［SCXK（皖）2011-002）］。動物飼養于ASBL2動物室，實驗前適應環境1周。

1.1.3主要儀器和材料 LHP型恒溫恒濕培養箱及60 ℃烤箱（常州普天儀器制造有限公司），qRTPCR分析系統（美國Biosystems 7500），光學顯微鏡及熒光正置顯微鏡（日本尼康），紫外分光光度計（上海天普分光光度計有限公司），SDS-PAGE電泳及轉移系統（美國 Bio-Rad 公司），超純水儀（中國瑞楓公司）；IL-1β和IL-18酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（英國R&D公司），Trizol （美國Invitrogen公司），反轉錄試劑盒（美國Thermo公司），熒光定量PCR試劑盒（QuantiFast SYBR Green PCR Kit德國凱杰公司），RealTime專用八連管（美國ABI公司），DEPC處理水（北京索萊寶科技有限公司）β-actin 單克隆抗體（北京中杉金橋生物公司），NLRP3、ASC、caspase-1 p20多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF膜、脫脂牛奶、ELC發光液等Western blot 相關試劑（上海生工生物工程公司），石蠟、無水乙醇、二甲苯、無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）、DAB顯色液等HE及免疫組化相關試劑（上海生工生物工程公司）。

1.1.4引物設計 依據GenBank中小鼠肌動蛋白（β-actin） 、NLRP3、ASC、caspase-1 基因設計引物用于qRT-PCR檢測，PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，各引物序例見表1。

表1　NLRP3 炎性小體基因引物序列Table1 Sequence of the primers for NLRP3 inflammasome-related genes

1.2方法

1.2.1菌液培養 菌株于LB培養液中37 ℃搖菌過夜，然后以1∶100（v/v） 稀釋于新鮮LB中繼續搖菌4～6 h。菌液離心（3 000 r/min，5 min）后重懸于PBS，重復3次，麥氏比濁法確定1.5麥氏單位相當于4.5×108CFU/mL菌液濃度作為感染濃度。

1.2.2感染 實驗小鼠隨機分為血流感染24 h組、48 h組和對照組（每組30只），分別對經腹腔麻醉后的小鼠經尾靜脈注射等體積的上述菌液（0.1 mL/10 g體重）及無菌PBS，感染后24 h及48 h安樂死處死小鼠，對照組為正常未感染小鼠于實驗開始時即安樂死處死小鼠。

1.2.3ELISA檢測 對血清及肺、肝、腎臟組織勻漿中細胞因子（IL-1β及IL-18）的含量嚴格按照試劑盒說明進行操作，各孔用酶標儀在450 nm處測定吸光度（D ）值，用標準品的濃度與D值制作標準曲線，根據線性回歸方程和樣品的D值計算獲得對應的濃度，樣品最終濃度= 所測濃度×稀釋倍數。

1.2.4總mRNA提取與cDNA合成 分別取感染組和對照組的新鮮動物組織0.1～0.2 g迅速倒入勻漿器中，加入1 mL預冷的Trizol，在冰浴中迅速勻漿20～30 s，將細胞懸液吸入另一EP管，室溫靜置5 min，嚴格按說明書操作提取總RNA，加入20 μL DEPC處理水（RNase free水）溶解RNA。讀取RNA稀釋樣品在紫外分光光度計260、280 nm波長處的D 值，并計算D260/D280的比值，通常在1.7～2.0說明RNA樣品純度較高。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，條件為42℃ 60 min，70℃ 5 min終止反應。20 μL的反轉錄體系如下：Total RNA 2 μL ，RT Primer Mix 2 μL，RNase Free dH2O 9 μL，5×M-MLV Reaction Buffer 4 μL，RNAsafe（30 U/μL） 1 μL，dNTP（2.5 mmoL/L each） 2 μL，M-MLV RT（200 U / μL） 1 μL。將產物cDNA凍存于-80 ℃備用。

1.2.5qRT-PCR檢測 cDNA中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的含量 以感染組與對照組小鼠組織中的cDNA建立25 μL的反應體系：2 × QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，Primer A 0.5 μL，Primer B 0.5 μL，RNase-free 水9.5 μL，cDNA 2 μL。根據試驗處理數和檢測基因數確定所加樣的管數，一般每個處理做2管平行。每管樣品按2個平行（20 μL / 管）分裝到RealTime專用八連管中。樣品加完后裝入qRT-PCR儀樣品臺（記住每個處理和基因的位置），打開電腦，按照AB7500說明操作，運行RT-PCR儀控制軟件。反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 40 s，共40個循環。β-actin mRNA作為內參，得出每個樣本的CT值后，用2-ΔΔCt法算出每個mRNA的相對定量值。

