門診患者尿標(biāo)本分離大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制

范 會(huì)，金 炎，邵春紅，王 勇

門診患者尿標(biāo)本分離大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制

范 會(huì)，金 炎，邵春紅，王 勇

目的 了解從門診患者尿標(biāo)本中分離出的大腸埃希菌的流行情況和對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，分析產(chǎn)ESBL菌株所攜帶耐藥基因情況。方法 收集2013年1-12月門診患者尿標(biāo)本分離的大腸埃希菌，采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；根據(jù)2013年CLSI規(guī)定使用表型確定試驗(yàn)檢測ESBL；PCR方法檢測產(chǎn)ESBL菌株的耐藥相關(guān)基因。結(jié)果 門診患者尿標(biāo)本分離的大腸埃希菌366株，其中產(chǎn)ESBL74株，占20.2 % （74/366）。產(chǎn)ESBL菌株僅對(duì)碳青霉烯類、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、呋喃妥因敏感率較高；對(duì)其他常用抗菌藥物耐藥情況較為嚴(yán)重，敏感率多在50 %以下，尤其是對(duì)喹諾酮類藥物敏感率只有15 %左右，產(chǎn)ESBL比非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率明顯升高。74株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的主要耐藥基因型是CTX-M型（71株）和TEM型（47株），分別占所檢測菌株的96.0 %（71/74）和63.5 %（47/74），同時(shí)攜帶2種以上基因的菌株44株，占所測菌株的59.5 %（44/74），其中主要以CTX-M-1群+ TEM型最多，檢出26株，占59.1 %（26/44）。對(duì)47株含TEM型的菌株進(jìn)行測序，全部為TEM-1β內(nèi)酰胺酶型，非ESBL。結(jié)論 門診患者尿標(biāo)本分離的大腸埃希菌中產(chǎn)ESBL菌株檢出率較高，其耐藥率高且常呈多重耐藥，基因型復(fù)雜和多樣化，在臨床治療中應(yīng)引起重視，加強(qiáng)此類菌株耐藥性的監(jiān)測。

大腸埃希菌； 耐藥基因； 超廣譜β內(nèi)酰胺酶

大腸埃希菌是引起泌尿系感染的主要病原菌。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，門診患者尿標(biāo)本分離的大腸埃希菌出現(xiàn)了大量的耐藥菌株，產(chǎn)ESBL大腸埃希菌也日益增多。為了解大腸埃希菌的藥物敏感性和產(chǎn)ESBL及其所攜帶耐藥基因情況，本研究對(duì)2013年1-12月山東省立醫(yī)院門診患者尿標(biāo)本分離的大腸埃希菌分析如下。

1　材料與方法

1.1菌株來源

2013年1-12月，收集我院門診患者清潔中段尿標(biāo)本1 557份，分離出非重復(fù)大腸埃希菌366株。

1.2方法

1.2.1菌株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn) 用10 μL接種環(huán)取尿標(biāo)本1環(huán)定量接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，即先在血瓊脂培養(yǎng)基上劃十字，再進(jìn)行密集均勻涂布；然后再分區(qū)劃線接種中國藍(lán)培養(yǎng)基。將接種好尿標(biāo)本的血瓊脂培養(yǎng)基和中國藍(lán)培養(yǎng)基，置35～37 ℃孵育18～24 h，觀察菌落形態(tài)，可疑菌落用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）鑒定細(xì)菌到種。所分離大腸埃希菌采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；MH瓊脂平皿、哥倫比亞血瓊脂平皿、中國藍(lán)瓊脂平皿購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；頭孢他啶（30 μg）、頭孢他啶-克拉維酸（30 μg-10 μg）、頭孢噻肟（30 μg）、頭孢噻肟-克拉維酸（30 μg-10 μg）紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品；質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。根據(jù)2013 年CLSI的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.2.2ESBL檢測 用表型確證試驗(yàn)證實(shí)。即使用每片含30 μg頭孢他啶、頭孢噻肟紙片和頭孢他啶-克拉維酸、頭孢噻肟-克拉維酸復(fù)合劑紙片進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)任何一種復(fù)合劑紙片抑菌圈直徑大于或等于其單獨(dú)藥敏紙片抑菌圈直徑5 mm，可確證該菌株產(chǎn)ESBL。

1.2.3耐藥基因的PCR擴(kuò)增 采用煮沸法提取產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因組DNA，建立PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因，相關(guān)引物序列及產(chǎn)物長度見表1，由上海生工生物工程公司提供。

