肺癌組織中m iRNAs的表達及其與Oct4、K lf4的關系

朱　捷　徐　馳　楊鯨蓉　曾志勇▲.南京軍區福州總醫院心胸外科，福建福州　35000；2.第二軍醫大學研究生院，上海　200433

肺癌組織中m iRNAs的表達及其與Oct4、K lf4的關系

朱捷1，2徐馳1楊鯨蓉1曾志勇1▲
1.南京軍區福州總醫院心胸外科，福建福州350001；2.第二軍醫大學研究生院，上海200433

目的 研究肺癌組織中miRNAs的表達及其與Oct4、Kruppel樣因子 （Klf4）的關系。方法 選擇2013年4月～2014年8月期間在南京軍區福州總醫院接受肺癌根治術的50例患者進行研究，收集肺癌組織和癌旁正常組織，檢測Oct4、Klf4的mRNA含量以及miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29的表達量，分析Oct4、Klf4的mRNA含量與miRNAs表達量的關系。結果 肺癌組織中Oct4的mRNA含量（231.12±29.49）高于癌旁正常組織的 （100.00±13.49），t=16.965，P＜0.05；Klf4的mRNA含量 （34.58±5.59）低于癌旁正常組織的（100.00±15.02）（t=21.344，P＜0.05）；TNM分期越高，肺癌組織中Oct4的mRNA含量越高，Klf4的mRNA含量越低，F值分別為18.812、20.193（P＜0.05）；分化程度越低，肺癌組織中Oct4的mRNA含量越高、Klf4的mRNA含量越低，F值分別為16.877、23.485（P＜0.05）；肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量分別為（25.68± 3.42）、（34.15±4.85）、（18.49±1.95），低于癌旁組織的（100.00±12.38）、（100.00±11.69）、（100.00±14.04）（均P＜0.05），并且與Oct4的mRNA含量呈負相關；miR-200c、miR-148、miR-29的表達量 ［（243.45±30.45）、（313.68± 36.58）、（278.69±32.48）］高于癌旁組織 ［（100.00±13.59）、（100.00±15.02）、（100.00±13.48）］（均P＜0.05）；并且與Klf4的mRNA含量呈負相關。 結論 肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361及miR-200c、miR-148、miR-29可能分別通過上調或下調Oct4、Klf4的表達來參與肺癌的發生發展。

肺癌；microRNA；Oct4；Kruppel樣因子

肺癌是我國發病率最高的惡性腫瘤，手術切除仍是臨床治療肺癌最有效的方式，輔助以術后放化療、生物靶向治療等措施能夠有效地延長患者的生存時間。盡管如此，患者在接受綜合治療措施后的復發率仍較高，復發病灶對放化療以及生物靶向藥物不敏感會導致病情迅速發展，最終造成死亡。目前，肺癌發病的潛在分子機制仍未闡明。Oct4和Kruppel樣因子4 （Klf4）是參與細胞增殖調控的兩類轉錄因子，與多種惡性腫瘤的發生相關［1-2］，檢測肺癌組織中Oct4和Klf4的表達量、探索上游調控機制有助于闡明肺癌發生的分子機制。近年來有研究顯示，miRNAs表達異常與肺癌的發生密切相關并且能夠通過與mRNA3'UTR區域結合來調節基因表達，可能參與Oct4 和Klf4表達的調控［3-4］。本研究分析了肺癌組織中miRNAs表達量及其與Oct4、Klf4表達量的關系。

1　資料與方法

1.1研究對象

選擇2013年4月～2014年8月在南京軍區福州總醫院胸外科接受肺癌根治術的50例患者進行研究，所有患者經病理學檢查診斷為肺癌，包括男32例、女18例，年齡43～67歲，平均（52.39±6.82）歲。本研究獲得醫院倫理委員會批準后告知研究事項和手術風險，取得患者知情同意后進行肺癌根治術。術中取肺癌組織和癌旁正常組織，經病理檢查確認肺癌組織和癌旁正常組織的性質后用于下一步研究。

1.2研究材料

RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒來自日本Takara公司；miRNA提取試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒來自德國Qigen公司；PCR儀來自美國ABI公司。

1.3研究方法

1.3.1RNA抽提和檢測方法取肺癌組織和癌旁組織，采用RNA提取試劑盒抽提組織中的總RNA，采用RNA反轉錄試劑盒、通過OligoDT18將mRNA反轉錄為cDNA，而后進行熒光定量PCR反應，擴增條件如下：95℃變性，15 s，特異性退火溫度，15 s，72℃延伸25 s，重復40個循環。擴增基因包括Oct4、Klf4，擴增引物及特異性退火溫度見表1。

1.3.2mi RNA抽提和檢測方法取肺癌組織和癌旁組織，采用miRNA提取試劑盒抽提組織中的總miRNA，采用RNA反轉錄試劑盒對miRNA進行加尾處理、取加尾樣本進行反轉錄并得到miRNA對應的cDNA；而后進行熒光定量PCR反應，退火溫度參照試劑盒均為60℃，擴增條件如下：95℃變性，15 s，60℃退火和延伸，35 s，重復40個循環。擴增基因包括miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29，擴增引物見表1。

