貴州省鴨源新城疫病毒強毒株的遺傳變異分析及致病性研究

段志強，許厚強，嵇辛勤，陳　強，胡　炎，胡順林，劉秀梵*

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；3.揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室，揚州 225009)

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貴州省鴨源新城疫病毒強毒株的遺傳變異分析及致病性研究

段志強1，2，許厚強1，2，嵇辛勤1，2，陳強1，胡炎1，胡順林3，劉秀梵3*

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；3.揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室，揚州 225009)

為了科學理解家鴨在新城疫病毒(NDV)流行和傳播中的作用，對貴州不同地區分離的5株鴨源NDV強毒株進行遺傳變異分析以及對鴨和SPF雞的致病性研究。結果顯示：5株NDV分離株均屬于基因Ⅶd亞型，其F蛋白裂解位點基序均為112RRQKRF117，符合強毒株序列特征，與病毒致病性指數測定結果相符；F和HN蛋白中功能性氨基酸位點均高度保守，但在HN蛋白線性表位區有3株發生E347K突變。交叉血凝抑制試驗發現分離株與傳統疫苗株LaSota的抗原同源性較低(為83.3%～87.0%)，而與新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性較高(為93.5%～100%)。將5株NDV分離株以0.5 mL病毒尿囊液原液通過肌肉注射感染鴨后未見明顯發病死亡和病理變化，并且除脾外在其他多個組織臟器未能檢測到病毒復制；而以106.0ELD50·0.1 mL-1劑量通過滴鼻點眼感染SPF雞后6 d內100%發病死亡，病死雞表現出新城疫典型的臨床癥狀和病理變化，病毒在多個組織臟器中均能復制且對脾、胸腺和法氏囊等免疫器官損傷嚴重。另外，SPF雞攻毒后喉頭和泄殖腔棉拭病毒分離率明顯高于試驗鴨。本研究結果表明，貴州省鴨群中流行的基因Ⅶd亞型NDV強毒株HN蛋白發生E347K突變的變異株呈上升趨勢，并與傳統疫苗株產生抗原差異；5株鴨源NDV強毒株對鴨和雞致病性差異顯著，雖然對鴨無明顯致病性，但鴨感染后可在較長時間內通過喉頭或泄殖腔向體外排毒，因此必須采取有效措施防止NDV強毒由鴨群向雞群的傳播。

新城疫病毒；基因Ⅶd亞型；遺傳變異；致病性

新城疫(Newcastle disease，ND)是由禽副黏病毒Ⅰ型新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染禽類所引起的一種急性、高度傳染性疾病，是目前危害世界養禽業的重要疫病之一，給多國養禽業造成了巨大的經濟損失[1]。ND自1926年被確認以來，經過世界范圍內的四次大流行，其宿主范圍明顯擴大，迄今能自然或人工感染的禽類已超過250余種。水禽被認為是NDV的天然儲存宿主，ClassⅠ中的基因1型和ClassⅡ中的基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型和Ⅸ型NDV均可從水禽中分離到[2]。過去一般認為水禽對NDV強毒株抵抗力強，即使感染也不會引起發病和暴發或流行。然而自1997年以來，國內多個省份均有水禽(主要是鵝)感染NDV發病死亡的報道，并呈擴大流行趨勢[3]。對我國NDV分子流行病學研究結果顯示，感染并導致水禽發病死亡的主要是基因Ⅶ型和Ⅸ型NDV，其中又以基因Ⅶ型NDV強毒株占絕對優勢[4-6]。值得注意的是，雖然有些基因Ⅶ型NDV毒株對家鴨的致病力不強，但是人工感染鵝或雞后卻能造成嚴重的發病和死亡[7-8]。因此，要高度警惕家鴨攜帶的NDV強毒向雞群或鵝群傳播而對養殖業造成的嚴重威脅和損失，有必要加強對家鴨NDV的監測力度。