表1　PCR擴(kuò)增基因引物Table 1 Primers used in PCR amplification of relevant genes

1.2.4基因測序 將含有TEM型和SHV型PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進(jìn)行基因測序。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 用WHONET 5.6和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS19.0對(duì)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的來源

收集我院2013年1-12月門診患者清潔中段尿1 557份，共分離大腸埃希菌366株，占23.5 %；產(chǎn)ESBL大腸埃希菌74株，占20.2 % （74/366）。該74株分離自男性患者16株（占21.6 %），女性58株（占78.4 %）；≥60歲患者42株（占56.8 %），12～59歲31株（占41.9 %），＜12 歲1株。

2.2產(chǎn)與非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的藥敏試驗(yàn)

產(chǎn)與非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類藥物均保持100 %敏感率。此外，非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)頭孢菌素類、β內(nèi)酰胺類-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、阿米卡星、呋喃妥因的敏感率在90 %以上，對(duì)喹諾酮類藥物的敏感率在55 %左右。產(chǎn)ESBL大腸埃希菌呈現(xiàn)較高的耐藥率，除對(duì)碳青霉烯類敏感外，對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、呋喃妥因和阿米卡星的敏感率在80 %以上；對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率在79.5 %；但是對(duì)常用于泌尿系感染的慶大霉素的敏感率只有41.8 %，對(duì)喹諾酮類藥物敏感率在15 %左右。見表2。

2.3產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的耐藥基因檢測結(jié)果

啟用Realtime PCR對(duì)74株表型確證產(chǎn)ESBL大腸埃希菌進(jìn)行CTX-M、TEM、SHV、VEB 4種基因檢測。檢測結(jié)果顯示：CTX-M-1群45株，占60.8 %（45/74）；CTX-M-9群26株，占35.1 % （26/74）；TEM型47株，占63.5 %（47/74）；SHV 型1株，占1.4 %；VEB型1株，占1.4 %。同時(shí)攜帶2種以上基因的菌株44株，占所測菌株的59.5 %（44/74），其中主要以CTX-M-1群+TEM型最多，檢出26株，占59.1 %（26/44）。

2.4TEM和SHV基因的分型

對(duì)47株TEM型PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，經(jīng)序列分析比對(duì)，證實(shí)了47株TEM型均為TEM-1β內(nèi)酰胺酶型，非ESBL；1株SHV型擴(kuò)增陽性的菌株為SHV-12型。

3　討論

近年來，隨著抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為人們極為關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。大腸埃希菌是最常見的引起社區(qū)獲得性泌尿系感染的病原菌。本研究顯示，從1 557份清潔中段尿培養(yǎng)分離大腸埃希菌366株，共檢出產(chǎn)ESBL大腸埃希菌株74株，占大腸埃希菌總數(shù)的20.2 %。產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的檢出率女性明顯多于男性，60歲以上老年患者高于其他年齡組。老年女性由于雌激素下降，機(jī)體抵抗力降低，老年性陰道炎發(fā)生率增高，易引發(fā)尿路感染［1］。由此可見，從尿液分離大腸埃希菌的門診患者以≥60歲老年女性為主，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的重視。

表2　產(chǎn)與非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的藥敏結(jié)果Table 2 Susceptibility of ESBLs-producing and non-ESBLsproducing Escherichia coli to selected antimicrobial agents （ %）

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)除碳青霉烯類藥物外的其他抗菌藥物耐藥率顯著高于非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌（P＜0.05）。產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類藥物，包括美羅培南、亞胺培南和厄他培南的敏感率近100 %，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2］，因此對(duì)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌引起的泌尿系感染，臨床抗菌治療應(yīng)首選碳青霉烯類藥物，還可以考慮哌拉西林-他唑巴坦、呋喃妥因、阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦，其敏感率在80 % ～90 %。非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)頭孢菌素類、碳青霉烯類和β內(nèi)酰胺類-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑敏感率在90 %以上，因此臨床治療可以考慮首選這些藥物；繼發(fā)合并嚴(yán)重感染時(shí)，則首選碳青霉烯類藥物，但應(yīng)加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測。曾經(jīng)廣泛用于泌尿系感染的喹諾酮類藥物在本次研究中顯示對(duì)產(chǎn)與非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的敏感率在15 %和55 %左右，經(jīng)驗(yàn)用藥時(shí)不建議首選。

