清胰復(fù)方制劑對大鼠的長期毒性研究*

雷　蕾，茆芮婕，汪　巍，姚曉東，何芋岐，周旭美△（.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，貴州遵義563003）

清胰復(fù)方制劑對大鼠的長期毒性研究*

雷蕾1，茆芮婕2，汪巍1，姚曉東1，何芋岐1，周旭美2△（1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，貴州遵義563003）

目的通過大鼠長期毒性實(shí)驗(yàn)，從臨床前研究角度評價(jià)清胰復(fù)方制劑的臨床用藥安全性。方法將80只SD大鼠分為A組和B組，每組40只，分別用于觀察毒性反應(yīng)、遲發(fā)性毒性反應(yīng)及毒性消失時(shí)間。兩組大鼠均分別再分為空白組（生理鹽水同體積灌胃）及清胰復(fù)方制劑高（81.0 g/kg）、中（27.0 g/kg）、低（13.5 g/kg）劑量組，每組10只。A組大鼠連續(xù)給予藥物及相應(yīng)對照物（生理鹽水），4周后觀察大鼠行為學(xué)變化、體質(zhì)量等常規(guī)指標(biāo)、血常規(guī)及轉(zhuǎn)氨酶等血液學(xué)指標(biāo)及主要器官臟器指數(shù)的變化。B組大鼠連續(xù)給藥4周后停藥2周觀察相關(guān)指標(biāo)（同A組）的變化。結(jié)果給藥4周后，清胰復(fù)方制劑高劑量組（A4組）大鼠各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)顯著變化，臟器指數(shù)明顯升高，體質(zhì)量顯著降低；中劑量組（A3組）大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、血紅蛋白、肝臟臟器指數(shù)顯著變化，與空白組（A1組）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低劑量組（A2組）大鼠除總膽紅素升高外，其他各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化。停藥2周后，高、中、低劑量組（B4、B3、B2組）各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)均無明顯變化，與空白組（B1組）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最低劑量為臨床劑量的5倍，給藥時(shí)間遠(yuǎn)長于臨床給藥時(shí)間，故清胰復(fù)方制劑按現(xiàn)有臨床給藥方案基本安全，但該結(jié)論尚需進(jìn)一步的臨床數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。

中草藥/毒性；復(fù)方合劑；胰腺炎/中藥療法；清胰復(fù)方制劑；大鼠

清胰復(fù)方制劑是遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科制劑室參照相關(guān)文獻(xiàn)［1-2］研制并長期應(yīng)用于臨床的院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，主要由大黃、赤芍、梔子等組成，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院長期應(yīng)用該方治療急性胰腺炎。已有研究證實(shí)，該復(fù)方制劑治療胰腺炎具有顯著療效［3-5］。該方含有大黃等具有明顯消化道不良反應(yīng)的中藥［6］，但其安全性長期未能得到評價(jià)。盡管在現(xiàn)有的治療方案中未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，但是安全性評價(jià)的缺乏對該方進(jìn)一步的二次開發(fā)和臨床劑量及療程調(diào)整造成了阻礙。本研究旨在從對清胰復(fù)方制劑進(jìn)行再開發(fā)的角度，在臨床前對其安全性進(jìn)行研究，并著重于對其長期毒性的評價(jià)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級SD大鼠80只［雌雄各半、體質(zhì)量（250±20）g］購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-1005。

1.1.2藥物與試劑清胰復(fù)方制劑處方組成：大黃（批號：150323）、梔子（批號：150327）、延胡索（批號：150323）、木香（批號：150323）、赤芍（批號：150327）、牡丹皮（批號：150323）、厚樸（批號：150323）、芒硝（批號：150203）由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科中藥房提供。浸膏按文獻(xiàn)［7］的制備工藝制備。給藥溶液制備：將2g/mL的浸膏分別稀釋6倍和3倍制備成中、低劑量，原質(zhì)量濃度作為高劑量。試劑為血常規(guī)檢測試劑（日本希森美康株式會(huì)社）、生化檢測試劑（美國雅培制藥有限公司）、水合氯醛（HG 3-1004-76，天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所）等。

1.1.3儀器ME204E型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、H1650-W型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、101-4A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）、XE5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本希森美康株式會(huì)社）等。

1.2方法將80只SD大鼠分為A組和B組，每組40只，兩組大鼠再分別分為4個(gè)小組，每組10只，雌雄各半。其中A1～A4組用于觀察長期毒性反應(yīng)，B1～B4組用于觀察毒性消失時(shí)間及遲發(fā)性毒性反應(yīng)。兩組大鼠中，1組為空白組（生理鹽水），2～4組分別為清胰復(fù)方制劑低（13.5 g/kg）、中（27.0 g/kg）、高（81.0 g/kg）劑量組。A組大鼠連續(xù)給藥4周，隨時(shí)監(jiān)測行為學(xué)及體質(zhì)量變化，4周后檢測各項(xiàng)血清生化指標(biāo)及臟器指數(shù)等變化；B組大鼠給藥4周后停藥2周，觀察指標(biāo)同A組。各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用水合氯醛（7%，0.5 mL/100g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取心、肝、脾、肺、腎、胰腺等器官，稱質(zhì)量并保存于-80℃冰箱備用。

