長雙歧桿菌NCC2705分泌蛋白的全基因組預測和功能分析

朱德全，王茗悅，栗金柳，孟祥晨，程廣東，岳麗紅，王長平，薛 勇

(1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

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長雙歧桿菌NCC2705分泌蛋白的全基因組預測和功能分析

朱德全1,2，王茗悅1，栗金柳1，孟祥晨2*，程廣東1，岳麗紅1，王長平1，薛 勇1

(1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

以長雙歧桿菌NCC2705基因組序列為研究對象，使用 SignalP 4.0、LipoP 、TMHMM 2.0 軟件分析該基因組中的分泌蛋白及其信號肽的類型，同時采用COG (Cluster of Orthologous Groups of proteins)功能數據庫對預測的分泌蛋白進行功能注釋和聚類分析。結果表明，長雙岐桿菌NCC2705 中共有37個Sec 途徑分泌蛋白，其中Sec 途徑分泌蛋白包括27個被I 型(SPase Ⅰ)信號肽酶和10個 Ⅱ 型信號肽酶(SpaseII)識別的蛋白，Sec 途徑分泌蛋白信號肽長度最多的有52 個氨基酸，最少的有10個氨基酸。分泌蛋白的功能分析表明，該菌株分泌蛋白中含有大部分的假定蛋白，主要參與氨基酸代謝與轉運、碳水化合物代謝轉運，無機鹽離子代謝轉運，細胞壁和細胞膜生物合成的功能有關。

長雙歧桿菌；基因組；分泌蛋白；分泌途徑；信號肽

雙歧桿菌是人和動物腸道最常見的革蘭氏陽性有益細菌，約占人體腸道可培養微生物的10%。大量研究表明，雙歧桿菌對宿主具有多種益生功能，可以通過平衡腸道菌群維持機體的整體健康水平。因此，雙歧桿菌屬的微生物是應用較多的益生菌之一，在食品中通常通過添加在乳制品中食用。雙岐桿菌的分泌蛋白在介導菌體與宿主細胞黏附定值、與外界環境相互作用方面起著非常重要的作用[1]。Mac Conaill等[2]從輸出系統鑒定了雙岐桿菌的分泌蛋白，Moon GS 利用基于凝膠的蛋白組學方法初步分析了假小鏈雙歧桿菌(BifidobacteriumpseudocatanulatumBP1)的分泌蛋白[3]，但這些方法都不能完全鑒定出雙歧桿菌的分泌蛋白。隨著第1株雙歧桿菌NCC2705全基因組測序的完成，從基因組層面上部分揭示了該菌在消化道環境的適應特征[4]。此后，在全世界范圍內掀起了雙歧桿菌全基因組測序的浪潮，截至2015年4月已有超過47株雙歧桿菌全基因組完成序列測定并向國際公共數據庫NCBI遞交了全基因組序列。因此，使得利用基因組學數據進行功能基因組學分析得以實施，如分泌蛋白的基因組預測和分析。

目前，關于基因組分泌蛋白分析的研究報道主要集中在病原菌方面[5-7]。周曉罡等[6]對馬鈴薯晚疫病菌全基因組分泌蛋白進行了初步分析。筆者以長雙歧桿菌亞種NCC2705全基因組序列為研究對象，使用 SignalP 4.0、LipoP、TMHMM 2.0軟件分析該基因組中的分泌蛋白和分泌信號肽的類型，同時采用COG數據庫對預測的分泌蛋白進行功能注釋和聚類分析。

1　材料與方法

1.1材料以美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站GenBank數據庫公布的長雙歧桿菌NCC2705 的基因組序列的編碼蛋白質為研究對象，GenBank數據庫中的登錄號為NC_004307.2。

