CXCL12對人黑素瘤細胞株M14生物學行為的影響

楊 瑩 倪娜娜 王光平 溫斯健 宋 昊 崔盤根 孫建方

論 著

CXCL12對人黑素瘤細胞株M14生物學行為的影響

楊 瑩 倪娜娜 王光平 溫斯健 宋 昊 崔盤根 孫建方

目的： 明確CXCL12對人黑素瘤細胞株M14體外增殖、遷移、侵襲的影響。方法： 用不同濃度的CXCL12（0、10、50、100、200 ng/mL）刺激或誘導人黑素瘤細胞株M14，CCK8法檢測細胞增殖，Transwell遷移和侵襲試驗檢測細胞遷移和侵襲能力。用100 ng/mL的CXCL12處理人黑素瘤細胞株M14，Western blot法檢測處理后不同時間點（0、5、10、20、30、60 min）的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表達。結果： CXCL12能夠增強人黑素瘤細胞株M14細胞的體外增殖、遷移、侵襲能力，以及促進ERK、AKT信號通路的激活。結論： CXCL12可能與黑素瘤的進展過程相關。

黑色素瘤； CXCL12； 腫瘤細胞生物學行為

趨化因子CXCL12（C-X-C motif chemokine ligand 12，又名stromal cell derived factor-1，SDF-1）是趨化因子受體 CXCR4（C-X-C chemokine receptor type 4）和CXCR7（C-X-C chemokine receptor type 7）的共同配體，其所構成的CXCL12/CXCR4生物軸及CXCL12/CXCR7生物軸近年來被證實在腫瘤的發生、發展尤其是侵襲轉移中發揮重要作用［1］。我們在前期的研究中利用Realtime PCR和Western blot法檢測CXCR4和 CXCR7在人黑素瘤細胞株 A375、M14、 MV3的表達，基于試驗結果，選擇CXCR4和CXCR7表達最高的人黑素瘤細胞株M14作為實驗細胞株。因此，本研究以體外培養的人黑素瘤細胞株M14作為主要實驗研究對象，觀察CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人p-ERK多克隆抗體、鼠抗人ERK單克隆抗體、兔抗人p-AKT多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、鼠抗人Actin單克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology，重組人 CXCL12/SDF-1α購自R&D Systems，CCK8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所，Matrigel購自BD Biosciences。細胞：人黑素瘤細胞株M14由本所研究生饋贈，培養在含10% FBS的DMEM培養基中。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK8法 實驗根據CXCL12的藥物濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）分為5組，同時設置空白對照組。制備細胞懸液，調整細胞濃度為2.5×103個/mL，每孔100 μL接種于96孔培養板中，細胞貼壁后加入10 μL不同濃度的CXCL12，調整藥物終濃度為0、10、50、100、200 ng/mL，第24 h、48 h、72 h分別取出，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續培養1.5 h后，在酶標儀上測定各孔在波長450 nm的OD值，記錄結果。每組設置4個復孔，實驗重復3次。

1.2.2 Transwell遷移及侵襲試驗 實驗根據下室加入的CXCL12藥物濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）分為5組。Transwell遷移與侵襲試驗的區別在于Transwell侵襲試驗小室使用前上室面需要鋪膠，實驗使用的Matrigel按1∶8稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，其余步驟相同。細胞撤血清饑餓16 h，制備細胞懸液，調整細胞密度至5×105個/mL，每上室加入200 μL含1%FBS的無血清培養基重懸后的細胞懸液，下室加入500 μL含不同濃度CXCL12（0、10、50、100、200 ng/mL）的10%FBS的培養基，常規培養24 h后，0.1%結晶紫染色，200×高倍鏡下隨機選取6個視野，拍照計數。實驗重復3次。

