牛源犬新孢子蟲對BABL/c孕鼠胎盤激素和細胞因子調節功能的影響

賈立軍，馬　莉，2，張守發，李男禮，趙　鵬，李積旭

(1.延邊大學農學院動物醫學系，延吉 133000；2.遼寧省凌海市動物疫病預防控制中心，凌海 121200)

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牛源犬新孢子蟲對BABL/c孕鼠胎盤激素和細胞因子調節功能的影響

賈立軍1，馬莉1，2，張守發1，李男禮1，趙鵬1，李積旭1

(1.延邊大學農學院動物醫學系，延吉 133000；2.遼寧省凌海市動物疫病預防控制中心，凌海 121200)

旨在探討牛源犬新孢子蟲對孕鼠胎盤激素和細胞因子調節功能的影響。以牛源犬新孢子蟲BABL/c孕鼠感染模型為研究對象，同時設置正常對照組孕鼠，在攻蟲第12、14、16、18天分批處死孕鼠，采集孕鼠血清，制備孕鼠胎盤細胞懸液，采用ELISA方法對牛源犬新孢子蟲感染孕鼠血清中CRH、CG、PRL及E3等胎盤激素水平，以及孕鼠胎盤細胞懸液中IFN-γ、IL-4及TGF-β等細胞因子水平進行檢測。結果顯示，與正常對照組孕鼠比較，牛源犬新孢子蟲感染孕鼠模型隨攻蟲時間的增加，在孕鼠血清中，CRH水平在第12天時顯著升高(P<0.05)，在第18天時顯著下降(P<0.01)；CG水平在第12天時顯著下降(P<0.01)，在第16天時顯著升高(P<0.05)；PRL水平在第18天時顯著下降(P<0.05)；E3水平在第12天時顯著升高(P<0.05)，第16天時顯著下降(P<0.05)。在孕鼠胎盤細胞懸液中，IFN-γ水平在第18天時顯著升高(P<0.05)；IL-4水平在第12天時顯著升高(P<0.05)；TGF-β水平在第12天時顯著升高(P<0.05)。結果表明牛源犬新孢子蟲感染導致孕鼠胎盤激素和細胞因子的調節功能失衡，嚴重影響胎盤血流、胎盤物質轉運及胎兒生長發育，將導致不良妊娠的發生。

犬新孢子蟲；BABL/c孕鼠；胎盤；激素；細胞因子

犬新孢子蟲(Neosporacaninum)是寄生于牛、羊、犬等多種哺乳動物細胞內的一種原蟲。犬新孢子蟲主要引起母畜流產、死胎或新生兒運動障礙和神經系統疾病[1-3]。新孢子蟲病可垂直傳播，對牛的危害極為嚴重，已成為危害養牛業健康發展的主要因素之一[4-7]。M.P.Reichel等統計顯示，全球每年因犬新孢子蟲感染或流產所造成的經濟損失最高達23.8億美元[8]。目前，國內外對犬新孢子蟲的研究雖然取得了一定進展，但犬新孢子蟲引起孕畜流產、死胎的致病作用還不明確，尤其是犬新孢子蟲對胎盤的損傷作用尚不清楚。胎盤是母體妊娠期的多功能器官，在母體與胎兒之間起著非常重要的作用，承擔著母胎之間的氣體交換、營養供應、新陳代謝及疾病防御等功能[9-10]。胎盤分泌的激素和細胞因子在妊娠期中的作用極其重要。胎盤分泌多種激素類物質，以此維持母體的正常妊娠、胎盤和胎兒生長發育及母胎之間物質轉運等[11-13]；胎盤分泌的細胞因子一方面可以促進胎盤生長，另一方面又可以抑制胎盤生長[14]。胎盤功能失調必將影響胎兒的正常發育和健康生長。因此，作者以牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型為研究對象，對影響胎盤物質轉運、胎盤血流及胎兒生長發育的激素和細胞因子等水平進行檢測，以期為犬新孢子蟲致病作用的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要試劑和蟲株

組織DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA Marker、ExTaq酶等均購自寶生物工程大連有限公司；CRH、CG、PRL、E3等胎盤激素檢測試劑盒，IFN-γ、IL-4、TGF-β等細胞因子檢測試劑盒均購自美國ADI公司；其他常規試劑為進口或國產分析純產品。牛源犬新孢子蟲延邊株由延邊大學預防獸醫學實驗室分離、保存[15]；Vero細胞由延邊大學預防獸醫學實驗室培養、保存。

