口腔黏膜多聚甲醛刺激后小鼠三叉神經節AQP1和TRPV4表達變化

譚美蕓 楊曉欣 高俊英 周建平 肖明*

口腔黏膜多聚甲醛刺激后小鼠三叉神經節AQP1和TRPV4表達變化

譚美蕓 楊曉欣 高俊英 周建平 肖明*

目的 為驗證三叉神經節神經元上表達的水通道蛋白1（AQP1）和瞬時感受器電位離子通道4（TRPV4）可能參與痛覺傳導提供形態學依據。方法 應用免疫熒光染色結合FG逆行追蹤標記技術比較觀察口腔黏膜下注射多聚甲醛（PFA）實驗模型組和對照組小鼠三叉神經節內AQP1和TRPV4的表達。結果 與對照組比較，模型組三叉神經節神經元AQP1和TRPV4的表達無明顯差異。結論 存在于三叉神經節神經元上的AQP1和TRPV4可能未參與口腔傷害性刺激所引起的三叉神經痛覺的傳遞。

AQP1 TRPV4 三叉神經節 痛覺 口腔

1　材料與方法

1.1材料與設備 8周齡雄性ICR小鼠，由南京醫科大學動物實驗中心提供。抗AQP1兔源性多克隆抗體（Millipore，美國）；抗TRPV4綿羊源性多克隆抗體（Abcam，美國）；熒光追蹤劑FG（Fluorochrome Englewood CO，美國）；山羊抗兔IgG結合TRITC﹑山羊抗綿羊IgG結合TRITC（Millipore，美國）；德國LEICA RM2135 石蠟切片機；德國LEICA CM1900 冰凍切片機；德國LEICA DM4000B 半自動數字式顯微鏡。

1.2 方法 （1）熒光追蹤劑熒光金（FG）和多聚甲醛（PFA）的注射：小鼠常溫下經3.5%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，應用50μl微量注射器，模型組在頰部黏膜下注射1% FG和5% PFA混合液20μl，對照組在頰部黏膜下注射1% FG和生理鹽水混合液20μl。動物蘇醒后正常飲食，3d后灌注取材。（2）組織制備：小鼠常溫下經3.5%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，于左心室經升主動脈插管，快速滴注37℃的生理鹽水100ml，再灌注4℃含4%PFA磷酸緩沖液（PB，0.1mol/ml，pH7.4）100ml，持續30min，取頰部組織，開顱取三叉神經節后固定2～2.5h。（3）冰凍切片制備：小鼠頰部組織標本，置入含30%蔗糖的PB液中48h。OCT包埋，LEICA冰凍切片機切片，分套收集，片厚35μm，貼于被覆明膠的載玻片上。（4）石蠟切片制備：小鼠三叉神經節標本，經過酒精梯度脫水處理，石蠟包埋。應用LEICA石蠟切片機作連續切片，片厚 7μm，分套收集，再經漂片﹑攤片﹑晾干﹑收集﹑標記后備用。（5）熒光追蹤劑FG觀察：頰部組織冷凍切片直接在熒光顯微鏡（UV濾鏡）觀察熒光染料在注射點黏膜下的擴散范圍，以確定FG注射的有效性。（6）免疫熒光標記染色：選用頰黏膜下FG注射有效的小鼠三叉神經節石蠟切片用于免疫熒光染色。石蠟切片經烤片﹑梯度酒精脫蠟至水，抗熒光淬滅劑封片，在LEICA DM4000B 半自動數字式顯微鏡對FG逆行標記神經元數目相對集中部位進行顯微攝片。已攝片切片PBS洗5min×3次，枸櫞酸鹽緩沖液中92～98℃抗原微波修復20min，自然冷卻至室溫；10%正常山羊封閉血清封閉1h，加抗AQP1兔源多克隆抗體（1∶800）或抗TRPV4綿羊源多克隆抗體（1∶800），4℃過夜，PBS洗5min×3次；加入山羊抗兔或綿羊IgG結合TRITC（1∶200），37℃濕盒避光孵育1h，PBS洗5min×3次；抗熒光淬滅劑封片，LEICA DM4000B 半自動數字式顯微鏡下觀察﹑攝片。

