響應面法優化費菜SOD提取條件的研究

王 美， 武紀汝, 劉艷芳， 王文斗，2*

(1.山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000; 2.山西師范大學現代文理學院，山西臨汾 041000)

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響應面法優化費菜SOD提取條件的研究

王 美1， 武紀汝1, 劉艷芳1， 王文斗1，2*

(1.山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000; 2.山西師范大學現代文理學院，山西臨汾 041000)

[目的]利用響應面法優化費菜SOD的提取條件。[方法]首先進行單因素優化試驗，單因素分別為時間、pH、液料比。經過單因素優化試驗，得出最優時間、最優pH、最優料液比。通過Design expert8.0.5軟件設計出17種試驗方案。通過試驗，得出每種方案的蛋白得率，利用Design expert8.0.5軟件進行了方差分析，各因素之間的交互作用分析，并得出了相應的數學模型。[結果]單因素試驗中，最優時間為1 h，最優pH為7.8、最優料液比為1∶15 g/mL。各因素交互作用分析表明，提取費菜SOD的最佳方案為提取時間0.98 h、pH 7.79、料液比1∶13.71 g/mL。利用鄰苯三酚自氧法測得提取的SOD酶活為12 U/g。[結論]該研究結果可為費菜資源的進一步利用與研究提供參考。

費菜；SOD；響應面法

費菜(SedumaizoonL.)為景天科景天屬多年生肉質草本植物[1]，抗性極強，在很多類型的土質環境中都能生長。費菜是一種藥材，藥效與三七相近，有擴張動脈血管、活血止血、安靜定氣等作用[2]。在日常生活中，費菜又被視為保健蔬菜，廣受青睞[3]。

SOD是一種蛋白酶，由蛋白亞基與金屬離子組成，廣泛存在于各種動植物以及一些微生物體內[4]。在生物體內，SOD催化自由基發生歧化反應，清除體內自由基，是世界公認的具有抗氧化、抗衰老的活性物質，常用于保健產品中[5-6]。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料。費菜，采于山西臨汾堯都區，采取鮮葉用于試驗。

1.1.2化學試劑。丙酮、無水乙醇、三氯甲烷、馬斯亮藍G-250、95%乙醇、85%磷酸、濃鹽酸、鄰苯三酚、Tris-HCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉。

1.1.3儀器設備。電子天平、冷凍離心機、水浴鍋、4 ℃冰箱、723N可見分光光度計、PHS-3C酸度計、微量移液器、離心管、容量瓶、量筒、燒杯等。

1.2方法

1.2.1提取與純化。采摘費菜鮮葉，洗凈，吸干水分，稱取1 g鮮葉，置于預冷研缽中，加入5 mL 磷酸緩沖液充分研磨，提取SOD粗酶液。將所得粗酶液加入等體積預冷的丙酮，混勻，靜置15 min，冷凍離心20 min，棄上清，用磷酸緩沖液溶解沉淀，得SOD酶液[7-8]。

1.2.2含量測定。取1 mL SOD酶液與5 mL考馬斯亮藍G-250溶液混合，染色5 min，595 nm波長測OD值。通過標準曲線計算蛋白含量[9]。

1.2.3酶活測定。利用鄰苯三酚自氧化法測SOD活性[10]。

1.2.4試驗設計。首先進行單因素的優化試驗，確定單因素的最優水平，利用Design expert8.0.5軟件設計試驗方案[11]。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1提取時間。經反復試驗，抽提時間小于1 h，所得酶液的蛋白濃度隨抽提時間的增加而上升，1 h時蛋白濃度達最大值(為4.275 μg/mL)；1 h后，隨時間的增加蛋白濃度逐漸變小。得出最適抽提時間為1 h。

2.1.2pH。7.27.8時，隨著pH的增高蛋白濃度呈下降趨勢。得出最適pH值為7.8。2.1.3料液比。經過反復試驗，得到最優料液比為1∶15 g/mL。2.2各因素間的交互作用

2.2.1設計方案與試驗結果。在單因素試驗基礎上，根據響應面法核心對稱策劃理論[12]，運用3因素3水平的響應曲面分析方法，共設計試驗方案17個，見表1。

表1Design exerpt8.0.5軟件設計方案及試驗結果

Table 1Design exerpt8.0.5 software design scheme and experimental results

試驗號TestNo.A時間TimehBpHC料液比Solid-to-liquidratio∥g/mLY蛋白得率Proteinyield∥μg/g10.2507.6001∶1516.24320.2507.8001∶519.77431.0008.0001∶519.06841.7507.6001∶1517.65550.2508.0001∶1519.77461.0007.6001∶517.65571.7508.0001∶157.76881.7507.8001∶514.12491.0007.8001∶1529.661101.0007.8001∶1529.661111.0008.0001∶2516.243121.7507.8001∶257.062131.0007.8001∶1529.661141.0007.6001∶2515.537151.0007.8001∶1529.661160.2507.8001∶2516.949171.0007.8001∶1529.661

2.2.2回歸方程的建立與方差分析。根據試驗結果，利用Design exerpt8.0.5軟件，得到蛋白得率(Y)對時間(A)、pH(B)、料液比(C)的二次多項方程：

Y=29.66-3.27A-0.53B-1.85C-3.35AB-1.06AC-0.18BC-8.47A2-5.83B2-6.71C2

R2= 0.961 1，擬合程度良好。

方差分析結果見表2。

由表2可看出，模型顯著性水平為極顯著，擬合度好，能較好地描述時間、pH、料液比3因素及其交互作用對蛋白得率的影響。根據F數值判斷3因素對響應面的影響為：時間 > 料液比 >pH。

2.2.3響應面分析。

(1)時間與pH的交互作用。由圖1可看出，蛋白得率對時間與pH交互作用的響應呈開口向下的凸面，響應值約在1h、pH7.8處存在最高值。

(2)時間與料液比的交互作用。由圖2可看出，蛋白得率對時間與料液比交互作用的響應呈開口向下的凸面，響應值約在1h、料液比為1∶15g/mL處存在最高值。從左圖看出等高線顏色變化不太明顯，表明時間與料液比交互作用對蛋白得率的影響不顯著(與方差分析結果一致)。

表2　方差分析結果

注：**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

Note: **. Extremely significant difference(P<0.01); *. Significant difference(P<0.05).