1.2.1行為學(xué)觀察每天觀察大鼠外觀、行為活動(dòng)、飲食、排泄物、中毒反應(yīng)及死亡情況，并每周稱體質(zhì)量1次。

1.2.2血液學(xué)檢查A組大鼠給藥4周后、B組大鼠給藥4周后停藥2周分別眼眶取血檢查血液生化指標(biāo)［天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）］，腹主動(dòng)脈取血檢查血常規(guī)（白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白）。

1.2.3組織檢查A組大鼠給藥4周后、B組大鼠給藥4周后停藥2周分別對大鼠進(jìn)行解剖，取心、肝、脾、肺、腎和胰腺，肉眼觀察并稱質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果給藥4周后，低、中劑量組（A2、A3組）大鼠毛色光澤，行為正常，而高劑量組（A4組）大鼠則毛色暗淡，行為萎靡。兩組高、中、低劑量組（A4、A3、A2、B4、B3、B2組）大鼠均出現(xiàn)腹瀉并具有劑量依賴關(guān)系。停藥2周后，高、中、低劑量組（B4、B3、B2組）大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果與空白組（B1組）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2清胰復(fù)方制劑對大鼠體質(zhì)量的影響清胰復(fù)方制劑造成大鼠體質(zhì)量連續(xù)降低，并具有劑量依賴關(guān)系。高劑量組（A4組）大鼠從給藥第1周體質(zhì)量即出現(xiàn)降低，至給藥4周，體質(zhì)量顯著降低；中劑量組（A3組）從給藥第2周、低劑量組（A2組）從給藥第3周開始體質(zhì)量顯著降低，與空白組（A1組）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。停藥2周后，高、中、低劑量組（B4、B3、B2組）大鼠體質(zhì)量均無明顯變化，與空白組（B1組）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3清胰復(fù)方制劑對大鼠血常規(guī)及血清生化指標(biāo)的影響

2.3.1清胰復(fù)方制劑對大鼠血常規(guī)的影響給藥4周后，與空白組（A1組）比較，高劑量組（A4組）白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白均顯著升高，中劑量組（A3組）血紅蛋白顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低劑量組（A2組）無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥2周后，高、中、低劑量組（B4、B3、B2組）各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化，與空白組（B1組）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　清胰復(fù)方制劑對大鼠血常規(guī)的影響（±s）

表1　清胰復(fù)方制劑對大鼠血常規(guī)的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05。

給藥4周組別n 白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109L-1）紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（×1012L-1）血紅蛋白（g/L）給藥4周后停藥2周組別n 白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109L-1）紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（×1012L-1）血紅蛋白（g/L）空白組（A1）低劑量組（A2）中劑量組（A3）高劑量組（A4）10 10 10 10 6.01±0.90 7.83±4.01 7.01±1.54 13.65±4.41a7.08±0.95 7.48±0.85 7.46±0.45 8.67±1.14a122.20±10.26 132.89±12.14 142.13±9.83a145.00±14.37a空白組（B1）低劑量組（B2）中劑量組（B3）高劑量組（B4）10 10 10 10 9.17±1.59 7.76±2.58 7.25±3.01 9.29±1.37 8.14±0.48 7.75±0.10 7.84±0.83 8.12±0.92 145.50±6.96 138.50±7.58 148.56±18.64 142.60±7.64

2.3.2清胰復(fù)方制劑對大鼠血清生化指標(biāo)的影響給藥4周后，與空白組（A1組）比較，高劑量組（A4組）ALT、AST、TBIL顯著變化，尤其是TBIL明顯升高；中劑量組（A3組）ALT和TBIL顯著變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組（A2組）除TBIL升高外，ALT、AST均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥2周后，與空白組（B1組）比較，高、中、低劑量組（B4、B3、B2組）ALT、AST、TBIL均無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　清胰復(fù)方制劑對大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

表2　清胰復(fù)方制劑對大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05。

給藥4周組別n給藥4周后停藥2周組別n ALT（U/L）AST（U/L）　TBIL（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）　TBIL（μmol/L）空白組（A1）低劑量組（A2）中劑量組（A3）高劑量組（A4）空白組（B1）低劑量組（B2）中劑量組（B3）高劑量組（B4）10 10 10 10 37.60±6.70 31.20±10.44 31.20±4.47a46.80±3.70a117.80±23.72 111.70±19.23 100.90±22.32 75.60±13.16a1.87±1.20 6.95±2.28a12.00±2.06a21.28±4.94a10 10 10 10 43.70±17.14 36.00±4.07 51.33±35.11 42.40±10.31 130.30±50.11 100.13±17.33 104.44±19.92 118.40±42.41 1.11±0.71 0.66±0.48 1.03±0.77 2.08±1.64