1.2方法

1.2.1Sec 途徑分泌蛋白的篩選。Sec途徑分泌蛋白包括具有SPase Ⅰ肽酶識別和SPase Ⅱ 肽酶識別的分泌蛋白。使用SignalP 4.0 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對長雙岐桿菌NCC2705基因組蛋白進行初篩，若Sprob>0.8或Smean>0.6則初步認為具有信號肽，使用TMHMM 2.0 軟件(http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對含有信號肽的序列進行分析，分析是否具有跨膜螺旋，對于沒有跨膜螺旋或只有1個跨膜螺旋的蛋白進行進一步分析。使用LipoP1.0 軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)分析是否可以被SPase Ⅰ 型信號肽酶和II 型信號肽酶識別，其中不能被I 型信號肽酶識別但可以被II 型信號肽酶識的蛋白則被歸類為SPase Ⅱ 肽酶識別的分泌蛋白[8]。

1.2.2Sec 途徑分泌蛋白信號肽的分析。統計SPase Ⅰ 和SPase Ⅱ肽酶信號肽，分析它們的序列特征。

1.2.3分泌蛋白的功能注釋和聚類分析。使用COG (http://eggnog.embl.de/)功能數據庫對分析得到的分泌蛋白質進行功能注釋，同時進行聚類分析。

2　結果與分析

2.1長雙歧桿菌亞種NCC2705基因組分泌蛋白篩選先后使用3種軟件對長雙歧桿菌亞種NCC2705基因組中的1 726個蛋白進行分泌蛋白的預測分析，預測結果見表1。SPase Ⅰ肽酶識別的Sec途徑分泌蛋白信號肽結果見表2，Spase Ⅱ肽酶識別的Sec途徑分泌蛋白結果見表3。

表1長雙歧桿菌NCC2705基因組中分泌蛋白的預測結果

Table 1The prediction results of secretory protein in Bifidobacterium longum NCC2705 genome

分泌蛋白種類Typeofsecretoryprotein數量Quantity百分比Proportion%SpⅠ分泌蛋白SpⅠsecretoryprotein271.6SpⅡ蛋白SpⅡprotein100.6分泌蛋白總數Totalsecretedproteins372.2

表2長雙歧桿菌NCC2705 SPase Ⅰ肽酶識別的Sec途徑分泌蛋白信號肽和功能分析

Table 2Identification of Sec pathway secreted protein signal peptide and functional analysis of Bifidobacterium longum NCC2705 SPase Ⅰ peptide enzyme