1.2.6NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20蛋白Western blot 檢測 取感染組和對照組小鼠組織（肝、肺、腎）各100 mg樣本，加入1 mL裂解液及10 μL PMSF放入勻漿器中搗碎，靜置30 min（冰上操作）后離心取上清液。上清液按照BCA蛋白濃度測定試劑盒確定各樣本蛋白濃度。上清液加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（4∶1體積），100 ℃變性10 min后-20 ℃保存。NLRP3 及β-actin蛋白用10 %分離膠，ASC、caspase-1 p20蛋白用12 %分離膠，4種蛋白都用5 %濃縮膠。濃縮膠70 V，分離膠120 V進行電泳，根據預染Maker 指示，轉移相應蛋白到PVDF膜上，用5 %脫脂牛奶封閉液封閉，室溫1 h，封閉后分別用NLRP3、ASC、caspase-1 p20 1∶200、β-actin 1∶1 000抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌10 min × 3 次，孵育二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 1∶10 000，室溫1 h，TBST 洗滌10 min× 3 次，用ECL曝光、顯影，用ImageJ軟件進行灰度值測定。

1.2.7組織HE染色及免疫組化 感染組及對照組小鼠的各組織分別經固定、包埋、切片后HE染色，顯微鏡下觀察各組病理變化。切片經脫蠟，脫二甲苯，抗原修復，加入一抗（NLRP3 1∶500；ASC，1∶500；caspase-1 p20，1∶500）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，烤干后正置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8統計分析 采用SPSS16.0對數據進行處理，計量數據均采用均數±標準差表示，兩組間數據比較用獨立樣本t檢驗，多組間數據比較用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1金葡菌血流感染小鼠模型的建立

血及組織勻漿中的細菌在感染后24 h及48 h計數顯著升高，且48 h組明顯高于24 h組，見表2。此外，組織切片HE染色后觀察到感染組小鼠的肝、肺、腎組織中均有炎性細胞浸潤及組織膿腫和壞死，見圖1，這表明全身血流感染模型成功建立。

2.2血流感染小鼠血清及組織勻漿中細胞因子IL-1β和IL-18水平

本研究發現，與24 h組相比，48 h組中血清及肝、肺勻漿中的IL-1β，血清中的IL-18 顯著降低，而腎勻漿中IL-1β和肺勻漿中IL-18顯著升高 ，見表3。

2.3組織勻漿中 NLRP3、ASC、 caspase-1 mRNA的表達

與對照組相比，感染組3種組織勻漿中ASC 和caspase-1 mRNA表達在感染后48 h顯著增加，而肝和肺勻漿中的NLRP3 mRNA表達在感染后24 h就明顯增加，見圖2。

圖1　血流感染組及對照組小鼠HE染色（400×）Figure 1 Representative photomicrographs of HE-stained sections of the tissues from BSI or PBS control mice （magnification，400×）.

2.4NLRP3、ASC、pro-caspase-1和caspase-1 p20蛋白表達

感染組NLRP3、ASC、pro-caspase-1和 caspase-1 p20蛋白水平顯著升高。與感染后24 h相比，感染后48 h 肺、腎組織中ASC蛋白，肺、肝組織中procaspase-1、caspase-1 p20蛋白水平顯著升高。此外，同組中NLRP3、pro-caspase-1和caspase-1蛋白在肝、腎組織中表達水平更高，而ASC在肺組織中表達水平更高，見圖3。

2.5免疫組化結果

感染組顯示了金葡菌誘導炎性細胞的招募以及NLRP3、ASC 和 caspase-1蛋白的陽性表達。NLRP3、ASC和caspase-1蛋白主要在炎性細胞的細胞漿質中表達。對照組幾乎不表達目標蛋白，而感染組不同組織中的陽性蛋白的表達量隨感染時間而增加。我們還發現與肺組織相比，肝和腎組織中表達的陽性蛋白更多。這些結果表明NLRP3、ASC、caspase-1炎性小體可能加速金葡菌中炎性細胞的浸潤，見圖4。

表2　各組小鼠血及組織勻漿（肝、肺、腎）中的細菌計數Table 2 Bacterial colony-forming units in blood samples and tissue homogenates in each group （mean±SD）

表3　血流感染組及對照組小鼠血和組織勻漿中IL-1β、IL-18水平Table 3 IL-1β and IL-18 levels in blood and tissue homogenates in the mice model of S. aureus-induced BSI and control mice （mean±SD）

