人參皂苷Compound K治療糖尿病的機制研究

胡艷粉　趙曉婷　權曉娟　李秀麗　章琳　李領俠

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·論著·

人參皂苷Compound K治療糖尿病的機制研究

胡艷粉趙曉婷權曉娟李秀麗章琳李領俠

目的探討人參皂苷compound K(CK)干預對糖尿病小鼠糖脂代謝的影響及其可能的作用機制。方法36只小鼠按完全隨機法分為正常組，糖尿病組，人參皂苷CK 100、200 mg/kg體重治療組(治療1、2組)，二甲雙胍組，p38MAPK通路激動劑P79350干預組，每組6只。采用高脂飲食聯合腹腔注射鏈脲菌素方法建立小鼠糖尿病模型。制模后各組給予相應藥物灌胃，連續8周。8周后取血檢測空腹血糖、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血清胰島素水平，計算胰島素敏感指數，行糖耐量試驗。采用蛋白質印跡法檢測胰島組織凋亡信號調節激酶1(ASK1)、磷酸化ASK1(p-ASK1)、p38、p-p38蛋白表達，實時PCR法檢測胰島組織ASK1 mRNA表達。結果糖尿病組小鼠空腹血糖、TG、TC、HDL-C、空腹血清胰島素水平及胰島素敏感指數分別為(28.31±3.40)、(1.90±0.28)、(5.00±0.72)、(0.50±0.08)、(9.01±1.70)mmol/L及-6.42±0.76；治療2組小鼠分別為(12.02±1.81)、(0.97±0.09)、(2.90±0.49)、(0.91±0.08)、(15.12±1.93)mmol/L及-4.33±0.46；二甲雙胍組分別為(12.87±2.61)、(1.09±0.11)、(3.08±0.27)、(0.87±0.08)、(14.97±1.27)mmol/L及-4.42±0.35。治療組空腹血糖、TG、TC水平均較糖尿病組顯著下降，而空腹血清胰島素水平和胰島素敏感指數均顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)，治療2組與二甲雙胍組的差異無統計學意義。對照組、糖尿病組、治療2組小鼠胰島組織ASK1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.07、2.52±0.14、1.25±0.08。糖尿病組、治療2組均較對照組顯著上調，差異有統計學意義(P值均<0.01)，而治療2組與糖尿病組差異無統計學意義。對照組、糖尿病組、治療2組小鼠胰島組織ASK1、p38蛋白表達量的差異均無統計學意義，但糖尿病組p-ASK1、p-p38蛋白表達較對照組顯著上調，而治療2組較糖尿病組顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)，而治療2組與對照組的差異無統計學意義。結論人參皂苷CK具有改善糖尿病小鼠脂代謝的作用，其機制可能與抑制ASK1-p38MAPK通路成員的磷酸化有關。

人參皂苷甙類；糖尿病；ASK1-p38-MAPK

糖尿病(diabetic mellitus，DM)是一種由于體內胰島素絕對或相對不足而導致葡萄糖、蛋白質、脂質代謝紊亂的內分泌代謝性疾病[1-2]。目前糖尿病的治療主要以應用胰島素和口服降糖藥為主，但常伴有一些嚴重的不良反應[3]。因此，從天然藥物中尋找和開發安全可靠的天然活性物質對穩定血糖、減少糖尿病并發癥、提高患者生活質量具有重要意義。人參是我國名貴中藥材，素有“百草之王”之美譽。近年來人參在糖尿病預防和治療中的應用受到廣泛關注。人參多糖、人參糖肽以及人參皂苷均被發現有降血糖活性[4-6]。人參皂苷Compound K(CK)作為人參二醇型皂苷的腸內菌代謝產物，被認為是人參皂苷吸收入血、發揮藥效的主要活性物質[7]，但其作用機制尚未明確。本研究應用人參皂苷CK治療糖尿病小鼠，觀察其抗糖尿病活性，探討其作用機制。

材料與方法

一、實驗動物及分組

36只雄性ICR小鼠，清潔級，體重(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于溫度20～25℃，濕度40%～70%的環境。實驗動物符合西安交通大學倫理委員會關于實驗動物福利和倫理學的要求。