1.2實驗動物分組與處理

BALB/c小鼠購自延邊大學實驗動物中心，隨機選取8周齡、雌性、體重20 g左右BALB/c小鼠80只。分為牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型組，同時設立正常孕鼠對照組，每組40只。于攻蟲第12、14、16、18天分批處死孕鼠，每批10只，采集孕鼠血液，分離血清；同時分離胎鼠胎盤，制備胎盤組織細胞懸液。

1.3孕鼠血清中胎盤激素水平檢測

按不同時間將模型組和對照組收集的孕鼠血清樣本，分別按照CRH、CG、PRL及E3試劑盒說明進行檢測。根據標準品的濃度及對應的OD值，繪制標準曲線的直線回歸方程，再根據檢測樣品的OD值計算對應樣品的濃度。

1.4孕鼠胎盤細胞懸液中細胞因子水平檢測

按不同天數將模型組和對照組制備的孕鼠胎盤細胞懸液，分別按照IFN-γ、IL-4及TGF-β試劑盒說明進行檢測。根據標準品的濃度及對應的OD值，繪制標準曲線的直線回歸方程，再根據檢測樣品的OD值計算對應樣品的濃度。

1.5數據統計

2　結　果

2.1牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型胎盤中蟲體DNA檢測

BALB/c小鼠接種牛源犬新孢子蟲速殖子后，孕鼠先后出現被毛逆立、共濟失調等臨床癥狀，接種蟲體第12、14、16、18天時，在胎盤組織中均檢測到了犬新孢子蟲Nc5基因684bp目的條帶(圖1)，經測序與GenBank中(AF061249)相似性為100%。經對染蟲孕鼠的整體評估，確定孕鼠感染模型符合試驗標準。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.Nc5基因陽性對照；2.接種蟲體第12天；3.接種蟲體第14天；4.接種蟲體第16天；5.接種蟲體第18天；6.PCR水對照M.DL2000 DNA molecular weight marker；1.Positive control of Nc5 gene；2.The 12th day after infection；3.The 14th day after infection；4.The 16th day after infection；5.The 18th day after infection；6.Negative control圖1　接種蟲體不同天數孕鼠胎盤Nc5基因檢測結果Fig.1　Nc5 gene was measured in placenta of pregnant mice after indicated days after infection

2.2影響胎盤血流指標CRH的檢測

影響胎盤血流指標的CRH檢測結果表明，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組孕鼠CRH濃度持續上調，而模型組孕鼠CRH濃度持續下調，二者變化方向相反。模型組與對照組比較，在第12天時，孕鼠血清中CRH水平差異顯著(P<0.05)，在第18天時CRH水平差異極顯著(P<0.01)(表1)。

2.3影響胎盤物質轉運指標CG、PRL、E3的檢測

影響胎盤物質轉運指標CG檢測結果表明，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組孕鼠CG濃度先下調再上調，而模型組孕鼠CG濃度持續上調。模型組與對照組比較，在第12天時孕鼠血清中CG水平差異極顯著(P<0.01)；在第16天時孕鼠血清中CG水平差異顯著(P<0.05)(表2)。

ng·mL-1

與對照組相比較，*.表示差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。下表同

Compared with control，*.Significant difference(P<0.05)；**.Significant difference(P<0.01).The same as below

ng·mL-1

影響胎盤物質轉運指標PRL檢測結果表明，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組和模型組孕鼠PRL水平均出現先下調后上調現象，但模型組PRL整體水平較對照組低。模型組與對照組比較，在第18天時孕鼠血清中PRL水平差異顯著(P<0.05)(表3)。

ng·mL-1

影響胎盤物質轉運指標E3檢測結果表明，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組和模型組孕鼠E3水平均呈現上下波動變化，但模型組孕鼠E3水平波動變化明顯。模型組與對照組比較，在第12、16天時孕鼠血清中E3水平差異顯著(P<0.05)(表4)。

pg·dL-1

2.4孕鼠胎盤細胞懸液中IFN-γ濃度變化

通過對IFN-γ檢測結果顯示，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組和模型組孕鼠IFN-γ水平均出現先上調后下調現象，但模型組孕鼠IFN-γ整體水平高于對照組。模型組與對照組比較，在第18天時孕鼠胎盤細胞懸液中IFN-γ水平差異顯著(P<0.05)(表5)。