三穗麻鴨是我國四大蛋系麻鴨之一，同時也是貴州省地方優良畜禽品種。近年來，三穗麻鴨產業已成為貴州省特色優勢產業，但隨著其規模化養殖的快速發展同樣導致了多種傳染病的發生。為了解當前NDV強毒株在三穗麻鴨中的流行和遺傳變異情況及其致病性，作者實驗室從2014年6月至2015年12月對貴州省不同地區的三穗麻鴨進行NDV監測，分離得到5株NDV強毒株。作者進行了病毒的遺傳變異分析和針對鴨和SPF雞的致病性研究，以期對更好地理解家鴨在NDV流行和傳播中的作用，以及為ND的科學防控提供理論依據。

1　材料與方法

1.1病毒

鴨源NDV分離株Duck/China/Guizhou/SS1/2014(SS1)、Duck/China/Guizhou/ZY/2014(ZY)、Duck/China/Guizhou/SS2/2015(SS2)、Duck/China/Guizhou/TZ/2015(TZ)、Duck/China/Guizhou/JH/2015(JH)系從貴州不同地區病死三穗麻鴨臟器或健康鴨泄殖腔棉拭子中分離，用NDV、禽流感H5和H9亞型標準陽性血清進行病毒鑒定。NDV分離株經蝕斑純化3次后用9～11日齡SPF雞胚進行病毒擴增，收集陽性雞胚尿囊液用于病毒的序列測定、生物學特性鑒定以及動物試驗。

1.2試驗鴨、SPF雞胚和SPF雞

7日齡三穗麻鴨購自貴州三穗縣興綠洲農業發展有限公司，飼養至15日齡(經ND抗體檢測陰性)進行攻毒。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；SPF雞由SPF雞胚自行孵化并于潔凈動物房中飼養至30日齡用于攻毒試驗。

1.3主要試劑

RNA提取試劑TRIzol Reagent、AMV反轉錄酶、高保真TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶和pCR2.1克隆載體購自Invitrogen公司；DNA Gel Extraction Kit和質粒小提試劑盒購自AxyGEN公司；6 nt隨機引物、瓊脂糖、DNA Marker購自上海生物工程有限公司。

1.4病毒的生物學特性測定

根據文獻方法[9]，測定分離株的最小致死雞胚量致死雞胚平均時間(MDT)、1日齡雛雞腦內致病指數(ICPI)、6周齡雞翅靜脈接種致病指數(IVPI)和雞胚半數致死量(ELD50)。

1.5引物合成、病毒RNA抽提及RT-PCR擴增

病毒F和HN基因擴增引物序列見參考文獻[10]，由上海生物工程有限公司合成。按照TRIzol試劑說明書提取病毒RNA，用6 nt隨機引物進行反轉錄，然后用F和HN基因特異性引物進行PCR擴增。膠回收PCR產物，經過T-A克隆后，將鑒定的陽性質粒送上海Invitrogen公司測序。每個樣品送3份陽性質粒。

1.6病毒F和HN序列分析

運用Lasergen 7.1軟件對測序基因片段進行拼接，應用Clustal X1.83和MEGA 6.0對F和HN基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列與從GenBank下載的NDV代表性毒株序列進行比對分析，并根據F基因高變區47-420 nt序列構建系統進化發生樹。

1.7病毒與疫苗株LaSota株和A-Ⅶ株的抗原性差異

將5株病毒分離株制備的疫苗以及LaSota和A-Ⅶ滅活疫苗(青島易邦生物工程有限公司)分別免疫4周齡SPF雞，制備單因子血清。參照文獻方法[11]將上述7種NDV抗原和陽性血清進行交叉血凝抑制(HI)試驗，試驗重復3次，取3次平均值。毒株間的抗原相似系數用R來評價，公式：R=(r1×r2)1/2×100%，其中r1=異源血清效價1/同源血清效價1，r2=異源血清效價2/同源血清效價2。

1.8病毒對鴨和SPF雞的致病性試驗

1.8.1試驗動物分組與設計將60只15日齡試驗鴨隨機分成6組(A1～A6)，每組10只；60只30日齡SPF雞隨機分成6組(B1～B6)，每組10只。A1～A5組用0.5 mL病毒尿囊液原液(SS1、ZY、SS2、TZ和JH株)以腿部肌肉注射途徑進行攻毒，B1～B5組用106.0ELD50·0.1 mL-1病毒尿囊液稀釋液以滴鼻點眼方式進行攻毒。A6和B6組為對照組，分別用0.5 mL和0.1 mL無菌PBS進行肌注和滴鼻點眼。試驗動物分組情況見表1。