3　討論

在本研究中，我們建立了金葡菌血流感染的小鼠模型；細菌計數和病理組織HE染色證明細菌持續感染以及器官組織炎性細胞浸潤和壞死。IL-1β 和IL-18被認為是依賴于NLRP3炎性小體的細胞因子，其水平在金葡菌血流感染組中顯著升高（P＜0.05）［8］。本研究中金葡菌所致血流感染小鼠的血漿和組織勻漿中IL-1β 和IL-18顯著升高，NLRP3、 ASC、 caspase-1 mRNA及其蛋白表達水平也隨之升高。血流感染組小鼠血液和組織勻漿中的細菌計數較對照組顯著增加，而且每一時間點的感染組小鼠血液中的細菌計數比組織勻漿中升高的少。這可能是因為血液中的補體系統及溶菌酶能直接吞噬一部分細菌［9］。

圖2　各組小鼠組織中NLRP3、ASC 和caspase-1 mRNA的表達Figure 2 NLRP3，ASC and caspase-1 mRNA expression in tissues of mice

圖3　各組小鼠組織中 NLRP3，ASC，pro-caspase-1 和 caspase-1 p20蛋白的表達Figure 3 Expression of NLRP3，ASC，pro-caspase-1 and caspase-1 p20 proteins in tissues

圖4　免疫組化法檢測各組小鼠組織中 NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白表達Figure 4 Expression of NLRP3，ASC and caspase-1 proteins in the tissues of mice determined by immunohistochemistry

組織的炎性病理變化能夠證實膿毒癥的嚴重性。組織細胞充血水腫、炎性細胞浸潤、膿腫及壞死等是血流感染小鼠器官組織主要的病理變化［10］。本研究發現，在感染后24～48 h，肺組織出現大量中性粒細胞積聚以及組織壞死；同樣在肝臟中觀察到肝細胞及血管周圍大量的中性粒細胞聚集；在腎臟組織中，有更嚴重的病理變化，例如中性粒細胞膿腫、腎小管壞死和鈣化。其他的一些膿毒癥研究發現，腎小管上皮細胞空泡形成、壞死［11］，但是肺和肝臟可能沒有變化［12］。此外，FISHER等［13］也發現，在FIP小鼠中肺和腎臟沒有顯著的病理炎性改變。我們的觀察結果與之有所不同，這可能與每項研究所采用的不同動物模型有關。

NLRP3-ASC-pro-caspase-1復合物即NLRP3炎性小體是一種與血流感染相關的重要的模式識別受體（PRR），其能促進細胞因子IL-1β 和IL-18分泌［5］。因此，我們檢測小鼠組織勻漿中NLRP3、ASC、 pro-caspase-1以及caspase-1 p20蛋白來驗證NLRP3炎性小體是否參與了金葡菌所致血流感染中的炎性免疫反應。結果顯示，金葡菌血流感染后其組織勻漿中NLRP3、 ASC、pro-caspase-1 及caspase-1 p20蛋白水平顯著增高。然而，我們發現在3種組織中不是所有的蛋白表達水平在感染后48 h都比24 h顯著提高，免疫組化的結果與Western blot結果相似。金葡菌血流感染后小鼠組織中炎性細胞浸潤以及NLRP3、ASC 和 caspase-1蛋白表達顯著增多；而且在肝臟和腎臟中的表達比肺臟中更明顯。qRT-PCR結果也發現，感染后NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表達水平顯著升高；還觀察到肝臟和肺臟中NLRP3 mRNA的表達在感染后24 h就開始顯著升高，而3種組織中ASC 和 caspase-1 mRNA的表達在感染后48 h才開始顯著升高。因此，我們得出結論，金葡菌所致的血流感染激活NLRP3炎性小體，其在不同組織中的表達水平不同，而且在基因水平上與血流感染的嚴重程度呈正相關。

在之前一項膿毒癥誘導的急性肺損傷模型中，LUO等［14］報道盲腸結扎穿孔術（CLP）誘導NLRP3、ASC和 caspase-1 mRNA及蛋白 的表達，隨后引起IL-1β 和 IL-18的分泌增加。MCGILLIGAN等［15］在小鼠結膜杯狀細胞中發現NLRP3 炎性小體的成分，其被金葡菌通過caspase-1路徑激活隨后分泌成熟的IL-1β。此外，KEBAIER等［16］發現nlrp3-/-小鼠感染金葡菌后發生嚴重肺炎的可能性更小，這項研究預示著NLRP3炎性小體將可能作為嚴重金葡菌感染的藥物治療新靶點。這些研究都表明NLRP3炎性小體在包括金葡菌血流感染在內的多種感染中起到重要的促炎作用。與我們的研究中關注膿毒癥誘導的急性腎損傷不同的是，其他一些多是在慢性腎臟疾病中研究發現NLRP3炎性小體及IL-1β 、IL-18在腎臟中的表達顯著提高［17］。這表明NLRP3炎性小體在急性或慢性腎損傷中都起到重要的作用。