序列號SerialNo.基因編號GeneNo.蛋白名稱ProteinsCOG注釋功能聚類COGannotationfunctionclustering信號肽種類Signalpeptidetypes信號肽序列Signalpeptidesequence1BL00155’-nucleotidasefamilyproteinCOG0737[F]SPaseⅠMKNRRWAGKRSGIAFGAVALILTALVVPY-ACA2BL0025hypotheticalsecretedproteinwithprob-ableacidphosphatasedomainCOG1404[O]SPaseⅠMEHMKMFRHLSSVFAIATIAPLALA3BL0032hypotheticalprotein—SPaseⅠMRRVTRTIAAAGAAIACCVTMTACS4BL0033solutebindingproteinofABCtrans-portersystempossiblyforsugarsCOG1879[G]SPaseⅠMKNWKKAIALVASAAALVSVAACG5BL0077solute-bindingproteinforglutamate/aspartateABCtransportersystemCOG0834[ET]SPaseⅠMSIKVGKSFKALIAAGAALVMAAS-MAACGPSAGTPSEA6BL0091hypotheticalprotein—SPaseⅠMKRSDYMLAALASAVLPNLGVAGVREN-VQA7BL0103possiblesolutebindingproteinofABCtransporterCOG0715[P]SPaseⅠMKKSLVSKAAALVGALAMTFGFA8BL0104possiblepermeaseproteinofABCtransportersystemCOG0600[P]SPaseⅠMSIAKRLKRR9BL0113phosphomethylpyrimidinekinaseCOG0351[H]SPaseⅠMRCVPVMRTKTPSRRSTSLSA10BL0122possiblelipoproteinsignalpeptidaseCOG0597[MU]SPaseⅠMAVFACVAAAALIVDQLTKAWA11BL1317peptidoglycansynthetase;penicillin-bindingprotein3precursorCOG0768[M]SPaseⅠMNTIRRIVEFAKVKTFAFKCIAIGAALAL-VASACVIQLASTQLIGGRQTAQA12BL1330solute-bindingproteinofABCtrans-portersystemCOG1653[G]SPaseⅠMKGTFKKAVALGSAIALVGGLAACGSSSG-DGTAEL13BL1335endo-beta-N-acetylglucosaminidaseCOG4724[G]SPaseⅠMRRGEQERKPMNKTMTWRRV-LAASLAAMLAMSLAACSGGTSA14BL1345solute-bindingproteinofABCtrans-porterforpeptidesCOG0747[E]SPaseⅠMNSKKILAAAVSVAAIASLTACGGVKDD-TAAGA15BL1386DppACOG4166[E]SPaseⅠMKKKALAFAAMACSVAMLLSACGGSNSNA16BL1395hypotheticalprotein—SPaseⅠMTRRILGLLACMAAVLSLAACTPAGR17BL1403histidinekinasesensoroftwo-compo-nentsystem—SPaseⅠMPVTTRVWCSVVMVPLASFMCMAQTSFFA18BL1485hypotheticalprotein—SPaseⅠMKGIRRIRQRLCALPLALACLMGLA19BL1488hypotheticalprotein—SPaseⅠMKPGLRKVAALILASVTLFGSGASA20BL1489hypotheticalproteinwithlimitedsimi-laritytoPrgBaggregationsubstance—SPaseⅠMNFGRKMMKAGVAAVAAIATLGAGGV-VASTAFA21BL1498hypotheticalprotein—SPaseⅠMVFARRSTTLLAAIIASCAMVLSLTACT22BL0780hypotheticalprotein—SPaseⅠMFELSCHTSGSRTSSSQAMPVSLR23BL0829oligopeptidebindingproteinofABCtransporterCOG4166[E]SPaseⅠMNTRHVTSLVAAGAAIVMLLSGCGST-GTSNSSNA24BL0831hypotheticalprotein—SPaseⅠMNTRLATKTKAAIIAAAISLLALTIGI-IWMMTPHGSSNDSA25BL0855hypotheticalproteinCOG1835[I]SPaseⅠMTRSDDVINEDGHDVIAAHTRVVRG-MAAALAAIAATGAGVTAAA26BL0889hypotheticalprotein—SPaseⅠMKNKLFASVPNILFGALITIAPQTFAHA27BL0994solutebindingproteinofABCtrans-portersystemCOG0803[P]SPaseⅠMGTQITRLTRLAAAGLSAVLLFATTACA

表3長雙歧桿菌NCC2705 SPase Ⅱ肽酶識別的Sec途徑分泌蛋白信號肽和功能分析

Table 3Identification of Sec pathway secreted protein signal peptide and functional analysis of Bifidobacterium longum NCC2705 SPase Ⅱ peptide enzyme

序列號SerialNo.基因編號GeneNo.蛋白名ProteinsCOG注釋功能聚類COGannotationfunctionclustering信號肽種類Signalpeptidetypes信號肽序列Signalpeptidesequence1BL0022glutamate-bindingproteinofABCtrans-portersystemCOG0834[ET]SPaseⅡMIAALAAVACTMSLA2BL0032hypotheticalprotein—SPaseⅡMRRVTRTIAAAGAAIACCVTMTA3BL0033solutebindingproteinofABCtransportersystempossiblyforsugarsCOG1879[G]SPaseⅡMKNWKKAIALVASAAALVSVAACG4BL0077solute-bindingproteinforglutamate/as-partateABCtransportersystemCOG0834[ET]SPaseⅡMSIKVGKSFKALIAAGAALVMAAS-MAA5BL1330solute-bindingproteinofABCtransportersystemCOG1653[G]SPaseⅡMKGTFKKAVALGSAIALVGGLAA6BL1345solute-bindingproteinofABCtransporterforpeptidesCOG0747[E]SPaseⅡMNSKKILAAAVSVAAIASLTA7BL1386DppA2COG4166[E]SPaseⅡMKKKALAFAAMACSVAMLLSA8BL1395hypotheticalprotein—SPaseⅡMTRRILGLLACMAAVLSLAA9BL1485hypotheticalprotein—SPaseⅡMKGIRRIRQRLCALPLALACLM-GLAAC10BL0829oligopeptidebindingproteinofABCtrans-porterCOG4166[E]SPaseⅡMNTRHVTSLVAAGAAIVMLLS