ESBL基因型主要包括CTX-M型、TEM型、SHV型、VEB型等。由于地域、環(huán)境、醫(yī)療水平的差異，以及抗菌藥物應(yīng)用習(xí)慣不同，世界各地ESBL流行的主要基因型及其耐藥譜也有所差異。在美國以TEM-10、TEM-12、TEM-26為主，法國以SHV-3、SHV-4和TEM-3為主，英國以TEM-10、TEM-12為主，而SHV-4和SHV-5在世界范圍內(nèi)都有流行趨勢［3-5］。在我國主要是以CTX-M型為主［6］，國內(nèi)各個(gè)地區(qū)也有所不同［7］。本研究基因鑒定結(jié)果顯示，74株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌中，以CTX-M型多見，檢出71株（96.0 %），其次為TEM型47株（63.5 %）；同時(shí)攜帶3種基因有1株（1.4 %），同時(shí)攜帶2種基因有44株（59.5 %），單獨(dú)攜帶1種基因有29株（39.2 %）。從基因水平顯示了產(chǎn)ESBL大腸埃希菌耐藥基因的多樣性。

鑒于產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因型流行的復(fù)雜和多樣化，不同地區(qū)有必要對(duì)本地區(qū)進(jìn)行監(jiān)測，為預(yù)防、控制和治療提供依據(jù)。因此必須及時(shí)、準(zhǔn)確對(duì)ESBL介導(dǎo)的耐藥性及其耐藥基因進(jìn)行檢測，以指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，控制耐藥菌株的蔓延。

［1］林禎，夏少梅.大腸埃希菌在尿路感染的分布及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐藥分析［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（1）：127-128.

［2］施錦杰，丁媛媛，李永明，等.大腸埃希茵ESBLs的攜帶情況及藥敏分析［J］. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（1）：53-54.

［3］朱俊民，周明莉.大腸埃希菌藥敏結(jié)果和產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株的耐藥基因分析［J］.中外健康文摘，2012，9（16）：89-91.

［4］XIANG Q，YOU XF，JIANG JD. Advances in molecular biology of extended-spectrum beta-lactamase［J］. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2006，28（2）：298-303.

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［6］周華，李光輝，陳佰義，等.中國產(chǎn)超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌感染應(yīng)對(duì)策略專家共識(shí)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（24）：1847-1856.

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Antimicrobial resistance profile of the Escherichia coli strains isolated from urine of outpatients

FAN Hui，JIN Yan，SHAO Chunhong，WANG Yong. （Department of Laboratory Medicine，Shandong Provincial Hospital affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China）

Objective To understand the antimicrobial resistance profile and relevant genes in the E. coli strains isolated from urine of outpatients in Shandong Provincial Hospital. Methods E. coli was isolated from midstream specimen of urine of outpatients in Shandong Provincial Hospital from January 2013 to December 2013 and identified by automatic VITEK 2-Compact. Antimicrobial susceptibility testing was performed by disk diffusion method. The phenotypic determination of ESBLs was conducted according to the 2013 CLSI document. PCR was used to detect ESBLs related genes. Results A total of 366 strains of E. coli were collected from patients，of which 74 （20.2 %） produced ESBLs. The ESBLs-producing E. coli strains were relatively sensitive to carbapenems，piperacillin-tazobactam，amikacin，cefoperazone-sulbactam，nitrofurantoin （＞ 80 % susceptible），but relatively resistant to other antibiotics （＜ 50 % susceptible），especially quinolones （15 %）. The genotype of ESBLs-producing E. coli strains was mainly CTX-M （96.0 %，71/74） and TEM （63.5 %，47/74）. Overall，44 strains carried more than 2 resistant genes，mainly CTX-M-1+TEM genotype （59.1 %，26/44）. All the 47 TEM type strains carried TEM-1 ESBLs gene based on sequencing analysis. Conclusions The prevalence of ESBLs-producing strains is high in the E. coli isolated from urine of outpatients. The ESBLs-producing E. coli strains are highly resistant and multi-drug resistant with diverse and complex genotypes. Measures should be taken to monitor and control such resistant bacteria.

Escherichia coli； resistance gene； extended spectrum beta lactamase

R378.21

A

1009-7708（2016）04-0473-04

10.16718/j.1009-7708.2016.04.017

山東省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2012G0021839）；國家自然科學(xué)基金（81401696）。

山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部 ，濟(jì)南 250021。

范會(huì)（1987—），女，學(xué)士，檢驗(yàn)師，主要從事臨床微生物，特別是細(xì)菌耐藥性監(jiān)測研究。

王勇，E-mail：sdwangyong@126.com。

2015-06-19

2016-02-16