表1試驗動物分組設計

Table 1Grouping design of experimental animals

組別Group毒株Strain試驗動物Experimentalanimal日齡Age/day數量/只Number攻毒方式Inoculationroute攻毒劑量DoseA1SS1鴨1510肌肉注射5×108.38ELD50·0.5mL-1A2ZY鴨1510肌肉注射5×108.63ELD50·0.5mL-1A3SS2鴨1510肌肉注射5×108.34ELD50·0.5mL-1A4TZ鴨1510肌肉注射5×108.79ELD50·0.5mL-1A5JH鴨1510肌肉注射5×108.17ELD50·0.5mL-1A6*鴨1510肌肉注射0.5mLB1SS1SPF雞3010滴鼻點眼106.0ELD50·0.1mL-1B2ZYSPF雞3010滴鼻點眼106.0ELD50·0.1mL-1B3SS2SPF雞3010滴鼻點眼106.0ELD50·0.1mL-1B4TZSPF雞3010滴鼻點眼106.0ELD50·0.1mL-1B5JHSPF雞3010滴鼻點眼106.0ELD50·0.1mL-1B6*SPF雞3010滴鼻點眼0.1mL

* 表示試驗所用溶液為無菌PBS

* indidicate sterile PBS was used in the experiment to replace virus

1.8.2試驗鴨、雞攻毒后臨床癥狀和病理變化觀察攻毒后每天觀察并記錄各組試驗鴨和雞的精神狀態、采食變化、糞便顏色和發病死亡等情況。對病死鴨和雞進行解剖，觀察其組織臟器的病理變化情況。

1.8.3試驗鴨和雞喉頭、泄殖腔排毒及抗體檢測攻毒后第3、5、7和14天分別采集各組試驗鴨和雞的喉頭及泄殖腔棉拭，經過處理后接種10日齡SPF雞胚分離病毒，檢測喉頭和泄殖腔的排毒情況。另外，對攻毒后第7和14天存活的試驗鴨和雞于翅靜脈采血，分離血清，用于NDV抗體滴度檢測。

1.8.4試驗鴨和雞組織器官中病毒分布檢測攻毒后第3天分別剖殺A1～A5和B1～B5組試驗鴨或雞，每組2只，無菌采取腦、心、肝、脾、肺、氣管、腎、胸腺、胰腺、法氏囊、腺胃和十二指腸等12種組織，于-80 ℃保存。通過接種雞胚分離病毒檢測試驗鴨和雞組織器官中的病毒分布情況。

1.8.5試驗鴨和雞免疫器官病理組織學觀察攻毒后第3天對剖殺的各組試驗鴨和雞采集脾、胸腺和法氏囊，用10%中性福爾馬林溶液固定，將固定的組織樣品進行脫水、石蠟包埋后制備病理切片，經過常規HE染色后觀察其病理組織學變化。

2　結　果

2.15株病毒分離株的生物學特性測定

收集24 h以后死亡雞胚尿囊液進行HA測定，分離的病毒均有血凝性；血凝抑制試驗結果顯示5株病毒與NDV標準陽性血清反應均為陽性，而與禽流感H5和H9亞型陽性血清反應均為陰性，說明5株分離株均為NDV。生物學特性測定結果顯示，5株NDV分離株的MDT均小于60 h，ICPI均大于1.6，IVPI均大于1(表2)。根據國際獸疫局(OIE)的NDV毒力判定標準，5株病毒分離株均為強毒株。

[3] 吳擁政,何 杰,司林坡,等.義馬礦區深部礦井地應力分布規律研究[J].煤炭科學技術,2018,46(10):16-21.

