利用實時熒光PCR技術快速檢測玉米籽粒中轉基因成分

王 穎， 任志瑩， 陳芳芳

(農業部農產品質量監督檢驗測試中心(沈陽)，遼寧沈陽 110161)

?

利用實時熒光PCR技術快速檢測玉米籽粒中轉基因成分

王 穎， 任志瑩， 陳芳芳

(農業部農產品質量監督檢驗測試中心(沈陽)，遼寧沈陽 110161)

[目的]利用TaqMan特異性熒光標記法快速檢測玉米籽粒中轉基因成分。[方法]外源基因選取具有一定代表性的CaMV35S啟動子、NOS終止子、BAR、CryIA(b)基因，數據結果由實時熒光定量PCR反應的Ct值判定。[結果]用該方法檢測玉米籽粒中未含有轉基因成分，可作為結果判定。[結論]該方法在樣品量大時極具優勢，高效，準確，對環境污染較小。

轉基因玉米；實時熒光定量PCR；特異性；外源基因

隨著轉基因技術的飛速發展以及轉基因生物的大面積推廣，在關注轉基因生物所帶來的巨大社會、經濟和生態效益的同時，轉基因生物及其產品的安全性問題也引起了世界范圍內的廣泛關注。農業轉基因生物及其產品對人類健康和生態環境是否會帶來潛在不良影響，已引起人們的普遍關注。加強農業轉基因生物及產品安全性監管，對保護和促進我國農產品貿易和我國農業生物技術產業的發展具有重要意義[1]。因此，轉基因標識制度相繼建立，對轉基因檢測技術也提出了嚴格的要求，轉基因檢測技術也成為研究熱點。PCR檢測具有高靈敏度、高特異性和高效性的特點，是目前檢測轉基因農作物和食品中轉基因成分最為成熟和廣泛應用的方法。

PCR儀檢測方法有普通PCR熒光定性方法和實時熒光定量方法2種。前者提取待測樣品DNA后經過PCR擴增、制膠、電泳，再由凝膠像儀觀察電泳后膠板中DNA條帶情況。此法可判斷待測樣品中是否含有轉基因成分。影響結果正常表達的因素有很多： DNA濃度、電泳電壓、跑膠時間、膠板厚度、氣溶膠、人為判斷誤差等；后者提取待測樣品DNA后無需經過電泳及凝膠成像步驟，直接擴增，由PCR儀熒光檢測器捕獲信號。常用2種熒光標記方法：SYBR Green非特異性熒光標記法和TaqMan特異性熒光標記法[2]。SYBR Green非特異性熒光標記法雖然操作方便，但反應時易產生假陽性，影響結果判斷。筆者利用TaqMan特異性熒光標記法快速檢測玉米籽粒中是否存在轉基因成分。

1　材料與方法

1.1試驗材料選取玉米籽粒陰性對照樣品一份，轉基因玉米Bt11陽性樣品一份，待測玉米籽粒樣品一份。

1.2試劑及儀器植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技公司；Premix EXTaq,大連寶生物工程有限公司；iTaqUniversal Probes Supermix,BIO-RAD公司；引物及探針，Invitrogen沈陽匯佰生物科技公司合成；BIO-RAD IQ5定量PCR儀，美國伯樂公司；NanoDrop2000型DNA定量儀，美國Thermostat公司；臺式離心機，德國Eppendorf公司；生物安全柜，蘇州凈化設備有限公司[3]。

1.3試驗方法

1.3.1DNA提取。將待測玉米籽粒在無菌條件下研磨，充分混勻樣品，按四分法各取樣品0.1～0.2 mg，分裝至3個離心管中，采用試劑盒提取DNA，制備成待測樣品DNA溶液。將玉米陰性樣品、玉米陽性樣品及待測樣品檢測濃度后待用[4-5]。

1.3.2擴增體系制備[2]。擴增體系見表1。對玉米樣品中轉基因成分的檢測，參數可選擇CaMV35S啟動子、NOS終止子、BAR、CryIA(b)基因。結果為陽性時進一步對轉基因品系進行鑒定。

表1實時熒光定量PCR擴增體系

Table 1Amplification system of real-time fluorescent quantitative PCR

試劑名稱Reagentname終濃度Finalconce-ntration體積Reaction∥uLiTaqTMUniversalProbesSrpermix1×25.00引物RPrimerR(10umol/L)150nmol/L0.75引物FPrimerF(10umol/L)150nmol/L0.75探針Probe(5umol/L)50nmol/L0.50DNA模板DNAtemplate(40～50ng/uL)—4.00補水至Watersupplement—50.00

1.3.3實時熒光PCR反應參數。實時熒光定量PCR反應程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，40個循環[6]。實時熒光定量PCR擴增所用引物和探針見表2。

表2實時熒光定量PCR 擴增所用引物和探針

Table 2Primers and probes for real-time fluorescent quantitative PCR amplification