(3)pH與液料比的交互作用。由圖3可知，pH與液料比交互作用的響應面也呈開口向下的凸面，響應值約在pH 7.8、液料比為1∶15 g/mL附近存在最高值。等高線顏色變化不明顯，pH與料液比交互作用對蛋白得率的影響不顯著(與方差分析結果一致)。

2.2.4最適提取方案。由Design expert8.0.5軟件得到了費菜SOD提取最佳提取方案：時間0.98 h，pH 7.79，料液比為1∶13.71 g/mL，蛋白得率為29.88 μg/g。

2.3酶活力測定利用鄰苯三酚自氧法測定所提取的SOD酶活力，酶液濃度為2.372 μg/mL時，酶活力為12 U/g。

3　討論

目前SOD提取方法主要有熱變性法、硫酸銨分級鹽析法、超聲波破碎提取法、丙酮沉淀法。其中丙酮沉淀法試驗方法簡單，成本低廉。響應面法是一種較為簡單的尋找最佳試驗方案的科學方法，考慮了試驗的隨機誤差，簡單的多項式擬合模型，適用于試驗方案的設計與優化，具有用時短、精確度高、顯著性強的特點。該試驗選擇兼具食用、藥用及園林觀賞價值的景天科植物費菜為試驗材料，采取丙酮沉淀法提取其超氧化物歧化酶，利用響應面法設計并優化提取方案，試驗結果可為費菜資源的進一步利用與研究提供參考。

圖1　時間與pH交互作用對蛋白得率的影響Fig.1　Effects of time and pH interaction on protein yield

圖2　時間與料液比交互作用對蛋白得率的影響Fig.2　Effects of time and solid-liquid ratio interaction on protein yield

圖3　pH與液料比交互作用對蛋白得率的影響Fig.3　Effects of pH and solid-liquid ratio interaction on protein yield

[1] 衣艷君.費菜的利用價值及栽培[J].特種蔬菜，2000(4):38.

[2] 李宋香.費菜的栽培技術及其藥用價值[J].海峽藥學,2001(4):63-65.

[3] 張貴生,王桂萍.費菜對鯉魚肝臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響[J].四川動物,2012(6):909-911.

[4] 陳鴻鵬,譚曉風.超氧化物歧化酶(SOD)研究綜述[J].經濟林研究,2007(1):59-65.

[5] 魏瑞鋒,魏桃英.獼猴桃中SOD提取工藝研究[J].安徽農業科學,2013(32):12716-12717+12757.

[6] 李祖明,霍笑靚,高麗萍,等. 酶法輔助超聲波法提取類球紅細菌SOD工藝研究[J].沈陽農業大學學報,2014(1):47-51.

[7] 孔祥智,黃雪松.硫酸銨鹽析法分步分離大蒜SOD和蒜氨酸酶的研究[J].食品工業科技，2008(1):165-166.

[8] 陳 莉,申小蓉,趙紅洋,等.佛甲草中SOD提取條件的優化[J].草原和草坪,2009(1):1-6.

[9] 李志江.考馬斯亮藍G250染色法測定啤酒中蛋白質含量[J].釀酒,2008(1):70-72.

[10] 張文軍,葛超.NBT光還原法、鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活性的比較(簡報)[J].河北職業技術師范學院學報,2000(2):68-70.

[11] 肖懷秋,李玉珍,林親錄,等.Box-Behnken響應面優化冷棒花生粕酶解制備花生肽工藝[J].中國糧油學報,2014(29):45-46.

[12] 鄧仕任,夏林波,李博.響應面法優化芫花總黃酮的提取工藝[J].中國食品添加劑,2012(1):70-75.

Study on Optimizing Extracting Conditions of SOD inSedumaizoonby the Response Surface Method

WANG Mei1, WU Ji-ru1, LIU Yan-fang1, WANG Wen-dou1,2*

(1. School of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen, Shanxi 041000; 2. Moden College of Arts and Sciences, Shanxi Normal University, Linfen, Shanxi 041000)

[Objective] The aim was to optimize extracting conditions of SOD inSedumaizoonby response surface method. [Method] First, the single factor optimization tests were carried out. Three single factors are time, pH and solid-to-liquid ratio respectively. By Design expert 8.0.5 software, 17 kinds of test scheme were designed. The protein yield of each scheme was obtained, Design expert 8.0.5 software was used to conduct variance analysis, interactive analysis among factors, corresponding mathematical model was obtained. [Result] The results showed that in single factor experiments, the optimal time is 1 hour, pH is 7.8, and solid-to-liquid ratio is 1∶15 g/mL. Factors interactive analysis indicated that the optimal scheme for extracting SOD inSedumaizoonis time 0.98 h, pH 7.79, solid-to-liquid ratio 1∶13.71 g/mL. By the method of pyrogallol autoxidation, the extracted SOD enzyme activity was measured, that is 12 U/g. [Conclusion] The results can provide reference for further utilization and research ofSedumaizoonresources.

Sedumaizoon; FSOD; Response surface method

王美(1991- )，女，山西朔州人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。*通訊作者，農業推廣碩士，副教授，從事園林植物、園林設計研究。

2016-06-06

S 567.23

A

0517-6611(2016)20-063-03