表2本研究中5株NDV試驗毒株信息和生物學特性

Table 2Background information of 5 NDV isolates used in this study

毒株Strain來源Source地點Place時間Year生物學特性BiologicalcharacteristicsMDTICPIIVPIELD50·mL-1HASS1病死鴨脾三穗縣201452h1.892.80108.388log2ZY健康鴨泄殖腔鎮遠縣201446h1.922.62108.636log2SS2健康鴨泄殖腔三穗縣201548.8h1.882.74108.347log2TZ健康鴨泄殖腔天柱縣201550h1.782.55108.798log2JH健康鴨泄殖腔劍河縣201552h1.722.74108.177log2

2.2F基因序列同源性及遺傳進化分析

對5株NDV分離株F基因編碼的氨基酸序列分析發現，F蛋白裂解位點氨基酸序列均為112RRQKRF117(表3)，符合NDV強毒株特征，與測定的病毒生物學特征相符。5株分離株F蛋白氨基酸序列相似性為97.8%～99.5%，其中SS1株與ZY株、SS2株與JH株相似性最高，均為99.5%，說明分離株之間親緣關系較近。將分離株與國內外NDV參考株F蛋白氨基酸序列進行相似性比較分析發現：分離株與疫苗株LaSota及國內經典強毒株F48E8的相似性較低，分別為87.7%～88.4%和90.6%～91.9%；而與國內基因Ⅶ型NDV流行株的相似性較高，為96.7%～99.3%。對F蛋白功能區氨基酸位點分析發現，5株分離株F蛋白中的6個潛在糖基化位點和12個半胱氨酸殘基均高度保守[12]；7個中和抗原位點均與當前流行的基因Ⅶ型NDV參考株以及疫苗株LaSota相同，未出現變異。根據F基因高變區(47—420 nt)核苷酸序列進一步繪制遺傳進化樹，結果顯示5株NDV分離株與基因Ⅶd亞型NDV參考株GM、SD09、NA-1、ZJ1等處于同一分支(圖1)，表明目前在三穗麻鴨中流行的NDV強毒為基因Ⅶd亞型NDV。

2.3HN基因編碼的氨基酸序列分析

5株NDV分離株HN基因開放閱讀框長度為1 716 bp，編碼571個氨基酸，其HN蛋白氨基酸序列相似性為97.2%～99.3%，與疫苗株LaSota的相似性較低(為87.4%～88.5%)，而與基因Ⅶd亞型NDV參考株的相似性較高(為96.0%～99.1%)。對分離株HN蛋白氨基酸序列分析發現，HN蛋白中的13個半胱氨酸殘基和13個唾液酸受體結合位點完全保守；4個糖基化位點(119、341、433和481位)也完全保守；HN蛋白上5個受體結合相關區域(193—201、345—353、494、513—521和569位)，僅在線性表位區345—353位氨基酸區域發生變化，其中5株NDV分離株中有3株在347位氨基酸發生了E347K的突變(表3)。

表35株NDV分離株及部分參考株F和HN基因的具體信息

Table 3TheFandHNgenes of NDV strains used in this study

毒株Strain基因型Genotype分離時間YearofisolationF基因登錄號AccessionnumberofFgeneHN基因登錄號AccessionnumberofHNgeneF蛋白裂解位點CleavagesiteofFproteinHN蛋白線性表位(345-353)Linearepitope(residues345-353)ofHNproteinSS1Ⅶd2014KP742770KP742770RRQKRFPDEQDYQIRZYⅦd2014KU933948KU933952RRQKRFPDKQDYQIRSS2Ⅶd2015KU933949KU933953RRQKRFPDKQDYQIRTZⅦd2015KU933950KU933954RRQKRFPDKQDYQIRJHⅦd2015KU933951KU933955RRQKRFPDEQDYQIRLaSotaⅡ1946DQ195265AY510092GRQGRLPDEQDYQIRF48E8Ⅸ1948GQ168924AY636144RRQRRFPDEQDYQIRNA-1Ⅶd1999DQ659677DQ659677RRQKRFPDEQDYQIRZJ1Ⅶd2000AF431744AF431744RRQKRFPDEQDYQIRGMⅦd2001FJ608343FJ608361RRQKRFPDKQDYQIRGuangxi11Ⅶd2003DQ485231DQ485231RRQKRFPDEQDYQIRJS-5-05-GoⅦd2005JN631747JN631747RRQKRFPDEQDYQIRSF02Ⅶd2006DQ363535DQ234582RRQKRFPDEQDYQIRXZ-9-08-ChⅦd2008GQ245812GQ245867RRQKRFPDKQDYQIRSD09Ⅶd2011HQ317395HQ317395RRQKRFPDEQDYQIR