1.3 圖像分析 FG熒光和AQP1（或TRPV4）免疫熒光染色顯微圖像導入Adobe Photoshop 7.0（Adobe Systems，San Jose，CA，USA），進行位置配準﹑分別進行通道拆分，再將FG熒光圖像的紅色通道以AQP1（或TRPV4）免疫熒光圖像的紅色通道替代，融合成FG與AQP1（或TRPV4）的雙標記圖像。將AQP1（或TRPV4）免疫熒光顯微圖像，進行去色和色彩方向處理，轉化為黑白圖像（背景為白色），對照FG與AQP1（或TRPV4）熒光雙標記圖像，將AQP1（或TRPV4）陽性神經元分成兩種類型，即AQP1（或TRPV4）/FG雙標記神經元和AQP1（或TRPV4）單標記神經元，應用圖像軟件ImagePro-Plus分別測定其累計光密度值（IOD）和免疫陽性產物的面積百分比，計算出平均光密度值（MIOD）。每組4～5只動物，每只動物計算3張三叉神經節切片。

1.4統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以（±s）表示，行單因素方差分析（ANOVA）結合Tukey-Kramer 多重比較檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

觀察FG+PFA注射組（模型組）和FG+生理鹽水注射組（對照組）三叉神經節上AQP1/FG雙標記神經元（投射至注射頰黏膜處的三叉神經節AQP1免疫陽性神經元）和AQP1單標記神經元（非投射至注射處頰黏膜的三叉神經節AQP1免疫陽性神經元）。對AQP1陽性信號進行光密度分析，并進行統計學比較，結果顯示（見圖1）：模型組和對照組AQP1/FG雙標記神經元AQP1陽性信號光密度分析比較差異無統計學意義；兩組組內AQP1/FG雙標記神經元和AQP1單標記神經元的AQP1陽性信號光密度差異無統計學意義。

觀察FG+PFA注射組（模型組）和FG+生理鹽水注射組（對照組）三叉神經節上TRPV4/FG雙標記神經元（投射至注射頰黏膜處的三叉神經節TRPV4免疫陽性神經元）和TRPV4單標記神經元（非投射至注射處頰黏膜的三叉神經節TRPV4免疫陽性神經元）。對TRPV4陽性信進行光密度分析，并進行統計學比較，結果顯示（見圖2）：模型組和對照組TRPV4/FG雙標記神經元TRPV4陽性信號光密度分析比較無明顯差異；兩組組內TRPV4/FG雙標記神經元和TRPV4單標記神經元的TRPV4陽性信號光密度無明顯差異。

圖1　模型組和對照組小鼠三叉神經節神經元AQP1免疫熒光強度光密度分析。AQP1/FG代表AQP1/FG雙標記神經元，AQP1代表AQP1單標記神經元

圖2　小鼠頰部黏膜下注射FG + PFA或生理鹽水后，三叉神經節神經元AQP1免疫熒光強度光密度分析。TRPV4/FG、TRPV4分別代表TRPV4/FG雙標記、TRPV4單標記三叉神經節神經元。

3　討論

三叉神經神經纖維終末廣泛分布于頭面部的皮膚﹑眼﹑口腔﹑鼻腔﹑鼻旁竇的黏膜﹑牙齒﹑腦膜等，負責傳導痛﹑溫﹑觸等多種感覺。三叉神經傳導的初級感覺神經元的胞體位于三叉神經節。

水通道蛋白（AQPs），是對水跨生物膜的進行快速轉運的蛋白，近年陸續發現了水通道家族中的13種亞型（AQP0-AQP12）廣泛分布于哺乳類動物的各組織細胞［6］。AQP1是神經系統內主要的水通道之一。在人和嚙齒類動物的周圍神經系統，AQP1主要表達于背根神經節﹑三叉神經節中小型初級神經元上［2，7］，AQP1在中﹑小型神經元的特異性表達可能與中﹑小型神經元與淺感覺傳導有關。目前有數篇文獻報道AQP1在痛覺傳遞中的作用，但這方面的認識還存在爭議。如早期研究發現AQP1基因敲除小鼠對傷害性熱刺激（甩尾）或化學刺激（辣椒素）所誘導的疼痛反應存在輕度障礙［8］。與此相反，隨后研究發現，AQP1敲除小鼠對傷害性疼痛反應的閾值與野生型并無顯著性差異［9］。最近的研究發現AQP1敲除小鼠對舒緩激肽﹑前列腺素E2或辣椒辣素所誘導的熱性炎性疼痛反應的敏感性較野生型下降［10］。有關AQP1是否參與三叉神經痛覺傳遞目前還缺乏直接的功能學研究證據。目前僅有一篇文獻觀察PFA誘導的急性口周炎模型中，免疫組化和免疫印跡結果均提示在該模型中三叉神經節內AQP2而不是AQP1 有表達變化［11］。本試驗應用免疫熒光染色結合FG逆行追蹤標記技術發現，注射示蹤劑FG后，小鼠三叉神經節AQP1/FG雙標記神經元和AQP1單標神經元上的AQP1陽性信號光密度無明顯差異，提示FG不影響三叉神經節神經元AQP1表達水平。觀察結果FG+PFA注射組和FG+生理鹽水注射組三叉神經節AQP1/FG雙標記神經元AQP1陽性信號無明顯差異，進一步證實口腔黏膜的疼痛刺激不引起三叉神經節神經元AQP1的表達變化。盡管如此，但這些形態學結果還不足以排除AQP1參與痛覺傳遞功能。更多的功能學，包括AQP1神經元條件性基因敲除鼠的構建，有助于解決這一科學問題。

