染料木素的抗誘變性檢測

鄒思穎　張立實.四川省疾病預防控制中心，四川成都　6004；.四川大學華西公共衛生學院，四川成都　6004

染料木素的抗誘變性檢測

鄒思穎1張立實2
1.四川省疾病預防控制中心，四川成都610041；2.四川大學華西公共衛生學院，四川成都610041

目的 評價染料木素的抗誘變性。方法 培養L5178Y細胞，根據不同的處理方法進行分組，陽性誘變組［染料木素0.078、0.156、0.312、0.625μg/mL 4種劑量分別聯合甲基磺酸甲酯（MMS）5μg/mL或絲裂霉素C（MMC）0.5μg/mL］、陽性誘變對照組（MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL）、溶劑對照組（0.5%二甲基亞砜）、陰性對照組（純水）以及抗誘變陽性對照組（維生素C 100μg/mL+MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL）。通過L5178Y小鼠淋巴瘤細胞實驗微孔板法，采用前處理（染料木素先處理細胞3 h，然后MMS或MMC處理3 h）、同時處理（染料木素與MMS或MMC同時處理細胞3 h）和后處理（MMS或MMC先處理細胞3 h，然后染料木素處理3 h）3種處理方式，測定染料木素各劑量組tk位點突變頻率，評價染料木素對MMS或MMC誘變性的拮抗作用。 結果 在染料木素抗誘變性檢測中，在前處理和后處理條件下，染料木素各劑量組tk位點總突變頻率顯著低于MMS或MMC陽性誘變對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；在同時處理條件下，染料木素0.312、0.625μg/mL劑量組tk位點總突變頻率顯著低于MMS或MMC陽性誘變對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。結論 在3種處理方式下，染料木素能有效地抑制MMS和MMC的誘變作用，以前處理方式的抑制作用最強，有良好的開發利用前景。［關鍵詞］染料木素；小鼠淋巴瘤細胞實驗；抗誘變性；L5178Y細胞

染料木素是一種從大豆種子中發現的重要營養成分，屬于黃酮類植物雌激素，黃酮類植物雌激素是一類具有苯環與色酮環基本結構的化合物。目前研究已發現黃酮類植物雌激素具有多種生理活性作用，對激素依賴性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等有防治作用，同時還具有抗氧化、抗輻射和免疫調節等作用［1-2］。通過流行病學和動物模型研究也發現，染料木素與一系列潛在的有益健康的生理作用有關，其中包括防治乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和絕經后疾病等［3-5］。

小鼠淋巴瘤細胞實驗是一種用于初篩誘變劑和致癌物質的體外實驗［6］。目前常用于檢測化合物抗誘變性的實驗有Ames實驗、彗星實驗、微核試驗、HPRT基因突變實驗、染色體畸變實驗等，由于這些實驗一般僅能檢測到單一的遺傳毒性效應，故通常需要一組實驗以全面評價受試物的遺傳毒性。小鼠淋巴瘤細胞實驗不僅可以檢測出點突變、小缺失、重組等小范圍的基因突變，還能檢測出包括tk位點在內的大的缺失、染色體畸變等大范圍的損傷，因此將小鼠淋巴瘤細胞實驗用于誘變性檢測具有高靈敏性、檢測范圍廣等優點。目前關于小鼠淋巴瘤細胞實驗用于化學物的抗誘變性評價，除本實驗室已做過一些相關工作外，其他的研究報道尚不多見。本研究利用小鼠淋巴瘤細胞實驗檢測染料木素的抗誘變性，一方面為其開發和利用提供安全性依據，另一方面也可為將小鼠淋巴瘤細胞試驗應用于抗誘變性檢測累積更多的資料。

1　材料與方法

1.1細胞系

L5178Y 3.7.2C tk+/-細胞，由日本國立研究所本間正充提供。

1.2細胞培養

使用含10%馬血清，200μg/mL丙酮酸鈉，100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液培養，培養于37℃，5%二氧化碳（CO2）培養箱中。