圖1　根據NDV F基因47-420位核苷酸繪制的系統進化發生樹Fig.1　Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the NDV F gene fragments (47-420 nt)

2.4病毒與疫苗株抗原差異檢測

交叉HI試驗結果顯示，LaSota株抗血清與分離株的交叉HI效價比LaSota HI效價低1.3～2.7個滴度，A-Ⅶ株抗血清與分離株的交叉HI效價比A-Ⅶ HI效價低0.5～1.0個滴度，而分離株之間的交叉HI效價比分離株HI效價低0.3～1.5個滴度(表4)。抗原相似性計算結果表明，分離株之間的抗原同源性為91.2%～96.8%，分離株與疫苗株LaSota的抗原同源性較低(為83.3%～87.0%)，而與新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性較高(為93.5%～100%)；疫苗株LaSota與A-Ⅶ之間的抗原同源性為84.9%(表5)。以上結果表明目前流行的基因Ⅶd亞型NDV毒株與傳統疫苗株LaSota在抗原性上存在較大差異。

表4不同NDV毒株交叉血凝抑制結果

Table 4The cross hemagglutination inhibition test among different NDV strains

毒株Strain抗血清HI效價(log2)Antibodytiter(log2)SS1ZYSS2TZJHLaSotaA-ⅦSS19.08.07.08.38.07.510.0ZY7.58.08.08.36.58.59.5SS28.77.58.07.37.58.310.0TZ8.07.07.78.06.78.79.3JH8.07.06.57.07.07.310.0LaSota8.57.08.08.07.010.09.0A-Ⅶ9.08.07.08.07.08.010.0

表5不同NDV毒株間的抗原同源性Table 5The antigen homology among different NDV strains

%

2.5試驗鴨和雞攻毒后臨床癥狀和病理變化

試驗鴨各攻毒組(A1～A5)和對照組(A6組)鴨的食欲、精神狀況、糞便顏色等均正常，在攻毒后的14 d內未發現明顯的發病和死亡，剖檢后也沒有明顯的病理變化。

SPF雞各攻毒組(B1～B5)大多數雞于第2天開始表現出食欲減退、精神沉郁、排綠色稀糞、兩腳麻痹，口角有水樣黏液流出；第3天開始發生死亡；第5—6天攻毒組所有的雞全部死亡，死亡率為100%。剖檢發現病死雞的喉頭氣管、腺胃乳頭和十二指腸出血，腎腫大，脾淤血腫大并伴有壞死灶(圖略)。對照組(B6組)SPF雞食欲和精神等均正常。

2.6試驗鴨和雞喉頭、泄殖腔排毒及抗體檢測

A1～A5組試驗鴨以肌肉注射攻毒后喉頭、泄殖腔棉拭檢測結果顯示：A2和A4組試驗鴨在第3、5、7和14天喉頭和泄殖腔棉拭病毒檢出率均明顯高于A1、A3和A5組，其中僅A4組試驗鴨在第14天喉頭棉拭病毒檢測為陽性，A1、A3和A5組試驗鴨在14 d內泄殖腔棉拭病毒檢測均為陰性。對照組(A6組)試驗鴨喉頭和泄殖腔病毒檢測均為陰性(表6)。

B1～B5組SPF雞以滴鼻點眼方式攻毒后，各攻毒組雞在6 d內100%死亡。從第3天開始B1～B5組雞喉頭、泄殖腔棉拭病毒檢測均為陽性，且B1和B4組第5天存活雞的喉頭、泄殖腔病毒分離仍為陽性。對照組(B6組)SPF雞喉頭、泄殖腔病毒檢測為陰性(表6)。

5組試驗鴨攻毒后的第7和14天，每組隨機取5只采血進行NDV抗體檢測，結果表明：5組試驗鴨在攻毒后的第7和14天均可檢測到NDV抗體，其中以A2組鴨在第7天的抗體滴度最高，為7.5 log2；各組試驗鴨NDV抗體在第14天比第7天均有所下降(表6)，這與以往的報道結果相一致[8，13-14]。