據此推測，分泌蛋白沒有或只有1個跨膜螺旋，根據該條件發現SpaseI 信號肽識別的分泌蛋白27個。LipoP 1.0 軟件分析結果表明，27個蛋白為SPase Ⅰ 信號肽酶所識別，10個蛋白可被SpaseII 信號肽酶所識別。Sec 途徑分泌蛋白信號肽長度最多的有52個氨基酸，最少的有10個氨基酸。

2.2長雙歧桿菌亞種NCC2705基因組分泌蛋白功能分析分泌蛋白的功能分析表明，該菌株分泌蛋白中含有大部分的假定蛋白，共有14個蛋白COG沒有功能注釋，具體結果見圖1。其中，SPase Ⅰ 型信號肽分泌蛋白中有假定蛋白10個，占SPase Ⅰ 分泌蛋白的37.0%。這些蛋白在COG功能注釋結果中，11個蛋白沒有COG功能注釋，有功能注釋的分泌蛋白主要參與氨基酸代謝與轉運、碳水化合物代謝轉運，無機鹽離子代謝轉運，細胞壁/細胞膜生物合成的功能有關。SPase Ⅱ 型信號肽酶識別的分泌蛋白中有假定蛋白10個，3

圖1　長雙歧桿菌NCC2705 Sec途徑分泌蛋白的COG功能分析Fig.1　COG function analysis of Bifidobacterium longum NCC2705 through Sec pathway

個蛋白沒有COG功能注釋，其余蛋白參與氨基酸代謝與轉運和碳水化合物代謝轉運。

3　結論與討論

分泌蛋白是微生物吸收營養物質、適應外界環境和與宿主發生相互作用的物質基礎。通過對長雙歧桿菌NCC2705 Sec途徑分泌蛋白功能聚類分析結果得以證實。這與其他微生物類似。例如，芽孢桿菌是較早完成分泌蛋白預測的細菌，共發現了301個分泌蛋白，占基因組總數的7.3%。芽孢桿菌的分泌蛋白類型和數量都較多，可能與適應土壤微生物環境有關[9]。

對分泌蛋白的預測和功能分析是研究雙歧桿菌適應宿主環境分子機制的重要途徑。筆者從對長雙歧桿菌NCC2705 Sec途徑分泌蛋白的功能預測發現，分泌蛋白主要參與氨基酸、碳水化合和無機鹽離子的代謝與轉運功能有關，這有利于雙歧桿菌在大腸環境中對上消化道不能利用的復雜碳水化合物加以利用，以利于生存[10]。

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Genome-wide and Function Analysis of the Secretory Proteins ofBifidobacteriumlongumNCC2705

ZHU De-quan1,2，WANG Ming-yue1，LI Jin-liu1，MENG Xiang-chen2*et al

(1.College of Life Science，Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154007; 2.Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030)

With the genome proteins sequences ofBifidobacteriumlongumFNCC2705 as study objects，SignalP 4.0,LipoP,TMHMM 2.0 software were used to analyze the secretory proteins and types of signal peptide.Function of secretory proteins was also analyzed by COG (Cluster of Orthologous Groups of proteins) database.Results showed a total of 37 secretion proteins through Sec pathway which included 27 secreted proteins recognized by SPase Ⅰ and 10 secreted proteins recognized by SPase Ⅱ.Maximum length of their signal peptide is 52 aa and minimum length is 10 aa respectively.The functions ofBifidobacteriumsecretory protein showed there were many hypothetical proteins.Secretory protein with annotation of COG functions were mainly involved in amino acid transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism，inorganic ion transport and metabolism,etc..The functions of these secretory proteins can help bifidobacterium adapt to its host environment.

Bifidobacteriumlongum; Genome; Secreted proteins; Secretion pathways; Signal peptide

佳木斯大學科研項目(S2011-049);黑龍江省衛生計生委科研項目(2016-325)。

朱德全(1980- )，男，貴州遵義人，講師，博士，從事微生物生物技術研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事微生物生物技術研究。

2016-06-02

S 188

A

0517-6611(2016)20-109-03