TRPV是瞬時感受器電位離子通道家族（TRP）成員，可被熱﹑細胞外滲透壓的改變和細胞內Ca2+的減少等多種理化刺激激活。TRPV4最初是作為滲透壓感受器被克隆，因為該通道可被＜30 mosM的滲透壓激活［12，13］。在周圍神經系統，TRPV4高度表達于背根神經節和三叉神經節等初級感覺傳入神經元，參與溫度﹑滲透壓改變﹑化學性和機械性以及炎癥性刺激所導致的傷害性感覺的傳遞作用［14］。有系列研究證據表明TRPV4參與了由機械性刺激或低﹑高滲透性刺激所導致的痛覺傳遞過程［15～17］。本資料結果顯示，FG不影響三叉神經節神經元TRPV4表達水平，同時口腔黏膜下注射PFA并未顯著上調三叉神經節神經元TRPV4的表達，這可能與注射的致痛物質及觀察時間點不同等有關。有關TRPV4是否有口腔痛覺的傳遞，還需進行進一步形態學和功能學的實驗證明。

本實驗觀察到TRPV4在三叉神經節有廣泛表達。既往的研究發現TRPV4 具有介導低滲透性刺激所誘導的鼠肺上皮細胞下調AQP5的表達過程［18］。結合本實驗室前期觀察到AQP1廣泛在口腔黏膜﹑舌﹑唾液腺等三叉神經纖維終末上廣泛表達［19］，還觀察到給ICR小鼠禁水24h后，三叉神經節AQP1陽性細胞的比例無明顯變化，但陽性細胞表達明顯上調［20］，高度提示可能與口腔渴覺的傳導有關。以此推測，TRPV4也可能具有調節三叉神經節神經元在脫水或滲透性變化狀態下AQP1的表達，但此推測有待于進一步驗證。

1Kai-Kai MA. Cytochemistry of the trigeminal and dorsal root ganglia and spinal cord of the rat. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol，1989， 93（1）：183～193.

2Ma TH， Gao HW， Fang XD， et al. Expression and function of aquaporins in peripheral nervous system. Acta Pharmacol Sin， 2011， 32（6）：711～715.

3Dux M， Sántha P， Jancsó G. The role of chemosensitive afferent nerves and TRP ion channels in the pathomechanism of headaches. Pflugers Arch， 2012， 464（3）：239～248.

4Ma T， Gao H， Fang X， et al. Water channel proteins in the peripheral nervous system in health and disease. Mol Aspects Med， 2012，33（5-6）：605～611.

5Moftakhar P， Lynch MD， Pomakian JL， et al. Aquaporin expression in the brains of patients with or without cerebral amyloid angiopathy. J Neuropathol Exp Neurol， 2010， 69（12）：1201～1209.

6Castle NA. Aquaporins as targets for drug discovery. Drug Discovery Today， 2005， 10（7）： 485～493.

7Nandasena BG， Suzuki A， Aita M，et al. Immunolocalization of aquaporin-1 in the mechanoreceptive Ruffini endings in the periodontal ligament. Brain Res， 2007， 1157：32～40.

8Oshio K， Watanabe H， Yan D， et al. Impaired pain sensation in mice lacking aquaporin-1 water channels. Biochem Biophys Res Comm，2006， 341（4）：1022～1028.