待測基因Detectedgene引物、探針序列Sequencesofprimersandprobes擴增片段長度Lengthofamplifiedfragments∥bpZEIN5'-TGAACCCATGCATGCAGT-3'—5'-GGCAAGACCATTGGTGA-3'5'-FAM-TGGCGTGTCCGTCCCTGATGC-3'CaMV35S5'-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3'745'-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3'5'-FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-3'NOS5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'1655'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'5'-FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-3'BAR5'-ACAAGCACGGTCAACACC-3'—5'-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3'5'-FAM-CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG-3'CryIA(b)5'-GGGAAATGCGTATTCAATTCAAC-3'735'-TTCTGGACTGCGAACAATGG-3'5'-FAM-ACATGAACAGCGCCTTGACCACAGC-3'

2　結果與分析

2.1DNA提取質量DNA溶液經DNA定量儀測定，提取的DNA完整性很好，OD260/OD280均在1.8～1.9，符合定量PCR檢測要求。

2.2實時滎光定量PCR結果待測樣品、玉米陰性對照樣品和玉米陽性對照樣品每個參數共2個平行反應，同時做空白對照，即03～04空白對照，05～06陰性對照，07～08待檢樣品，09～10陽性對照。共選取內標基因及外源基因5組參數：B行篩選CaMV35S基因，C行篩選NOS基因，D行篩選BAR基因，E行篩選CryIA(b)基因，F行內標基因。由每組參數Ct值可以判定，該試驗結果有效：外源基因組Ct值大于或等于40，內源基因檢測Ct值小于或等于24，判定此樣本未檢出該外源基因。外源基因組Ct值小于或等于36，內源基因檢測Ct值小于或等于24，判定此樣本檢出該外源基因。

由表3可知，陰性對照樣品、陽性對照樣品及待測樣品內標基因Ct值均小于等于24，為玉米樣品；待測樣品檢測其余篩選的外源基因均未檢測到。由此可知，該玉米籽粒中未含有轉基因成分，可作為結果判定。

表3　PCR定量檢測結果

3　討論

該研究利用TaqMan特異性熒光標記法快速檢測玉米籽粒中轉基因成分，可達到快速、準確檢測大量樣品的目的，無需配制標準曲線，可做定性分析。目前實時熒光定量PCR均采用外標定量，需要已知濃度的檢測物作為參照樣品，參照標準品的制備費時、費力、成本高。當無需被測樣品轉基因成分含量只需定性分析時，用普通PCR儀后期工作量大，在環境中易形成氣溶膠，造成二次污染，影響結果正常分析。實時熒光PCR反應可避免對環境及人體造成危害，環保高效，為人所用。

[1] 郭金超,付仲文,于晴,等.對我國農業轉基因作物研發及安全管理的思考[J].安徽農業科學,2015(25):333-336.

[2] 宋君，雷紹榮，劉勇，等.轉基因玉米MON863 品系特異定量PCR 方法的建立[J].湖北農業科學,2011, 50(24): 5250-5253.

[3] 袁磊,紅煒,李凡.以實時熒光定量PCR 技術檢測轉基因玉米MON88017[J].作物學報,2011, 37(11): 2117-2121.

[4] 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫總局.轉基因產品檢測 核酸定性PCR 檢測方法:GB/T19495．4—2004[S]．北京：中國標準出版社，2004.

[5] 中華人民共和國山東出入境檢驗檢疫總局.轉基因產品檢測核酸定量PCR 檢測方法:GB/T19495．5—2004[S]．北京：中國標準出版社，2004.

[6] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.轉基因成分檢測 玉米檢測方法:SN/T 1196-2012[S].北京：中國標準出版社，2013.

Quickly Detection of Transgenic Ingredients in Corn Grain by Real-time Fluorescent PCR Technology

WANG Ying, REN Zhi-ying, CHEN Fang-fang

(Agricultural Products Quality Supervision, Inspection and Test Center (Shenyang) of the Ministry of Agriculture, Shenyang, Liaoning 110161)

[Objective] To rapidly detect the transgenic ingredients in corn grain by TaqMan specificity fluorescent tags. [Method] CaMV35S promoters and NOS terminator, BAR, CryIA(b) gene with certain representativeness were selected as exogenous genes. Data results were judged by Ct value of real-time fluorescent quantitative PCR reaction. [Result] corn grain without transgenic ingredients detected by this method could be used as the judgement result. [Conclusion] This method is of most advantage under large sample amount. It is efficient and accurate, and has less pollution to the environment.

Transgenic corn; Real-time fluorescent quantitative PCR; Specificity; Exogenous gene

農業部科技發展中心項目。

王穎(1974- )，女，遼寧沈陽人，助理研究員，從事農產品轉基因成分檢測方法比較研究。

2016-05-26

S 513

A

0517-6611(2016)20-112-02