2.4清胰復(fù)方制劑對大鼠臟器指數(shù)的影響給藥4周后，高劑量組（A4組）大鼠心、肝、脾、肺、腎、胰腺等臟器指數(shù)，中劑量組（A3組）大鼠肝臟臟器指數(shù)均高于空白組（A1組），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組（A2組）大鼠各臟器指數(shù)均無明顯變化，與空白組（A1組）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥2周后，高、中、低劑量組（B4、B3、B2組）大鼠心、肝、脾、肺、腎、胰腺等臟器指數(shù)均無明顯變化，與空白組（B1組）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1　A組大鼠主要臟器指數(shù)變化

圖2　B組大鼠主要臟器指數(shù)變化

3　討　論

清胰復(fù)方制劑是具有較長使用歷史的院內(nèi)制劑，其療效得到了臨床的肯定。但其應(yīng)用劑型至今仍然采用湯劑形式服用，使用效率不高，制約了其在臨床的推廣應(yīng)用。因此，迫切需要對其進(jìn)行二次開發(fā)。安全性是新藥研發(fā)的重要關(guān)注點(diǎn)，同時(shí)對臨床安全用藥具有重要指導(dǎo)意義［8］。但迄今為止，有關(guān)清胰復(fù)方制劑的安全性評價(jià)仍鮮見報(bào)道。方中大黃的不良反應(yīng)是本研究尤其關(guān)注的，在處方分析階段即引起研究者的注意。大黃瀉下作用非常顯著［9］，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了單味藥大黃的瀉下作用［10］，復(fù)方是否會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉值得考慮。事實(shí)上，本研究的確觀察到高、中、低劑量組大鼠均存在不同程度腹瀉，尤其在高劑量組，腹瀉非常明顯。這種腹瀉會(huì)擾亂整個(gè)消化系統(tǒng)平衡，并通過各種潛在機(jī)制造成臟器損傷。例如，由膽汁酸介導(dǎo)的整個(gè)消化道循環(huán)可能受到破壞，而膽汁酸紊亂是造成肝損傷的重要誘因［11］，也是臨床上重要的檢測指標(biāo)［12］。因此，膽汁酸介導(dǎo)的清胰復(fù)方制劑的作用及不良反應(yīng)機(jī)制將成為作者未來研究的重點(diǎn)。除此之外，在其余指標(biāo)上，低劑量組大鼠無明顯變化。由于低劑量組已經(jīng)高于臨床用藥的5倍劑量，而且本研究設(shè)置的給藥時(shí)間遠(yuǎn)長于臨床，停藥2周后，B組高、中、低劑量組大鼠各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)均無明顯變化，說明不會(huì)出現(xiàn)藥物積蓄而產(chǎn)生毒性反應(yīng)。因此，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度可以說明清胰復(fù)方制劑基本安全，但仍需進(jìn)一步的臨床數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。

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Long-term toxicity study of Qingyi Compound Preparation on rats*

Lei Lei1，Mao Ruijie2，Wang Wei1，Yao Xiaodong1，He Yuqi1，Zhou Xumei2△（1．Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Department of Clinical Pharmacy，College of Pharmacy，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China）

ObjectiveTo evaluate the safety of clinical medication of Qingyi Compound Preparation from the angle of preclinical study by conducting the rat long term toxicity experiments.Methods80 SD rats were divided into the group A and B for observing the toxicity reaction，delayed toxicity reaction and toxicity disappearance time，40 cases in each group.The two groups were re-divided into the blank group（gavage by same volume of normal saline），Qingyi Compound Preparation high dose （81.0g/kg），middle dose（27.0 g/kg）and low dose（13.5 g/kg）groups，10 cases in each group.The group A was continuously given the medication and corresponding contrast（normal saline）.The behavior change，routine indicators of body mass（BS），blood routine，transaminase and visceral index of main organs were observed after 4 weeks.The group B was continuously given the medication for 4 weeks，after 2-weeks medication withdrawal，the related indicators（same as the group A）were observed.ResultsThe various hematological indicators in the high dose group（A4）were significantly changed，the visceral indexes were obviously increased，while the body mass was significantly decreased；alanine aminotransferase，total bilirubin，Hb，visceral index of liver in the middle dose group（A3）were significantly changed，showing statistical difference compared with the blank group（A1）（P＜0.05）；except the total bilirubin increase，other indicators in the low dose group had no obvious change.The various indicators after 2-week medication withdrawal in the high，middle and low doses groups（B4，B3 and B2）had no obvious changes，compared with the blank group（B1），there was no statistical difference（P＞0.05）.ConclusionThe lowest dose set by the experiments is 5 times of clinical dose，the medication time is much longer than clinical medication time，therefore Qingyi Compound Preparation is basically safe according to present medication regimen，but this conclusion needs to be verified by further clinical data.

Drugs，chinese herbal/toxicity；Drug combinations；Pancreatitis/zhong yao liao fa；Qingyi prescription；Rats

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.004

A

1009-5519（2016）01-0011-03

上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目（2014OP01）；遵義醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（院發(fā)［2014］5802）。

雷蕾（1991-），在讀碩士研究生，主要從事藥物分析研究。

△，E-mail：zmczxm@163.com。

（2015-10-03）