1.3受試物

染料木素購于成都市藥品生物制品研究所，使用時用二甲基亞砜（DMSO）將其溶解成不同濃度溶液。

1.4染料木素的抗誘變性檢測

1.4.1試劑 甲基磺酸甲酯（MMS）、絲裂霉素C（MMC）、RPMI 1640培養基、馬血清、三氟胸苷（TFT）、丙酮酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）、次黃嘌呤、甘氨酸、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷、維生素C（VitC）均購于Sigma公司。

1.4.2劑量設計預實驗中，利用MMC作為誘變劑，采用同時處理方式（MMC與染料木素同時作用L5178Y細胞3 h）確定實驗劑量。當染料木素為0.625μg/mL時，相對懸浮生長率（RSG）較小，為45%～48%，表現出明顯細胞毒性。因為考慮在多數情況下，RSG＞RS，上述處理情況下的RS可能在10%～20%的理想范圍內，因此染料木素正式試驗的劑量定為0.078、0.156、0.312、0.625μg/mL（陽性誘變組），另外再設一個陽性誘變對照組（MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL）、溶劑對照組（0.5%DMSO）和陰性對照組（純水）以及抗誘變陽性對照組（VitC 100μg/mL+MMS 5μg/mL或MMC0.5μg/mL）。

1.4.3清除自發突變參照文獻［7］進行。

1.4.4受試物處理細胞 將L5178Y細胞調至2×105個/mL，每瓶10mL。在抗誘變實驗中，采用前處理、同時處理和后處理3種處理方式，按1%加入不同濃度受試物（染料木素）和MMS或MMC。前處理時，先加入受試物處理3 h再加入MMS或MMC處理3 h；同時處理時，受試物和MMS或MMC同時處理細胞3 h；后處理時，先加入MMS或MMC處理3 h再加入受試物處理細胞3 h。處理結束后，1000 r/min離心10min，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，重新懸浮細胞于含10%馬血清的RPMI 1640培養液中，并調整細胞密度到2×105個/mL。

1.4.5平板接種效率測定將上述細胞梯度稀釋至8個/mL，按每孔0.2 mL接種96孔培養板，每一劑量接種1塊平板。于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養14 d后，計數每塊培養板有集落生長的孔數，計算第0天的平板接種效率（PE0）。“1.4.4”中剩余細胞繼續培養2 d，每天計數并維持細胞密度在1×106個/mL以下。表達培養結束后，按上述PE0方法測定培養2 d的平板接種效率（PE2）。

1.4.6表達培養將“1.4.4”中的剩余細胞調整細胞密度為2×105個/mL，表達培養2 d，同時每隔24 h計數1次，并調整細胞密度為2×105個/mL，計算相對懸浮生長率（RSG）。

1.4.7總突變頻率（TMF）測定取經表達培養2 d的細胞，將細胞密度調整為1×104個/mL，按1%加入100× TFT，使其終濃度為3μg/mL，然后將細胞懸液加到96孔板中，每孔加200μL，即每孔有2000個細胞。每個劑量組做2個平行平板，在5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養12 d后，肉眼計數每塊平板的集落生長孔數。

1.4.8計算方法PE0和PE2（第0天、第2天平板效率）、RS（相對存活率）、RSG、RTG（相對總生長率）、TMF等計算方法和結果判定標準參照文獻［8］。

1.5統計學方法

在英國環境誘變劑學會指南推薦的Mutant（tm）軟件中，使用Dunnett t檢驗對TMF進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

MMS作為誘變劑時，染料木素各劑量組RS、RSG 和RTG高于陽性誘變對照組（MMS 5μg/mL），表明在本實驗條件下，染料木素可抑制MMS的細胞毒性作用。在前處理條件下，染料木素各劑量組與陽性誘變對照組比較，TMF降低，差異均有高度統計學意義（P＜0.01），同時染料木素各劑量組TMF低于抗誘變陽性對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在同時處理條件下，染料木素僅有0.312μg/mL G+MMS組、0.625μg/mL G+MMS組與陽性誘變對照組比較TMF降低，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。在后處理條件下，染料木素各劑量組與陽性誘變對照組比較TMF降低，差異均有高度統計學意義（P＜0.01），同時染料木素0.312、0.625μg/mL劑量組TMF低于抗誘變陽性對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。表明在3種處理條件下染料木素均能抑制MMS的誘變作用。見表1～3。