1.2.3 Western blot法 按總蛋白提取試劑說明書提取人黑素瘤細胞株M14的總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后，每泳道取等量蛋白60 μg上樣后電泳，先80 V電壓跑上膠30 min，再改用120 V跑下膠90 min，切膠轉膜，封閉，分別加入一抗ERK（1∶500）、p-ERK（1∶500）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶500）后4℃過夜，次日室溫再孵育 30 min后加入熒光二抗（1∶5000 IRDye800CW donkey anti-Rabbit IgG或 1∶5000 IRDye800CW donkey anti-mouse IgG），使用美國LICOR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統顯色成像，保存圖片。

1.2.4 統計學方法 采用GraphPad Prism6.0版軟件進行數據分析，數據以均數±標準差表示，兩組以上數據比較采用方差分析后，差異有統計學意義的再用Boneferroni檢驗對每兩組數據進行比較。檢驗水準均設為α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞增殖能力的影響 不同濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）的CXCL12作用于人黑素瘤細胞株M14細胞24、48、72 h后，利用CCK8法檢測人黑素瘤細胞株M14的細胞增殖能力。結果顯示，10、50、100、200 ng/mL濃度的CXCL12均能刺激人黑素瘤細胞株M14的細胞增殖，且隨著時間的延長，逐漸出現劑量依賴的現象，即藥物濃度越高，促進細胞增殖的能力越強，但第72 h時間點，100 ng/mL與200 ng/mL濃度的組間差異統計學上無明顯意義，除圖中所標示的組（P＞0.05），其余組間差異均具有統計學意義（圖1）。

圖1 不同濃度的CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞增殖能力的影響

2.2 CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞體外遷移及侵襲能力的影響 利用Transwell遷移及侵襲試驗檢測不同濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）的CXCL12誘導后的人黑素瘤細胞株M14的細胞遷移及侵襲能力（圖2、3）。結果顯示，10、50、100、200 ng/mL濃度的CXCL12均能誘導人黑素瘤細胞株M14的細胞遷移能力的增強，且隨著濃度的增加，誘導細胞遷移的能力越強，但100 ng/mL與200 ng/mL濃度的組間差異無統計學意義（P＞0.05），其余組間的差異具有統計學意義；50、100、200 ng/mL濃度的CXCL12均能誘導人黑素瘤細胞株M14的細胞侵襲能力的增強，且隨著濃度的增加，誘導細胞侵襲的能力越強，但10 ng/mL濃度與0 ng/mL濃度的組間差異無統計學意義（P＞0.05），其余組間差異具有統計學意義（圖4）。

2.3 CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞p-ERK、p -AKT表達水平的影響 實驗分為6組，基于CCK8法、Transwell遷移及侵襲試驗的結果，我們選擇以100 ng/mL濃度的CXCL12處理人黑素瘤細胞株M14細胞，利用Western blot法檢測處理后不同時間點（0、5、10、20、30、60 min）的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表達，分別以ERK、AKT的表達量作為對照，計算p-ERK、p-AKT的相對表達量（圖5）。結果顯示，不同時間點的p-ERK、p-AKT的相對表達量在統計學上有明顯差異（P＜0.05）。隨著時間的延長，ERK、AKT的磷酸化增加，從而使得相關的ERK、AKT信號通路過度活化，100 ng/mL的CXCL12可以促進ERK、AKT信號通路的活化。但是，p-ERK的相對表達量在處理后20 min和30 min之間的差異無統計學意義，p-AKT的相對表達量在處理后10 min達到最大值，其后一直保持在高水平，與處理后的20 min、30 min、60 min的相對表達量比較，統計學上無明顯差異（圖6）。

圖2 Transwell遷移（×200）

圖3 Transwell侵襲（×200）

圖4 CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞體外遷移（4a）及侵襲（4b）能力的影響

圖5 利用Western blot法檢測處理后不同時間點（0、5、10、20、30、60 min）的 ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表達 圖6 CXCL12對人黑素瘤細胞株M14細胞p-ERK（6a）、p-AKT（6b）相對表達水平的影響