2.7試驗鴨和雞組織器官中病毒分布檢測

攻毒后第3天分別剖殺A1～A6和B1～B6組試驗鴨和SPF雞，采集腦、心、肝、脾、肺、腎、氣管、腺胃、胸腺、胰腺、法氏囊和十二指腸等12種組織進行病毒檢測，結果顯示：A1～A5組試驗鴨在脾中均可檢測到病毒，僅A2組鴨在氣管中檢測到病毒，而其他各組鴨的多個組織器官中病毒檢測均為陰性；B1～B5組攻毒后的SPF雞組織器官病毒檢測發現，在各組雞的多個組織器官均能檢測到病毒，僅B1和B4組雞的肝組織中未檢測到病毒(表7)。A6和B6正常對照組試驗鴨和SPF雞各組織器官病毒檢測均為陰性。

2.8試驗鴨和雞免疫器官病理組織切片觀察

攻毒后第3天剖殺A2和A6組試驗鴨，對采集的脾、胸腺和法氏囊組織制備病理切片，觀察結果顯示：攻毒組鴨的脾有輕微出血，胸腺和法氏囊無病理組織學變化；正常對照組(A6組)鴨的脾、胸腺、法氏囊病理組織學觀察均表現正常(圖2)。

攻毒后第3天 B2組SPF雞免疫器官組織病理學觀察結果顯示：雞脾有多個壞死灶和顯著的淋巴細胞減少；胸腺中有明顯的壞死、組織增生以及淋巴細胞減少，胸腺小體結構被破壞；法氏囊中有大面積的壞死、濾泡髓質區淋巴細胞明顯減少。正常對照組(B6組)SPF雞的免疫器官病理組織學觀察正常(圖3)。

3　討　論

自20世紀90年代以來，亞洲和非洲的許多國家和地區一直處于由基因Ⅶ型NDV毒株所引起的第4次大流行之中，給養禽業造成了巨大的經濟損失[15]。對我國不同省份的NDV分子流行病學調查研究表明，基因Ⅶd亞型NDV是造成我國家禽ND暴發與流行的主要因素和主要優勢流行毒株[4-6]。本研究從貴州省不同地區病死或健康三穗麻鴨中分離得到5株基因Ⅶd亞型NDV強毒株，對病毒囊膜表面糖蛋白F和HN序列分析發現，分離株F和HN蛋白中重要的功能性氨基酸位點均高度保守，未發生變異。有研究表明，HN蛋白上的線性表位區(345—353位氨基酸)是一個重要的受體結合區域，其中347位氨基酸多數為E[16]，但是2005年以后的研究發現NDV由E→K的變異株在逐年增加。2007年S.H.Cho等[17]首先報道了這種基因Ⅶd亞型NDV變異株的存在，并且這類變異株已成為韓國當前的主要流行毒株。2008年姚春峰等[18]對國內分離的15株基因Ⅶd亞型NDV進行了遺傳變異分析，發現15株NDV中有3株發生了E347K的突變；而2009年吳雙等[19]從16株NDV中發現了5株E347K突變的毒株。我們對貴州省近兩年分離的5株NDV分析發現其中有3株NDV發生了E347K的突變，說明此類變異株在我國呈增多的趨勢。這可能與當前ND疫苗大規模、高劑量的頻繁使用有關，應該引起相關研究者的關注和深入研究。