MMC作為誘變劑時，染料木素各劑量組RS、RSG 和RTG高于陽性誘變對照組（MMC 0.5μg/mL），表明在本實驗條件下，染料木素可拮抗MMC的細胞毒性作用。在前處理條件下，染料木素各劑量組與陽性誘變對照組比較TMF降低，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在同時處理條件下，染料木素中僅有0.312μg/mL G+MMS組、0.625μg/mL G+MMS組與陽性誘變對照組比較TMF降低，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。在后處理條件下，染料木素各劑量組與陽性誘變對照組比較TMF降低，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。表明在3種處理條件下染料木素均能削弱MMC的誘變作用。見表4～6。

表1　染料木素前處理時對MMS誘變性的影響

表2　染料木素同時處理時對MMS誘變性的影響

表3　染料木素后處理時對MMS誘變性的影響

表4　染料木素前處理時對MMC誘變性的影響

表5　染料木素同時處理時對MMC誘變性的影響

3　討論

在本研究中，MMS和MMC這兩種具有不同遺傳毒性機制的誘變劑被用來研究染料木素對不同類型遺傳突變的抗突變作用。MMS是一種直接烷化劑，主要甲基化嘌呤堿基的氮原子，導致堿基不穩定，最終導致染色體重排或重組［9-11］。MMC是一種雙功能烷化劑和交聯劑，能與脫氧鳥苷堿基形成加合物，誘導產生姐妹染色單體交換和染色體畸變［12-13］。本課題研究結果表明，在本研究條件下染料木素能夠降低MMS 和MMC誘導的TMF，并且有劑量效應關系，這表明染料木素具有較強的抗誘變作用。現在已有的研究報道也表明染料木素具有抗誘變性。2001年Yang等［14］利用大腸桿菌回復突變系統研究染料木素的抗誘變作用發現，染料木素有效地抵抗了N-ethyl-N-nitrosourea （ENU）導致的誘變作用，特別是減少了顛換突變。2009年Pugalendhi等［15］發現染料木素在體內試驗中能夠降低DMBA導致的微核和染色體畸變。

本課題檢測染料木素的抗誘變性時使用了前處理、同時處理和后處理3種方式。前處理和后處理實驗結果為陽性時，可認為受試物屬于生物抗誘變劑，而同時處理實驗結果為陽性時，則可認為受試物屬于去誘變劑［16］。結果表明，在3種處理方式下，染料木素均能有效地降低tk位點的TMF，而染料木素在前處理條件下抗誘變作用最強，這可能是因為染料木素預孵細胞后可以增強其某些具有清除自由基功能的酶的功能有關。

本課題利用小鼠淋巴瘤細胞實驗評價染料木素的抗誘變性作用。實驗結果表明，在3種處理條件下，染料木素（0.078～0.625μg/mL）能拮抗MMS和MMC的誘變性且前處理的抗誘變作用較強，提示可能是因為受試物預孵細胞后可增強其某些具有清除自由基功能的酶功能，對細胞氧化損傷的抑制作用可能是其對MMS和MMC誘變性的拮抗作用的機制之一。

表6　染料木素后處理時對MMC誘變性的影響

［1］Pavese JM，Farmer RL，Bergan RC.Inhibition of cancer cell invasion and metastasis by genistein［J］.Cancer Metastasis Rev，2010，29（3）：465-482.

［2］Barnes S.The biochemistry，chemistry and physiology of the isoflavones in soybeans and their food products［J］. Lymphatic Research and Biology，2010，8（1）：89-98.

［3］Carbonel AA，CalióML，Santos MA，etal.Soybean isoflavones attenuate the expression of genes related to endometrial cancer risk［J］.Climacteric，2015，18（3）：389-398.

［4］HwangKA，ChoiKC.Anticarcinogenic effects of dietary phytoestrogens and their chemopreventive mechanisms［J］. Nutrition and Cancer，2015，67（5）：796-780.

［5］Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al.Genistein and cancer：current status，challenges，and future directions［J］.Advances in nutrition（Bethesda，Md.），2015，6（4）：408-419.

［6］Klaassen CD，AdmurMO.Casarett&Doull's toxicology［M］.北京：人民衛生出版社，2002：321-329.