表1　PCR引物序列及退火溫度

1.4統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行錄入和分析，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4的表達量

肺癌組織中Oct4的mRNA含量高于癌旁正常組織，Klf4的mRNA含量低于癌旁正常組織，肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4表達量比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2　肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4的mRNA含量比較（±s）

表2　肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4的mRNA含量比較（±s）

注：Klf4：Kruppel樣因子4

組織　樣本量　Oct4　Klf4肺癌組織癌旁正常組織50 50 t值　P值231.12±29.49 100.00±13.49 16.965 ＜0.05 34.58±5.59 100.00±15.02 21.344 ＜0.05

2.2不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的表達量

不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的mRNA含量有差異，t檢驗示不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4表達量比較差異有統計學意義 （均P＜0.05）；LSD-t檢驗進行兩兩比較顯示，TNM分期越高，Oct4的mRNA含量越高，Klf4的mRNA含量越低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3　不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的mRNA含量比較（±s）

表3　不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的mRNA含量比較（±s）

注：Klf4：Kruppel樣因子4；與TNMⅠ期比較，*P＜0.05；與TNMⅡ期比較，#P＜0.05

分期　樣本量　Oct4　Klf4 TNMⅠ期TNMⅡ期TNMⅢ期F值P值11 14 15 131.38±16.65 189.23±23.14*292.34±30.26*#18.812 ＜0.05 82.34±9.23 47.76±6.44*21.52±4.40*#20.193 ＜0.05

2.3不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的表達量

不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的mRNA含量有差異，t檢驗示不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4表達量比較差異有統計學意義 （均P＜0.05）。LSD-t檢驗進行兩兩比較顯示，分化程度越低，Oct4 的mRNA含量越高、Klf4的mRNA含量越低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見表4。

表4　不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的m RNA含量比較（±s）

表4　不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的m RNA含量比較（±s）

注：Klf4：Kruppel樣因子4；與高分化組織比較，*P＜0.05；與中分化組織比較，#P＜0.05

分化程度　樣本量　Oct4　Klf4高分化中分化低分化F值P值17 19 14 154.23±20.12 242.59±30.35*352.30±40.18*#16.877 ＜0.05 76.67±8.89 33.49±4.41*13.59±1.66*#23.485 ＜0.05

2.4肺癌組織和癌旁組織中m iRNAs的表達量

肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量低于癌旁正常組織，miR-200c、miR-148、miR-29的表達量高于癌旁組織。肺癌組織和癌旁正常組織中miRNAs表達量比較差異有統計學意義（均P＜0.05）。見表5。

2.5肺癌組織中m iRNAs表達量與Oct4、Klf4的mRNA的相關性

肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量與Oct4的mRNA含量呈負相關 （P＜0.05），miR-200c、miR-148、miR-29的表達量與Klf4的mRNA含量呈負相關（P＜0.05）。見表6。

3　討論

Oct-4蛋白由Pou5f1基因編碼，是一類含有Pou結構域的轉錄因子，對于維持胚胎干細胞的多能性和自我更新性具有重要意義［5］。最初關于Oct-4的研究多集中在尚未分化的細胞，該轉錄因子既能夠使某些細胞繼續處于未分化狀態，又能使某些細胞向某一類型細胞分化［6］。近年來的多項研究提示，Oct-4高表達與已分化體細胞的無限增殖有關，進而參與乳腺癌、宮頸癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤的發生過程［7-9］。本研究對肺癌組織中Oct-4表達量的檢測顯示，肺癌組織中Oct-4的mRNA含量高于癌旁組織；且腫瘤的分化程度越低，Oct-4的mRNA含量越高，腫瘤的TNM分期越高，Oct-4的mRNA含量越高。

表5　肺癌組織和癌旁正常組織中m iRNAs的表達量比較（±s）

表5　肺癌組織和癌旁正常組織中m iRNAs的表達量比較（±s）

組織　miR-335　miR-339　miR-361　miR-200c　miR-148　miR-29肺癌組織癌旁正常組織t值P值25.68±3.42 100.00±12.38 25.952 ＜0.05 34.15±4.85 100.00±11.69 20.944 ＜0.05 18.49±1.95 100.00±14.04 34.283 ＜0.05 243.45±30.45 100.00±13.59 15.482 ＜0.05 313.68±36.58 100.00±15.02 18.866 ＜0.05 278.69±32.48 100.00±13.48 17.182 ＜0.05

表6　肺癌組織中m iRNAs表達量與Oct4、Klf4的m RNA相關性分析（±s）

表6　肺癌組織中m iRNAs表達量與Oct4、Klf4的m RNA相關性分析（±s）

注：Klf4：Kruppel樣因子4

擴增基因Oct4的mRNA含量回歸系數（b）相關系數（r）　P值Klf4的mRNA含量回歸系數（b）相關系數（r）　P值miR-335 miR-339 miR-361 miR-200c miR-148 miR-29 -1.023 -0.686 -0.914 -1.482 -0.668 -0.706 -0.786 -0.714 -0.807 -0.697 -0.790 -0.817 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 -0.675 -0.901 -0.884 -1.197 -1.392 -0.839 -0.882 -0.791 -0.767 -0.838 -0.809 -0.731 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