9Shields SD， Mazario J， Skinner K， et al. Anatomical and functional analysis of aquaporin 1， a water channel in primary afferent neurons. Pain， 2007， 131（1-2）：8～20.

10Zhang H， Verkman AS. Aquaporin-1 tunes pain perception by interaction with Na（v）1.8 Na+ channels in dorsal root ganglion neurons. J Biol Chem， 2010， 285（8）：5896～5906.

11Borsani E， Bernardi S， Albertini R， et al. Alterations of AQP2 expression in trigeminal ganglia in a murine inflammation model. Neurosci Lett，2009， 449（3）：183～188.

12Liedtke W， Choe Y， Martí-Renom MA，et al. Vanilloid receptorrelated osmotically activated channel （VR-OAC）， a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell， 2000， 103（3）：525～535.

13Strotmann R， Harteneck C， Nunnenmacher K， et al. OTRPC4， a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat Cell Biol， 2000， 2（10）：695～702.

14Liedtke W. Molecular mechanisms of TRPV4-mediated neural signaling. Ann N Y Acad Sci， 2008， 1144：42～52.

15Sato M， Sobhan U， Tsumura M， et al. Hypotonic-induced stretching of plasma membrane activates transient receptor potential vanilloid channels and sodium-calcium exchangers in mouse odontoblasts. J Endod， 2013， 39（6）：779～787.

16Alessandri-Haber N， Joseph E， Dina OA， et al. TRPV4 mediates painrelated behavior induced by mild hypertonic stimuli in the presence of inflammatory mediator. Pain， 2005， 118（1-2）：70～79.

17Alessandri-Haber N， Yeh JJ， Boyd AE， et al. Hypotonicity induces TRPV4-mediated nociception in rat. Neuron， 2003， 39（3）：497～511. 18 Sidhaye VK， Güler AD， Schweitzer KS， et al.Transient receptor potential vanilloid 4 regulates aquaporin-5 abundance under hypotonic conditions. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（12）：4747～4752.

19譚美蕓， 高俊英， 丁炯， 等. 水通道蛋白1在小鼠口腔粘膜的表達與分布. 解剖科學進展. 2011， 17（5）：458～460.

20譚美蕓， 高俊英， 肖明. 禁水后小鼠三叉神經節AQP1和AQP4表達的改變. 《江蘇醫藥》， 2011， 22：2616～2617.

Objective To provide the morphological evidence for the hypothesis that aquaporin 1（AQP1）and transient receptor potential ion channel 4（TRPV4）in the trigeminal ganglion of mice might take participate in pain transduction. Methods The mice were given oral submucosal injection of paraformaldehyde，then immunofl uorescence staining combined fl uorogold（FG）retrograde tracing technique was performed to observe changes in AQP1 and TRPV4 expression in the trigeminal ganglion neurons that innervate the oral mucosa. Results Expression and distribution of AQP1 and TRPV4 in the trigeminal ganglion neurons that project to the oral mucosa was no signifi cantly different between oral submucosal injection of paraformaldehyde-induced pain group and saline injection control group. Conclusion AOP1 and TRPV4 in the trigeminal ganglion may not take part in pain transduction.caused by the oral harmful stimulating.

AOP1 TRPV4 Trigeminal ganglia Pain sense Oral cavity

江蘇省教育廳高校“青藍工程”資助（蘇教師﹝2014﹞23號）

210029 江蘇建康職業學院人體結構教研室（譚美蕓）210029南京醫科大學人體解剖學系（楊曉欣 高俊英周建平 肖明）

頭面部的溫﹑痛﹑觸﹑壓覺等多種感覺信息的傳導是由三叉神經完成，其初級感覺神經元的胞體位于三叉神經節。三叉神經節神經元由大﹑中﹑小三種類型的假單極神經元組成，這些神經元含有的神經活性物質主要是谷氨酸﹑P物質﹑降鈣素基因相關肽和一氧化碳等［1］。除了上述的神經遞質外，近年來的研究發現三叉神經節神經元表達多種膜蛋白，例如水通道蛋白（AQPs）和瞬時感受器電位離子通道（TRPV）［2，3］等。其中，AQP1和TRPV4均在三叉神經節表達，周圍神經系統的AQP1和TRPV4均可能參與淺感覺的傳導［4，5］。2015年2月至7月作者通過實驗研究，探討AQP1和TRPV4在三叉神經口腔痛覺傳導中表達的變化。