3 討論

黑素瘤（Melanoma，MM）是惡性程度極高的腫瘤，好發于皮膚，一旦發生轉移，其5年生存率僅有14%［2］。研究表明，趨化因子受體與黑素瘤的進展轉移有密切關系，譬如趨化因子受體CCR7能促進黑素瘤轉移至淋巴結，趨化因子受體CCR10可增強黑素瘤細胞侵襲宿主的能力及促進遠處轉移［3］。

CXCL12是趨化因子受體CXCR4和CXCR7的共同配體，包括SDF-1α和β兩種異構體，屬于趨化因子CXC亞家族。其所構成的CXCL12/CXCR4生物軸及CXCL12/CXCR7生物軸能促進多種腫瘤的進展，被認為有望成為腫瘤靶向治療的新途徑［1］。ERK、AKT信號通路激活參與多種腫瘤的形成及進展，包括在黑素瘤細胞的增殖、存活、侵襲中發揮重要作用［4］。研究發現，趨化因子及其受體通過激活ERK、AKT信號通路從而發揮作用，如 CXCR4/CXCL12生物軸可激活ERK通路并促進前列腺癌的血管生成［5］，CXCR7/CXCL12生物軸也可激活 ERK、AKT通路增強T細胞的增殖及趨化能力［6］。

目前的研究對趨化因子受體CXCR4、CXCR7在黑素瘤進展中的作用存在不同意見，部分研究認為CXCR4在黑素瘤進展中起重要作用［7-10］，少數研究認為促進黑素瘤進展的是CXCR7而不是CXCR4［11］。雖然存在爭議，但是CXCL12作為CXCR4、CXCR7受體的共同配體，其對黑素瘤進展的作用值得我們研究。Mori等［12］研究表明，CXCL12在50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL濃度下均能刺激胰腺癌細胞的遷移與侵襲，但效果最強的濃度是100 ng/ mL。Lechertier等［13］研究表明，CXCL12在10 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL濃度下均能刺激MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移，且隨著CXCL12濃度的升高，遷移能力也增強，這種作用受到其受體CXCR4的調節。Yamada等［14］研究顯示，CXCL12在100 ng/mL濃度下可增強腫瘤內皮細胞的遷移能力，且可激活ERK信號通路。Lee等［15］研究顯示，CXCL12在50 ng/mL、200 ng/mL的濃度下能夠誘導正常人表皮黑素細胞的遷移，50 ng/mL濃度的CXCL12即可激活ERK信號通路。

基于以上文獻，我們設置了CXCL12的5個濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）進行試驗分組。研究結果顯示，10、50、100、200 ng/mL的CXCL12均能增強人黑素瘤細胞株M14細胞的增殖能力、遷移能力，而50、100、200 ng/mL的CXCL12能增強人黑素瘤細胞株M14細胞的侵襲能力，且隨著濃度的增加，其促進細胞增殖、遷移及侵襲的作用更加明顯。但是，第72 h時間點時的100 ng/mL與200 ng/mL的CXCL12對細胞增殖的影響組間差異無統計學意義，且100 ng/ mL與200 ng/mL的CXCL12誘導遷移的細胞數量統計學上無顯著性差異。而且，我們發現100 ng/mL的CXCL12具有促進ERK、AKT信號通路激活的效果。綜合上述試驗結果，CXCL12能夠增強人黑素瘤細胞株M14細胞的體外增殖、遷移、侵襲能力，以及促進ERK、AKT信號通路的激活，提示CXCL12可能與黑素瘤的進展過程相關，為后續研究CXCL12/CXCR4生物軸、CXCL12/CXCR7生物軸在黑素瘤進展中的作用提供了實驗依據。

［1］邱明遠，李健文，鄭民華.CXCR4和CXCR7在腫瘤中的研究進展［J］.中國癌癥雜志，2010，3：222-226.

［2］Miller AJ，Mihm MC.Melanoma［J］.New England Journal of Medicine，2006，355（1）：51-65.

［3］Murakami T，Cardones AR，Hwang ST.Chemokine receptors and melanoma metastasis［J］.J Dermatol Sci，2004，36（2）：71-78.