目前普遍認為ND疫苗株與當前流行株之間的基因型和抗原性差異是引起禽群免疫失敗的主要原因。國內外研究結果顯示：傳統疫苗株LaSota雖然對不同基因型的NDV強毒流行株能產生完全的臨床保護，但是并不能防止流行株在免疫禽群中的感染復制和排毒[20-21]；只有當疫苗株與流行株的基因型一致時，不僅能提供理想的臨床保護，還能顯著降低免疫禽群的強毒感染率和排毒量[22]。本研究分離的5株NDV強毒株與傳統疫苗株LaSota的F和HN蛋白相似性均較低，分別為87.7%～88.4%和87.4%～88.5%。同時，交叉HI試驗也顯示5株分離株與疫苗株LaSota之間的抗原同源性僅為83.3%～87.0%，而與新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性達93.5%～100%，表明目前貴州省NDV流行株與傳統疫苗株在抗原性上存在較大差異，而與新型疫苗株的抗原性差異小。因此，使用新型ND疫苗對控制我國當前ND的發生和流行具有較大的優勢[23]。

a.A2組脾出血；b.A2組胸腺無明顯病變；c.A2組法氏囊無明顯病變；d.A6組脾正常；e.A6組胸腺正常；f.A6組法氏囊正常a.Hemorrhage in the spleen of A2 group；b.No obvious thymus lesions in the A2 group；c.No obvious bursa lesions in the A2 group；d.Normal spleen in the A6 group；e.Normal thymus in the A6 group；f.Normal bursa in the A6 group圖2　試驗鴨免疫器官組織病理學觀察(200×)Fig.2　Histopathology on immune organs from infected ducks (200×)

a.B2組脾壞死、淋巴細胞減少；b.B2組胸腺壞死、組織增生、淋巴細胞減少以及胸腺小體被破壞；c.B2組法氏囊壞死、濾泡髓質區淋巴細胞減少；d.B6組脾正常；e.B6組胸腺正常；f.B6組法氏囊正常a.Necrosis and decrease of lymphocytes in the spleen of B2 group；b.Necrosis，hyperblastosis，decrease of lymphocytes and destruction of thymic corpuscle in the thymus of B2 group；c.Necrosis and decrease of follicular medulla area lymphocytes in the bursa of B2 group；d.Normal spleen in the B6 group；e.Normal thymus in the B6 group；f.Normal bursa in the B6 group圖3　試驗雞免疫器官組織病理學觀察(200×) Fig.3　Histopathology on immune organs from infected chickens (200×)

有研究表明，相比鴨群而言，基因Ⅶd亞型NDV在雞群和鵝群中具有更強的生存優勢[23]，表現為對雞和鵝具有高度致病性，而對鴨的致病性較低。本研究將NDV分離株分別以0.5 mL病毒尿囊液原液通過肌肉注射途徑感染試驗鴨，在攻毒后的14 d內鴨均無明顯的臨床癥狀，組織臟器病理學變化也不明顯，并且除脾外其他多個組織未能檢測到病毒復制，表明鴨對這5株基因Ⅶd亞型NDV強毒株抵抗力較強，這與國內外相關研究結果一致[8，13-14]。然而劉梅等[24]和Y.Dai等[25]同樣用基因Ⅶd亞型NDV強毒株通過腿部肌肉注射0.2 mL病毒尿囊液原液感染15日齡麻鴨后4～6 d試驗鴨100%發病死亡，這可能與試驗所用的毒株和試驗鴨品種有關。此外，SPF雞的攻毒試驗結果表明，以106.0ELD50·0.1mL-1劑量經滴鼻點眼感染SPF雞后6 d內100%發病死亡，病死雞表現出ND典型的臨床癥狀和病理變化，病毒在多個組織臟器中均能復制且對脾、胸腺和法氏囊等免疫器官損傷嚴重。這與“基因Ⅶd亞型NDV可引起家禽免疫器官更為嚴重的組織病理損傷”報道結果一致[26]。排毒試驗檢測結果發現，攻毒后第3天試驗雞100%通過喉頭和泄殖腔同時排毒，而試驗鴨中僅個別鴨可在較長時間內通過喉頭或泄殖腔排毒，說明NDV強毒在雞體內的復制與增殖效率明顯高于鴨，這是NDV強毒對雞和鴨致病性存在差異的一個重要因素。此外，研究發現鴨和雞在先天性免疫基因方面存在差異[27-28]，鴨的先天性免疫應答在抵抗病毒早期感染中發揮重要作用[29]，這可能是兩者致病性存在差異的又一重要因素。

