苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達的影響

朱錦輝 陳燕 葉清煌 占小莉 王躍東

苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達的影響

朱錦輝 陳燕 葉清煌 占小莉 王躍東

目的 探討苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達的影響。方法 不同濃度苦參堿聯合吉西他濱處理PANC-1及其耐藥細胞株PANC-1/R2，流式細胞技術檢測細胞株凋亡情況；qPCR法測定Aurora-A mRNA表達。結果 流式細胞技術顯示苦參堿和吉西他濱不同給藥方式在PANC-1組和合PANC-1/R2組內凋亡率差異無統計學意義，但兩組間比較差異有統計學意義。qPCR結果，PANC-1組在空白對照、吉西他濱（400μg/ml）、苦參堿（8μg/ml）及吉西他濱（400μg/ml）聯合苦參堿（8μg/ml）處理后，Aurora-A mRNA表達分別是（1.001±0.041），（0.884±0.063），（0.884±0.063）和（0.957±0.084），與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；PANC-1/R2組分別是（1.835±0.072），（1.761±0.052），（1.879±0.068）和（1.910±0.086），與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 苦參堿與吉西他濱聯合作用具有誘導胰腺癌細胞凋亡的抗腫瘤作用，但不能逆轉胰腺癌吉西他濱耐藥的作用，不能增加化療敏感性，也不具有調節Aurora-A表達的作用。提示苦參堿可通過誘導凋亡途徑發揮抗胰腺癌作用，但其作用不十分顯著。

苦參堿 胰腺癌 Aurora-A 吉西他濱 耐藥

現代醫學研究表明，苦參類生物堿具有較高的抗腫瘤活性［1］，同時又具有免疫調節作用﹑升高白細胞［2］﹑止痛等常規化療藥物所不具備的優勢，近來還發現其能逆轉腫瘤對化療藥物的耐藥性。研究［3，4］認為苦參堿可通過誘導胰腺癌細胞凋亡﹑下調VEGF表達等方式發揮抗腫瘤作用。雖有研究表明苦參堿具有逆轉化療藥物耐藥的報道，但是否能逆轉胰腺癌吉西他濱的耐藥及調節Aurora-A表達尚缺乏研究。2015年3月至9月作者通過實驗研究，探討苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 實驗動物：鼠齡4周，體重18～20g的雄性BALB/c裸小鼠（浙江中醫藥大學動物實驗中心提供和飼養）。細胞株：人胰腺癌細胞株PANC-1及耐藥株PANC-1/R2（浙江大學醫學院附屬第二醫院外科研究所提供）。戊巴比妥鈉：中國醫藥集團上海化學試劑公司產品。qPCR儀：Biorad公司。

1.2細胞凋亡檢測 用不含EDTA 的胰酶消化細胞，取1E+5個細胞量的懸液，加入5μl Annexin V-APC，混勻后，再加入5μl 7-AAD染液，混勻，室溫，避光，反應5～15min后置于冰上。＜1h進行流式細胞儀機檢測。GFP的綠色熒光：FITC通道篩選GFP陽性細胞進行Annexin V-APC/7-AAD熒光檢測。Annexin V-APC的紅色熒光：激發波長633nm，最大發射波長660nm。7-AAD紅色熒光：激發波長Ex=546nm；發射波長Em=647nm。

1.3qPCR檢測 qPCR實驗所用AMV和Tag聚合酶為 TaKaRa公司產品，dNTP和引物由上海生工生物工程公司提供及合成。取約50mg組織，加入1ml Trizol試劑（Gibco），按試劑說明書抽提總RNA，對獲得的RNA進行分析和定量，取2 μg RNA逆轉錄，合成cDNA。實驗所用引物序列經GeneBank網上驗證，引物序列及目的片段長度見表 l。然后進行PCR擴增，擴增產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA Marker確定產物。

表1　Aurora -A引物序列

1.4統計學分析 采用SPSS14.0軟件。計數資料用%表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