ICR小鼠按完全隨機法分為對照組，糖尿病組，人參皂苷CK100、200 mg/kg體重治療組(治療1、2組)，二甲雙胍組，p38MAPK通路激動劑P79350干預組，每組6只小鼠。除對照組外，其余5組均采用高糖高脂飼料(66.5%常規飼料，15%豬油，15%蔗糖，3%膽固醇，1%膽酸鹽，0.6%甲基硫氧嘧啶)喂養2周后禁食12 h，再腹腔注射鏈脲菌素(STZ)40 mg/kg體重方法制備小鼠糖尿病模型[8-9]。注射后繼續給予高脂高糖飲食72 h，再次禁食12 h，眼眶采血測血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L視為造模成功。兩治療組于造模第4天開始分別給予相應劑量的人參皂苷CK(四川維克奇生物科技有限公司)灌胃，連續8周；P79350組在每次給予200 mg/kg體重人參皂苷CK灌胃前30 min通過尾靜脈注射P79350(美國Calbiochem公司)0.2 μg/kg體重；糖尿病組給予等容積生理鹽水灌胃；二甲雙胍組給予50 mg/kg體重二甲雙胍灌胃。

二、空腹血糖、血脂和血清胰島素測定

治療8周后從眼部靜脈叢取血，離心收集血清，測定空腹血糖、空腹血清胰島素、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。所有檢測試劑盒均購自上海復星長征醫學科學有限公司，按試劑盒說明書操作。胰島素敏感指數=1/(空腹血糖×空腹血清胰島素)。

三、口服葡萄糖耐量試驗

治療8周后禁食12 h，從眼部取血收集血清，測血糖含量(0 min)，之后用40%葡萄糖溶液(2 g/kg體重)給小鼠灌胃，灌胃后30、60、90、120 min分別從眼部取血收集血清，測血糖含量。采用近似梯形面積法計算曲線下面積(AUC0～120 min)[10]。

四、胰島組織凋亡信號調節激酶1(ASK1)、磷酸化ASK1(p-ASK1)、p38、p-p38蛋白表達檢測

治療8周后處死小鼠，取胰島組織，研磨、裂解、離心提取胰島組織總蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達，以β-actin為內參。兔抗小鼠ASK1、p-ASK1、p38、p-p38、β-actin多抗均購自Abcam公司，工作濃度均為1∶800，山羊抗兔IgG購自Abcam公司，工作濃度1∶2 000。最后ECL發光，X膠片暗室曝光、顯影。以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

五、胰島組織ASK1 mRNA表達檢測

取200 mg胰島組織，應用Qiagen RNeasy mini試劑盒(Qiagen公司)提取總RNA，High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystems公司)逆轉錄成cDNA，實時定量PCR法檢測ASK1 mRNA表達量。ASK1正義引物5′-CGTGGACTTCTGGATGGATT-3′，反義引物5′-GACCTGGTTGCTCAGGTCTC-3′，擴增產物499 bp；內參β-actin正義引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，反義引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增產物540 bp。引物由深圳華大基因公司合成。PCR反應：94℃ 5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，35個循環。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，應用公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對照基因。

六、統計學處理

結　　果

一、小鼠空腹血糖、血脂、血清胰島素水平及胰島素敏感指數的變化

糖尿病組小鼠的空腹血糖、TG、TC水平均顯著高于對照組，而血HDL-C、空腹血清胰島素水平及素胰島素敏感指數均顯著低于對照組，差異有統計學意義(表1)。兩治療組空腹血糖、TG、TC水平均較糖尿病組顯著下降，而空腹血清胰島素水平和胰島素敏感指數均顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)。治療2組的空腹血糖顯著低于治療1組，而胰島素敏感指數顯著高于治療1組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。P79350組小鼠的空腹血糖、TG、TC水平均顯著高于治療2組，而血HDL-C、空腹血清胰島素水平及素胰島素敏感指數均顯著低于治療2組，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表1)。二甲雙胍組的血糖、血脂、血清胰島素水平及胰島素敏感指數與治療2組的差異均無統計學意義。

表1　各組小鼠血糖、血脂和血清胰島素的變化 ±s)

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與糖尿病組比較,cP<0.05，dP<0.01;與治療2組比較，eP<0.05

二、小鼠糖耐量的變化

對照組血糖在給予葡萄糖30 min時達峰值，隨后逐漸降低，120 min時基本恢復到正常水平；糖尿病組血糖在60 min達峰值，120 min時仍未恢復正常，均顯著高于同時間點對照組，差異有統計學意義(F=59.456，P<0.05，圖1)；兩治療組、二甲雙胍組的血糖在60 min達峰值，但均較同時間點糖尿病組顯著下降，差異有統計學意義(P值均<0.05)，而治療1組與二甲雙胍組的差異無統計學意義，治療2組與二甲雙胍組的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1　各組小鼠的葡萄糖耐量曲線