ng·L-1

2.5孕鼠胎盤細胞懸液中IL-4濃度變化

通過對IL-4檢測結果顯示，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組孕鼠IL-4水平處于平衡狀態，而模型組孕鼠IL-4濃度先下調后上調，且模型組孕鼠IL-4整體水平高于對照組。模型組與對照組比較，在第12天時孕鼠胎盤細胞懸液中IL-4水平差異顯著(P<0.05)(表6)。

pg·mL-1

2.6孕鼠胎盤細胞懸液中TGF-β濃度變化

通過對TGF-β檢測結果顯示，隨孕期或攻蟲時間的增加，對照組孕鼠TGF-β水平先上調后下調，而模型組孕鼠TGF-β水平持續上調。模型組與對照組比較，在第12天時孕鼠胎盤細胞懸液中TGF-β水平差異顯著(P<0.05)(表7)。

pg·mL-1

3　討　論

胎盤是妊娠期一個暫時的多功能器官，在妊娠期間胎盤分泌激素的作用極為重要。CRH、CG、PRL、E3等均為胎盤分泌的激素，胎盤激素的合成與釋放，直接影響著母體妊娠、胎兒生長發育、母胎之間的物質轉運、胎盤細胞的增殖分化等。促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)是肽類激素，妊娠期間胎盤合成CRH可作用于妊娠期子宮，產生重要的旁分泌和自分泌功能，有利于妊娠期的免疫耐受和保護胚泡植入。CRH重要的生理功能是擴張胎盤血管，對保障母體與胎兒之間的血流灌注、胎兒新陳代謝、緩解胎兒缺氧應激等方面具有生理性代償的保護作用。本試驗結果顯示，隨攻蟲時間的增加模型組孕鼠CRH濃度持續下調，與對照組變化方向相反，在第18天時CRH水平與對照組差異極顯著(P<0.01)。可能是由于牛源犬新孢子蟲入侵胎盤細胞后，隨著蟲體入侵時間的延長，造成胎盤細胞損傷愈加嚴重，提示胎兒在此階段可能出現缺血缺氧狀態，期間可能損傷血管細胞和胎盤細胞。

絨毛膜促性腺激素(CG)是由胎盤滋養層細胞分泌的糖蛋白類激素，妊娠期間在血漿和尿液中含量較高；CG可調節類前列腺素和固醇激素的合成，CG還具有免疫抑制作用；血漿中CG含量變化可預測和診斷妊娠高血壓綜合征、流產、胎兒缺氧、胎兒宮內發育遲緩等多種妊娠不良結局[16-17]。胎盤催乳素(PRL)是由胎盤合體滋養細胞合成釋放的蛋白激素，PRL可促進胎盤細胞的分化增殖、胎兒的營養物質代謝和能量代謝等；若胎盤催乳素分泌異常，可導致不良妊娠。妊娠期血清中雌三醇(E3)主要由胎盤合成，妊娠期間，雌三醇在母體血漿中的含量變化能反應胎兒與胎盤功能，雌三醇含量減少，可導致胎兒畸形或胎兒宮內發育遲緩等癥狀。

CG、PRL、E3均是影響胎盤物質轉運功能的重要激素。本試驗中模型組孕鼠隨攻蟲時間的增加，與對照組比較，模型組孕鼠CG濃度持續上調，在第12天時CG水平差異極顯著(P<0.01)，在第16天時CG水平差異顯著(P<0.05)，提示CG濃度的持續上調，極可能導致孕鼠發生流產、死胎、胎兒宮內發育遲緩現象的發生。模型組孕鼠PRL水平先下調后上調，與對照組比較，整體水平顯著降低，在第18天時PRL水平差異顯著(P<0.05)，提示蟲體入侵造成胎盤病理性損傷，導致胎盤功能減退，嚴重影響胎兒的能量代謝和對營養物質的攝取，可能導致胎兒在宮內出現營養不良或發育遲緩等現象。模型組孕鼠E3水平波動變化明顯，與對照組比較，在第12、16天時E3水平差異顯著(P<0.05)，提示產前E3含量顯著變化，可導致胎兒畸形或胎兒宮內發育遲緩等現象。