作者單位：310009 浙江大學醫學院附屬第二醫院 外科

2　結果

2.1不同濃度苦參堿和吉西他濱聯合處理對兩組細胞凋亡的影響 PANC-1組的無苦參堿無吉西他濱作用﹑吉西他濱400μg/ml而無苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度4μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度8μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度16μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度32μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度64μg/ml苦參堿作用下凋亡細胞 占15.7%﹑15.7%﹑15.2%﹑12.1%﹑17.4%﹑16% 和14.2%，PANC-1/R2組的無苦參堿無吉西他濱作用﹑吉西他濱400μg/ml而無苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度4μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度8μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度16μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度32μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯合濃度64μg/ml苦參堿作用下凋亡細胞占5.9%﹑6.1%﹑8.3%﹑10.0%﹑7.0%﹑7.6%和3.9%，兩組間凋亡細胞差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1﹑2。

圖1　流式細胞技術檢測PANC-1不同處理下細胞凋亡情況

圖2　流式細胞技術檢測PANC-1/R2不同處理下細胞凋亡情況

2.2苦參堿和吉西他濱對Aurora-A表達的影響 通過qPCR技術檢測PANC-1和PANC-1/R2細胞株Aurora-A mRNA的表達情況，發現PANC-1組在空白對照﹑吉西他濱（400μg/ml）﹑苦參堿（8μg/ml）及吉西他濱（400μg/ml）聯合苦參堿（8μg/ml）處理后，Aurora-A mRNA表達分別是（1.001±0.041）﹑（0.884±0.063）﹑（0.884±0.063） 和（0.957±0.084），與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；PANC-1/R2組分別是（1.835±0.072），（1.761±0.052），（1.879±0.068）和（1.910±0.086），與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3﹑4。

圖3　PANC-1在苦參堿和吉西他濱不同處理后Aurora-A mRNA的表達

圖4　PANC-1/R2在苦參堿和吉西他濱不同處理后Aurora-A mRNA的表達

3　討論

苦參堿是我國傳統中藥-苦參根提取物中的純成分之一。苦參堿是豆科植物苦參﹑苦豆子﹑廣豆根等中草藥活性成分的提取物，其化學式為C15H24 N20，屬于四環的噻嗪啶類，分子骨架為2個噻嗪啶的雜體［5］。現代研究表明苦參堿具有廣泛的抗腫瘤特性，涵蓋消化﹑呼吸﹑耳鼻咽喉﹑神經﹑血液﹑內分泌等幾乎全身的各個系統腫瘤［6］，如在體外其有抗鼠移植性腫瘤的作用；可誘導K562和SMMC-7721細胞分化；臨床也有苦參及苦參堿（如嗎特靈注射液）對白血病﹑肝癌和胃癌治療有效的報道［7］。各種研究表明苦參堿的抗腫瘤作用可以通過抑制腫瘤細胞增殖﹑誘導腫瘤細胞分化﹑促進腫瘤細胞凋亡﹑抑制腫瘤細胞粘附轉移﹑逆轉腫瘤細胞耐藥性和調節宿主免疫功能等方面發揮作用［8～11］。目前認為臨床效果較確切的是血液系統及神經內分泌系統，對胰腺癌的作用研究較少。侯武衛［12］將不同濃度的苦參堿作用于培養的SW1990細胞，通過MTI"比色法﹑流式細胞儀和DNA凝膠電泳﹑電子顯微鏡技術觀察檢測細胞凋亡，研究分析其對SW1990細胞的生長抑制和誘導凋亡作用。通過結果分析認為苦參堿能抑制SW1990細胞增殖，誘導其凋亡。