近年來，隨著水禽養殖規模的不斷增長，目前我國水禽飼養量和肉產量均占世界總量的75%以上。ND疫苗免疫是我國目前控制雞群和鵝群NDV感染的主要措施，但是對于鴨群是否有必要進行ND疫苗免疫尚存在爭議。根據國內外相關研究結果和本研究結果來看，基因Ⅶd亞型NDV強毒株對麻鴨無明顯的致病性，因此不必對貴州省三穗麻鴨群進行廣泛的疫苗免疫接種。但值得注意的是，雖然麻鴨感染NDV強毒株后不表現臨床癥狀，但在一定時間內感染鴨可通過喉頭或泄殖腔向環境中排毒，有造成其他禽群接觸感染的危險。因此，針對我國養殖地區家禽養殖密度高、不同禽群接觸頻率高的現狀，在家禽和水禽養殖密集區域，必須制定有效合理的ND疫苗免疫接種程序以避免NDV在水禽和家禽之間的相互傳播。

4　結　論

貴州省三穗麻鴨群中主要流行基因Ⅶd亞型NDV強毒株，病毒的HN蛋白發生E347K突變呈上升趨勢，并與傳統疫苗株產生較大的抗原差異。5株鴨源NDV分離株對SPF雞致病性強，而對麻鴨無明顯致病性，但鴨感染后可在較長時間內通過喉頭或泄殖腔排毒。

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(編輯白永平)

Genetic Variation and Pathogenicity Analysis of Virulent Newcastle Disease Viruses Isolated from Ducks in Guizhou Province

DUAN Zhi-qiang1，2，XU Hou-qiang1，2，JI Xin-qin1，2，CHEN Qiang1，HU Yan1，HU Shun-lin3，LIU Xiu-fan3*

(1.CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；3.KeyLaboratoryofAnimalInfectiousDiseasesofMinistryofAgriculture，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

To better evaluate the role of domestic ducks in the epidemiology and transmission of NDV，five virulent NDV strains isolated from ducks in Guizhou Province were used to study their genetic variation and pathogenicity in ducks and SPF chickens.Sequence analysis showed that all the strains belonged to subgenotype Ⅶd NDV and had the velogenic motif112RRQKRF117in the cleavage sites of F protein，which was consistent with the results of biological tests.The functional amino acid sites in the F and HN proteins were all highly conserved，but three strains with E347K mutation were detected in the linear epitope of HN protein.Cross hemagglutination inhibition test revealed that the antigen homology of the isolates between LaSota and A-Ⅶ were 83.3%-87.0% and 93.5%-100%，respectively.In the challenge test，ducks of different groups challenged with virus allantoic fluid intramuscularly at the dose of 0.5 mL showed no obvious clinical symptoms and histopathologic changes，and viruses could not be detected in multiple tissues except for the spleen.On the contrary，SPF chickens infected with NDV strains intranasally at a dose of 106.0ELD50·0.1 mL-1died in 6 days and showed typical clinical symptoms.Viruses could replicate in multiple tissues and cause severe damages to spleen，thymus and bursa in chickens.In addition，viruses were detected more frequently in the laryngeal and cloacal swabs of chickens than ducks.These results showed that subgenotype Ⅶd NDV strains with E347K mutation on HN protein significantly increased and had the antigenic differences with traditional vaccine strain.Although all the NDV strains were virulent in chickens whereas had no obvious pathogenicity in ducks，some measures should be taken to prevent virus transmission from ducks to chickens as viruses were detected in swabs of virulent NDV infected ducks for a long time.

Newcastle disease virus；subgenotype Ⅶd；genetic variation；pathogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.013

2016-03-23

國家自然科學基金項目(31502074)；教育部“促進與美大地區科研合作與高層次人才培養項目”(教外司美[2014]2029號)；貴州省省校合作計劃項目(黔科合LH字[2014]7669號)；公益性行業(農業)科研專項(201303033)

段志強(1985-)，男，湖北襄陽人，講師，博士，主要從事家禽重要疫病發病機制和免疫機制方面的研究，E-mail: zqduan@gzu.edu.cn

劉秀梵，Tel: 0514-87991416；E-mail: xfliu@yzu.edu.cn

S852.659.5；S855.3

A

0366-6964(2016)08-1623-12