細胞因子與妊娠之間有著密切的關系，正常妊娠情況下，胎盤分泌IFN-γ、IL-4及TGF-β等多種細胞因子。A.Rosbottom等研究表明，細胞因子在犬新孢子蟲感染過程中具有一定作用，可能與胎兒的死亡有關[11]；I.C.López-Pérez等研究表明，在犬新孢子蟲感染的孕鼠脾中IFN-γ、IL-10的增加和孕鼠胎盤中IL-4的表達，可能提高犬新孢子蟲經胎盤傳播給胎兒的概率[18]；S.Almería等研究證實，在犬新孢子蟲感染母畜的胎盤組織中，細胞因子IFN-γ表達上調和TGF-β的表達下調有利于胎兒存活，表明細胞因子對犬新孢子蟲的胎盤傳播具有重要作用[19]。本試驗中模型組孕鼠隨攻蟲時間的增加，在孕鼠胎盤細胞懸液中，IFN-γ和IL-4整體水平均顯著高于對照組，這可能是導致犬新孢子蟲垂直傳播的主要因素；而模型組TGF-β水平持續上調，將不利于胎兒存活，可能是導致流產、死胎的重要因素。

4　結　論

牛源犬新孢子蟲感染孕鼠后，胎盤激素CRH水平的持續下調，將影響母體與胎兒之間的血流灌注，導致胎兒出現缺血缺氧狀態；胎盤激素CG、PRL及E3調解功能失衡，是胎盤組織病理損傷和滋養層細胞凋亡增加的病理生理基礎，將導致不良妊娠的發生；細胞因子IFN-γ、IL-4及TGF-β水平上調，將提高蟲體垂直傳播的概率，嚴重影響胎兒正常生長發育。

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(編輯白永平)

Imbalance of Placental Hormones and Cytokines Regulation in Pregnant BALB/c Mice Infected by BovineNeosporacaninum

JIA Li-jun1，MA Li1，2，ZHANG Shou-fa1，LI Nan-li1，ZHAO Peng1，LI Ji-xu1

(1.DepartmentofVeterinaryMedicine，AgriculturecollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China；2.Animaldiseasepreventionandcontrolcenter，Linghai121200，China)

To invest the affection on regulating function of pregnant BALB/c mice placental hormones and cytokines caused by bovineNeosporacaninum，in present study，we established the pregnant BALB/c mice model infected with bovineNeosporacaninum，and pregnant BALB/c mice non-infected as negative control group.For collecting serum，mice of each group were sacrificed on the 12th，14th，16th，18th day after infection.The placental hormones CRH，CG，PRL and E3 in serum，and cytokines IFN-γ，IL-4 and TGF-β in placental cell suspension from pregnant mice were detected using ELISA method.Compared with control group，the results showed that CRH levels in pregnant BALB/c mice serum was significantly increased (P<0.05) on the 12th day and decreased significantly (P<0.01) on the 18th day after infection；while GC levels was decreased significantly (P<0.01) on the 12th day and increased significantly (P<0.05) on the 16th day；PRL levels was decreased significantly (P<0.05) on the 18th day；E3 levels was significantly increased (P<0.05) on the 12th day and decreased significantly (P<0.05) on the 16th day.At the same time，IFN-γ levels in pregnant BALB/c mice placental cell suspension was increased significantly (P<0.05) on the 18th day；while IL-4 and TGF-β levels were both increased significantly (P<0.05) on the 12th day.These results indicated that infection by bovineNeosporacaninumin pregnant mice would lead to imbalance of placental hormones and cytokines regulative function and seriously affect placental blood flow，placenta mass transport，fetal growth and development.All these will lead to adverse pregnancy outcomes.

bovineNeosporacaninum；pregnant BALB/c mice；placenta；hormone；cytokines

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.021

2016-03-25

賈立軍(1978-)，男，吉林鎮賚人，副教授，博士，主要從事分子免疫學研究，E-mail：ljjia@ybu.edu.cn

S852.723

A

0366-6964(2016)08-1689-07

資金項目：國家自然科學基金(31160501；31360605)；吉林省重點科技攻關項目(20140204078NY)；吉林省教育廳重點項目(吉教科合字[2015]第 1 號)；吉林省自然科學基金(20160101201JC)