本資料中濃度0﹑4﹑8﹑16﹑32﹑64μg/ml的苦參堿聯合400μg/ml吉西他濱作用于PANC-1和耐藥株PANC-1/R2，流式細胞技術檢測PANC-1/R2在不同濃度苦參堿和吉西他濱及不同處理方式作用下的凋亡情況，結果顯示PANC-1組的各種處理下凋亡細胞比例為12.1%～17.4%，而PANC-1/R2組為3.9% ～8.3%，兩組間凋亡細胞差異有統計學意義（P＜0.05），但組內的抑制率差異無統計學意義。表明吉西他濱耐藥細胞株篩選成功，但兩組中均可見不同濃度苦參堿作用下，細胞凋亡率變化不大，不具有明顯的逆轉耐藥的作用。研究認為多藥耐藥MDR的發生，主要以腫瘤細胞多藥耐藥mdrl基因表達的膜糖粘蛋白P170過度表達﹑肺耐藥蛋白LRP水平升高﹑腫瘤細胞DNA拓撲異構酶Ⅱ（TOPO Ⅱ）等相關酶活性增加［13］。文獻報道，苦參堿口服給藥可抑制化療誘導的獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細胞耐藥相關基因P170﹑LRP的表達及TOPOⅡ活性［11］；又有研究用苦參堿作用于K562長春新堿耐藥株（K562Pvin）和K562阿霉素耐藥株（K562Pdox），其抑制率約70%，同時伴有P糖蛋白表達的下調，表明苦參堿可能通過下調糖蛋白誘導細胞凋亡而達到殺傷多藥耐藥腫瘤細胞的作用［14］。但本資料結果未發現耐藥逆轉的現象，可能苦參堿的逆轉化療耐藥作用具有腫瘤屬性，對不同腫瘤發揮不同的作用。進一步的研究苦參堿作用下，PANC-1/R2細胞株耐藥相關基因P170﹑LRP的表達﹑TOPOⅡ活性及P糖蛋白等的表達可進一步明確苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥的無逆轉作用。

Aurora-A激酶是新近發現的調節中心體﹑微管功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在中心體成熟﹑紡錘體形成﹑染色體分離，即有絲分裂的正常進行中發揮至關重要的作用。Aurora-A認為是與腫瘤預后相關的基因之一，其表達的異?？梢鸺毎倪^度增殖﹑與侵襲轉移﹑腫瘤細胞凋亡抑制﹑調節自噬誘導耐藥等［15～17］。本資料通過qPCR技術檢測PANC-1和PANC-1/R2細胞株Aurora-A mRNA的表達情況，發現PANC-1組在空白對照﹑吉西他濱（400μg/ml）﹑苦參堿（8μg/ml）及吉西他濱（400μg/ml）聯合苦參堿（8μg/ml）處理后，Aurora-A mRNA表達分別是（1.001±0.041），（0.884±0.063），（0.884±0.063） 和（0.957±0.084），與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；對應的PANC-1/R2組分別是（1.835±0.072），（1.761±0.052），（1.879±0.068） 和（1.910±0.086），與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明Aurora-A在敏感和耐藥細胞間存在表達差異，但苦參堿和吉西他濱作用下在兩組中其表達無明顯改變，即使兩者聯合作用，Aurora-A表達亦無明顯改變，提示苦參堿和吉西他濱不具有直接調節Aurora-A激酶的作用?？梢娍鄥A聯合吉西他濱作用胰腺癌可增強誘導細胞凋亡的作用，但這種誘導凋亡的作用不十分強烈，更多的是吉西他濱的細胞毒作用，同時兩者聯合作用也不能改變Aurora-A激酶的表達。

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Objective To evaluate the effect of matrine on inducing apoptosis of pancreatic cancer cells，and regulating the expression of Aurora-A and reversing gemcitabine-resistance of pancreatic cancer. Methods Apoptosis of PANC-1 and PANC-1/R2 cells were analyzed by Flow Cytometry after treatment of matrine and gemcitabine. Aurora-A gene expression of PANC-1 / and PANC-1/R2 were analyzed by qPCR after treatment of matrine and gemcitabine. Results The outcome of Flow cytometry shows that apoptosis rates of pancreatic cells had no signifi cant difference in groups but signifi cant difference between the PANC-1 and PANC-1/R2 groups. The same phenomenon was found of Aurora-A mRNA expression in the two groups. Conclusions The combination of matrine andh gemcitabine can induce apoptosis of pancreatic cancer cells，but can not reverse the effects of gemcitabine-resistance of pancreatic cancer，can not increase sensitivity to chemotherapy，also has no impact on expression of Aurora-A. The results indicates that matrine can play a certain role of anti-pancreatic cancer by inducing apoptosis.

Matrine Pancreatic carcinoma Aurora-A Gemcitabine Resistance

浙江省中醫藥優秀青年人才基金項目（2013ZQ022）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2012KYB018）