很多文獻已經報道了IL-1β 和IL-18在多種病原微生物感染中的作用［8］。金葡菌細胞壁的吞噬作用能夠促進IL-1β的分泌，IL-1β的分泌對中性粒細胞的招募及細菌的清除發揮重要的作用［17］。IL-18的作用是促進干擾素γ的產生來增強巨噬細胞的殺菌活性，以及其他促炎細胞因子IL-1β、腫瘤壞死因子α、IL-8和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的活性［8］。本研究發現金葡菌誘導的血流感染小鼠的血清及組織勻漿（肝、肺、腎）中IL-1β 及IL-18的水平顯著升高。我們還發現腎組織中IL-1β水平及肺組織中IL-18水平在感染后48 h比24 h顯著升高，而血清及肝、肺組織中的IL-1β水平，血清中的IL-18水平顯著下降。NLRP3炎性小體能直接激活和促進IL-1β 和 IL-18的釋放［8］。先前的研究發現，活化的caspase-1是作為IL-1β轉化酶，能直接促進IL-1β成熟［18］。

總之，本研究顯示，在金葡菌誘導的血流感染中NLRP3炎性小體的表達呈上調，而且NLRP3炎性小體在血流感染的發展中起到重要作用。這些結果為研究血流感染或膿毒癥潛在的發病機制提供新的方向。此項研究的不足之處在于未能探討NLRP3炎性小體的調控機制，這也將成為我們下一步實驗研究的方向，為金葡菌誘導的血流感染提供新的治療靶點。

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Effect of NLRP3 inflammasome on the immune response in a mouse model of Staphylococcus aureus-induced bloodstream infection

WU Dan，ZHOU Shusheng，HU Shijing，LIU Bao. （Department of Critical Care Medicine，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

Objective To explore the role of NLRP3 inflammasome in the immune response in a C57BL/6 mouse model of bloodstream infection （BSI） induced by S. aureus. Methods Mice were assigned to PBS control group to receive phosphate buffered saline （PBS），or to BSI group to receive S. aureus challenge via caudal vein. The animals were sacrificed 24 h and 48 h after treatment，respectively. The corresponding bacterial colony-forming units and the levels of cytokines IL-1β and IL-18 in serum and tissues were measured. qRT-PCR and Western blot analysis were used to detect NLRP3，ASC，caspase-1 mRNA and proteins in tissue homogenate. Histopathologic changes were assessed by hematoxylin-eosin staining qualitatively. The expression of inflammasome was evaluated by immunohistochemistry semi-quantitatively. Results Colony forming units in blood and tissue homogenate （liver，lungs，and kidneys） significantly elevated at 24 h and 48 h post-challenge in BSI group. Hematoxylin-eosin staining showed significant inflammatory cell infiltration，even abscess or necrosis in the tissues in BSI group. Tissue damage aggravated gradually over time. Levels of IL-1β and IL-18 increased significantly in all tissue homogenates. qRT-PCR showed that ASC and caspase-1 mRNA expression significantly increased 48 h after S. aureus challenge in all the three tissue homogenates in BSI group. The expression of NLRP3 mRNA in liver and lung homogenates increased significantly since 24 h after challenge. Western blot and immunohistochemistry analysis showed significant elevation of NLRP3，ASC，pro-casepase-1 and caspase-1 p20protein levels in S. aureus-induced BSI. Conclusions These results suggest that S. aureus-induced BSI is associated with activation of NLRP3 inflammasome. The expression level of NLRP3 inflammasome is correlated with the severity of S. aureus-induced BSI. It may offer a new direction for studying the underlying mechanisms of bloodstream infections or sepsis and will probably provide a new approach for managing S. aureus-induced BSI.

NLRP3 inflammasome； Staphylococcus aureus； bloodstream infection

R378.11

A

1009-7708（2016）04-0411-08

10.16718/j.1009-7708.2016.04.007

安徽醫科大學附屬省立醫院重癥醫學科，合肥 230001。

吳丹（1988—），女，碩士研究生，主要從事細菌感染與免疫方面研究。

劉寶，E-mail：DrLiubao@outlook.com。

2015-08-07

2015-10-30