對照組、糖尿病組、治療1組、治療2組、二甲雙胍組的AUC0～120 min分別為(1 050±57)、(2 951±109)、(1 850±129)、(1 450±137)、(2 151±158)mmol·L-1·min-1，各組間的差異有統計學意義(F=17.052，P=0.009)。其中糖尿病組、治療1組、治療2組、二甲雙胍組均顯著大于對照組，治療2組顯著小于二甲雙胍組，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)，而治療1組與二甲雙胍組的差異無統計學意義。

三、小鼠胰島組織的ASK1 mRNA表達的變化

對照組、糖尿病組、治療1組、治療2組小鼠胰島組織ASK1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.07、2.52±0.14、1.51±0.15、1.25±0.08，各組間差異有統計學意義(F=63.345，P<0.05)。其中糖尿病組、治療1組、治療2組均較對照組顯著上調(P值均<0.01)，治療1組較糖尿病組顯著下調(P<0.05)，治療2組與糖尿病組差異無統計學意義。

四、小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達變化

對照組、糖尿病組、治療1組、治療2組小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白相對表達量見圖2及表2。各組間ASK1、p38蛋白表達量的差異均無統計學意義。糖尿病組p-ASK1與p-p38蛋白表達均較對照組顯著上調，兩治療組又均較糖尿病組顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)。治療1組p-ASK1、p-p38蛋白表達仍顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)，而治療2組與對照組差異無統計學意義。

圖2　對照組(1)、糖尿病組(2)、治療1組(3)、治療2組(4)小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達

糖尿病是以糖代謝紊亂為主要特征的疾病，除高血糖水平外，常伴有脂代謝異常，而高脂血癥的發生又會加劇胰島素抵抗，導致惡性循環。糖尿病患者的TC、TG以及HDL-C升高均可以誘發動脈粥樣硬化的發生和發展[11]。流行病學研究表明，控制糖尿病患者的血糖、血脂異常在臨床上意義重大。本研究結果顯示，糖尿病小鼠制模成功后，小鼠的空腹血糖、TC、TG水平均顯著升高，與前期報道一致[12]。但本研究糖尿病小鼠的HDL-C水平顯著低于對照組，這與李曄[10]、齊密霞等[13]的報道一致。然而，也有研究發現糖尿病小鼠HDL-C水平僅略低于正常對照組，無顯著差異[9,14]。還有研究顯示糖尿病小鼠HDL-C水平顯著高于正常對照組[8,12]。出現這種現象的原因尚不得而知。

人參皂苷CK屬于稀有人參皂苷，由于其獨特的生物活性已經引起了人們的廣泛關注，針對它的科學研究也日益增多，包括糖尿病的治療[15-17]。2012年，李偉[18]報道，人參皂苷CK對2型糖尿病有降血糖作用及肝糖異生的抑制作用。本研究結果顯示，人參皂苷CK可降低糖尿病小鼠血糖、TC、TG水平，增加HDL-C、胰島素水平和胰島素敏感指數，改善糖尿病小鼠的糖耐量，療效與二甲雙胍治療無顯著差異，證實人參皂苷CK對糖尿病有治療作用。

表2　各組小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與糖尿病組比較,cP<0.05，dP<0.01

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號轉導通路是細胞信息傳遞的重要通路，在細胞凋亡、細胞內蛋白質合成與分泌、細胞分化等過程中發揮重要作用[19]。ASK1是p38MAPK通路的上游激酶，參與細胞凋亡過程。在糖尿病方面，p38MAPK與糖、脂代謝密切相關。p38可以磷酸化糖原合酶，部分抑制其活性，進而影響糖原的合成。活化的p38還能活化轉錄輔助激活因子PGC-1α，進而激活糖異生關鍵酶PEPCK和G-6-Pase的轉錄，從而上調糖異生作用，這可能是糖尿病狀態下糖異生作用較強的原因之一[20]。p38MAPK還能通過調控葡萄糖進入肌細胞內所需的葡萄糖轉運載體GLUT-4的表達水平而調節糖代謝[21]。在脂質代謝方面，p38MAPK可以抑制脂質合成，還能通過激活PPAR-α而促進脂質的β氧化[20]。已有研究表明，ASK1-p38MAPK通路參與胰島損傷誘發的糖尿病發生[22]。近期研究又發現ASK1-p38MAPK在糖尿病誘發的腎功能損傷中也發揮重要作用[23]。本研究結果顯示，糖尿病小鼠胰島組織ASK1和p38的磷酸化水平較對照組顯著升高，而人參皂苷CK能夠抑制它們的磷酸化，提示人參皂苷CK能夠阻礙被激活的ASK1-p38MAPK通路。進一步的結果顯示，p38MAPK特異性激動劑P79350能夠減緩人參皂苷CK對糖尿病小鼠血糖和血脂水平的抑制作用，同時增強糖尿病小鼠胰島素敏感指數。因此，人參皂苷CK可能是通過抑制胰島組織ASK1-p38MAPK通路抑制凋亡，維持胰島細胞的數量和功能，增加胰島素分泌量降低空腹血糖，緩解糖尿病癥狀。