［4］王麗，栗玉珍.黑素瘤的分子發病機制和靶向治療新進展［J］.中國皮膚性病學雜志，2012，2：164-166.

［5］Wang J，Wang J，Sun Y，et al.Diverse signaling pathways through the SDF-1/CXCR4 chemokine axis in prostate cancer cell lines leads to altered patterns of cytokine secretion and angiogenesis［J］.Cell Signal，2005，17（12）：1578-1592.

［6］Kumar R，Tripathi V，Ahmad M，et al.CXCR7 mediated Gialpha independent activation of ERK and Akt promotes cell survival and chemotaxis in T cells［J］.Cell Immunol，2012，272（2）：230-241.

［7］Andre ND，Silva VA，Watanabe MA，et al.Knockdown of chemokine receptor CXCR4 gene by RNA interference：Effects on the B16-F10 melanoma growth［J］.Oncol Rep，2016.

［8］Robledo MM，Bartolome RA，Longo N，et al.Expression of functional chemokine receptors CXCR3 and CXCR4 on human melanoma cells［J］.J Biol Chem，2001，276（48）：45098 -45105.

［9］Scala S，Giuliano P，Ascierto PA，et al.Human melanoma metastases express functional CXCR4［J］.Clin Cancer Res，2006，12（8）：2427-2433.

［10］Murakami T，Maki W，Cardones AR，et al.Expression of CXC chemokine receptor-4 enhances the pulmonary metastatic potential of murine B16 melanoma cells［J］.Cancer Res，2002，62（24）：7328-7334.

［11］Liedtke D，Erhard I，Abe K，et al.Xmrk-induced melanoma progression is affected by Sdf1 signals through Cxcr7 ［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2014，27（2）：221-233.

［13］Lechertier T，Berard M，Vassy R，et al.Transendothelial migration of two metastatic breast carcinoma cells depend on the SDF-1 alpha-CXCR4 complexes［J］.Anticancer Res，2004，24（6）：4011-4017.

［14］Yamada K，Maishi N，Akiyama K，et al.CXCL12-CXCR7 axis is important for tumor endothelial cell angiogenic property［J］.Int J Cancer，2015，137（12）：2825-2836.

［15］Lee E，Han J，Kim K，et al.CXCR7 mediates SDF1-induced melanocyte migration［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2013，26（1）：58-66.

（收稿：2016-03-09 修回：2016-04-11）

Effects of CXCL12 on the biological behavior of human melanoma M14 cell line

YANG Ying，NI Nana，WANG Guangping，WEN Sijian，SONG Hao，CUI Pangen，SUN Jianfang.
Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China
Corresponding author：SUN Jianfang，E-mail：fangmin5758@aliyun.com

Objective：To investigate the effects of CXCL12 on the biological behavior of human melanoma M14 cell line.Methods：The human melanoma M14 cell line was incubated or induced by different concentrations of CXCL12（0，10，50，100，200 ng/mL）.The Cell Counting Kit-8（CCK8），transwell migration and invasion assay were used to evaluate the proliferation，migration，and invasion of M14 cells.The Western blot was used to detect the protein expression of ERK，p-ERK，AKT，and p-AKT of M14 cells treated with 100 ng/mL CXCL12 at different times（0，5，10，20，30，60 min）.Results：CXCL12 promoted the proliferation，migration and invasion of M14 cells，and the activation of the ERK and AKT signaling pathways. Conclusion：CXCL12 may be associated with the progression of melanoma.

melanoma；CXCL12；tumor cell biological behavior

北京協和醫學院研究生創新基金

（編號：20141002310023005）

國家自然科學基金面上項目（編號：81171513）

2012高等學校博士學科點專項科研基金

（編號：20121106110040）

中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所，南京，210042

孫建方，E-mail：fangmin5758@aliyun.com

［12］Mori T，R，Koizumi M，et al.CXCR4 antagonist inhibits stromal cell-derived factor 1-induced migration and invasion of human pancreatic cancer［J］.Mol Cancer Ther，2004，3（1）：29-37.