［7］Lloyd M，Kidd D.Themouse lymphoma assay［J］.Methods in Molecular Biology，2012，817：35-54.

［8］食品安全國家標準體外哺乳類細胞TK基因突變試驗（GB15193.20-2014）［S］.北京：中國標準出版社，2015：123-127.

［9］王怡凈，張立實.用tk基因突變試驗評價長春新堿和秋水仙堿的遺傳毒性［J］.衛生研究，2006，35（2）：179-181.

［10］WyattMD，Pittman DL.Methylatingagents and DNA repair responses：methylated bases and sources of strand breaks［J］. Chemical Research in Toxicology，2006，19（12）：1580-1594.

［11］Grzesiuk E.The role of mutation frequency decline and SOS repair systems in methyl methanesulfonate mutagenesis［J］.Acta Biochimica Polonica，1998，45（2）：523.

［12］Latt SA.Sister chromatid exchanges，indices of human chromosome damage and repair：detection by fluorescence and induction by mitomycin C［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1974，71（8）：3162-3166.

［13］Tomasz M，Lipman R，Chowdary D，et al.Isolation and structure of a covalent cross-link adduct between mitomycin C and DNA［J］.Science，1987，235（4793）：1204-1208.

［14］Yang YD，Fix D.Reduction of ENU-induced transversion mutations by the isoflavone genistein in Escherichia coli［J］.Mutat Res，2001，479（1-2）：63-70.

［15］PugalendhiP，Manoharan S，Panjamurthy K，et al.Antigenotoxic effect of genistein against 7，12-dimethylbenz［a］anthracene induced genotoxicity in bone marrow cells of female Wistar rats［J］.Pharmacol Rep，2009，61（2）：296-303.

［16］Kada T，Shimoi K.Desmutagens and bio-antimutagens-their modes of action［J］.Bioessays，1987，7（3）：113-116.

Detection of antimutagenic effect of Genistein

ZOU Siying1ZHANG Lishi2

1.Sichuan Center for Disease Control and Prevention，Sichuan Province，Chengdu610041，China；2.West China School of Public Health，Sichuan University，Sichuan Province，Chengdu610041，China

Objective To evaluate the antimutagenic effect of Genistein.Methods L5178Y cells were cultivated，and grouped according to the different processing methods，the L5178Y cells were respectively exposed to the Genistein concentrations of 0.078，0.156，0.312，0.625μg/mL with 5μg/mL methyl methanesulfonate（MMS）or 0.5μg/mL mitomycin C（MMC）（positive mutation group），5μg/mL MMS or 0.5μg/mL MMC（positive mutation control group），0.5% DMSO（solvent control group），water（negative control group），5μg/mLMMS or 0.5μg/mLMMC and 100μg/mL VitC+ 5μg/mLMMSor 0.5μg/mLMMC（anti mutagenesis positive control group）.The antimutagenic effect of genistein were determined by the mouse lymphoma Assay in L5178Y cells，in the evaluation of antimutagenic effect three kinds of treatment（pre-treatment，silmutaneous-treatment and post-treatment）were used to detect the antimutagenic effects of Genistein and puerarin against gene mutations induced by MMS and MMC.Determination of mutant frequency of tk locus（TFT）was performed according to the microcell method.Results In pre-treatment and post-treatment，at all the tested concentrations the total mutation frequencies were lower than the MMS or MMC positive mutation control group the differences were statistically significant（P＜0.01）.In simultaneous treatment，the total mutation frequencies at concentrations of 0.312，0.625μg/mL were lower than MMSand MMC positive mutation control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion Under the three kinds of treatment，Genistein shows a good role for preventing TK gene mutation induced by MMS or MMC，pre-treatment has the strongest inhibitory effect，had a good application and development prospect.

Genistein；Mouse lymphoma Assay；Antimutagenicity；L5178Y cell

R394.6

A

1673-7210（2016）01（c）-0044-04

2015-09-23本文編輯：任念）

鄒思穎（1983-），女，博士研究生；研究方向：食品毒理與遺傳毒理學。

張立實（1956-），男，教授；研究方向：營養與食品衛生學、毒理學。