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(本文編輯：屠振興)

The mechanism of treatment effect of ginsenoside compound K on diabetic mellitus

HuYanfen,ZhaoXiaoting,QuanXiaojuan,LiXiuli,ZhangLin,LiLingxia.

TheCadre′sWard,SecondAffiliatedHospital,MedicalCollegeofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

Correspondingauthor:LiLingxia,Email: 1633529972@qq.com

ObjectiveTo investigate the treatment effect of ginsenoside compound K (CK) on glucose and lipid metabolism in diabetic mellitus mice and the potential molecular mechanism. MethodsA total of 36 mice were randomly divided into normal group, diabetic mellitus group, CK treatment groups (100 or 200 mg/kg body weight), dimethyldiguanide group and p38MAPK pathway agonist P79350 group, with 6 mice in each group. Diabetic mice were established by intraperitoneal injection of streptozotocin combined with high-fat diet, and CK with different doses was administrated by gastric lavage for consecutive 8 weeks. The levels of fasting blood-glucose, triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL C), fasting serum insulin were measured,and the insulin sensitive index (ISI) was calculated in different treatment groups. Glucose tolerance was detected by oral glucose tolerance test. The protein levels of ASK1, p-ASK1 and p38, p-p38, was detected by Western blot. The mRNA expression of apoptosis signal regulating kinase-1 (ASK1) was detected by real-time quantitative PCR. ResultsThe fasting blood-glucose, TG, TC, HDL C, fasting serum insulin and ISI were (28.31±3.40), (1.90±0.28), (5.00±0.72), (0.50±0.08), (9.01±1.70)mmol/L and -6.42±0.76 in diabetic mice, respectively. The corresponding values were (12.02±1.81), (0.97±0.09), (2.90±0.49), (0.91±0.08), (15.12±1.93)mmol/L and -4.33±0.46 in 200 mg/kg CK treatment diabetic mice, and were (12.87±2.61), (1.09±0.11), (3.08±0.27), (0.87±0.08), (14.97±1.27)mmol/L and -4.42±0.35 in dimethyldiguanide group. All of the fasting blood-glucose, TG and TC in CK treatment groups were significantly lower than those of diabetic mellitus group (P<0.05 or <0.01), but the fasting serum insulin and ISI in CK treatment groups were significantly higher than that of diabetic mellitus group (P<0.05 or <0.01). There were no significant difference between 200 mg/kg CK treatment group and dimethyldiguanide group. The mRNA levels of ASK1 in normal group, diabetic mellitus group and 200 mg/kg CK treatment group were 1.00±0.07, 2.52±0.14 and 1.25±0.08, respectively. The mRNA levels of ASK1 in diabetic mellitus group and 200 mg/kg CK treatment group were significantly up-regulated than that of normal group (P<0.01), but there was no significant difference between 200 mg/kg CK treatment group and diabetic mellitus group in the mRNA levels of ASK1. There was no significant difference in the protein expression levels of ASK1 and p38 among normal group, diabetic mellitus group and 200 mg/kg CK treatment group, but the protein expression levels of p-ASK1 and p-p38 were significant higher in diabetic mellitus group than that in normal group (P<0.05 or <0.01),and were significant lower in 200 mg/kg CK treatment group than that in diabetic mellitus group (P<0.05 or <0.01),and were no significant difference between 200 mg/kg CK treatment group and normal group. ConclusionsGinsenoside CK effectively attenuates diabetic mellitus in mouse model, possibly by inhibiting the phosphorylation of ASK1-p38MAPK signaling pathway.

Ginsenosides;Diabetes mellitus;ASK1-p38-MAPK

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.011

710004西安，西安交通大學第二附屬醫院干部病房三病區

李領俠，Email: 1633529972@qq.com

2015-04-20)