Klf4是真核細胞內特有的一類含有3個鋅指結構的轉錄因子，能夠識別SP1的GC結合位點并進行競爭性結合、抑制SP1下游靶基因CyclinD1的表達，進而阻遏細胞周期的發展以及細胞的增殖［10］。近年來越來越多的研究將Klf4視作腫瘤抑制因子，胃癌、食管癌等消化道惡性腫瘤的相關研究發現Klf4低表達與惡性腫瘤的發展有關［11-12］。本研究采用與Oct4相同的方法對肺癌組織中Klf4表達量的檢測顯示，肺癌組織中Klf4的mRNA含量低于癌旁組織；且分化程度越低，Klf4的mRNA含量越低，腫瘤的TNM分期越高，Klf4的mRNA含量越低。

通過以上對Oct4和Klf4表達量的分析可知，Oct4高表達和Klf4低表達與肺癌的發生以及病情的進展相關。但是，目前關于兩種轉錄因子表達量發生變化的分子機制仍處于未知狀態。microRNA是近年來興起的表觀遺傳學調控分子，能夠通過與mRNA 的3'UTR區域結合來調節多種轉錄因子的表達［13］。為了探明肺癌組織中miRNAs是否參與Oct4和Klf4表達的調控，首先對Oct4和Klf4 mRNA的3'UTR序列進行了生物信息學分析，在Oct4 mRNA的3'UTR上有 miR-125b、miR-145、miR-200c、miR-302、miR-324、miR-335、miR-339、miR-430、miR-449a、miR-595的結合位點，在Klf4mRNA的3'UTR上有miR-10b、miR147、miR-199、miR-205、miR-221的結合位點。由此推測上述miRNAs可能通過調節Oct4和Klf4的表達，進而參與肺癌的發生。

在上述生物信息學分析的基礎上，本研究查閱了有關肺癌組織中miRNAs表達變化的相關研究發現，肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29的表達異常［14-20］。進一步對肺癌組織中miRNAs的表達量進行了驗證并分析了miRNAs含量與相應靶基因Oct4、Klf4的相關性，檢測和分析的結果顯示，肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量低于癌旁組織且與Oct4的mRNA含量呈負相關，miR-200c、miR-148、miR-29的表達量高于癌旁組織且與Klf4的mRNA含量呈負相關。這就初步提示肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的低表達可能通過增加Oct4的表達來參與疾病的發生，miR-200c、miR-148、miR-29的高表達可能通過減少Klf4的表達來參與疾病的發生。

綜上所述，得出以下初步結論，肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361及miR-200c、miR-148、miR-29可能分別通過上調或下調Oct4、Klf4的表達來參與肺癌的發生發展。

［1］Liu L，Zhang J，Fang C，etal.OCT4mediates FSH-induced epithelial-mesenchymal transition and invasion through theERK1/2 signaling pathway in epithelial ovarian cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun，2015，461（3）：525-532.

［2］Wang Y，Yang C，Gu Q，et al.KLF4 promotes angiogenesis by activating VEGF signaling in human retinal microvascular endothelial cells［J］.PLoSOne，2015，10（6）：e0130341.

［3］Ogawa H，Wu X，Kawamoto K，et al.MicroRNAs induce epigenetic reprogramming and suppress malignant phenotypes of human colon cancer cells［J］.PLoSOne，2015，10 （5）：e0127119.

［4］Tokarz P，Blasiak J.The role of microRNA in metastatic colorectal cancer and its significance in cancer prognosis and treatment［J］.Acta Biochim Pol，2012，59（4）：467-474.

［5］Tang YA，Chen CH，Sun HS，et al.Global Oct4 target gene analysis reveals novel downstream PTEN and TNC genes required for drug-resistance and metastasis in lungcancer［J］. Nucleic Acids Res，2015，43（3）：1593-1608.

［6］Rodriguez E，Chen L，Ao MH，etal.Expression of transcript factors SALL4 and OCT4 in a subset of non-small cell lung carcinomas（NSCLC）［J］.Transl Respir Med，2014，2 （1）：10.

［7］Liu T，Sun B，Zhao X，etal.OCT4 expression and vasculogenicmimicry formation positively correlate with poor prognosis in human breast cancer［J］.Int JMol Sci，2014，15 （11）：19634-19649.

［8］Breyer JP，Dorset DC，Clark TA，et al.An expressed retrogene of the master embryonic stem cell gene POU5F1 is associated with prostate cancer susceptibility［J］.Am J Hum Genet，2014，94（3）：395-404.

［9］劉劼，徐阿曼，陸震，等.胃癌及癌前病變組織中Nanog 和Oct-4的表達及意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30（8）：880-883.

［10］NaranjoGómez JM，Bernal JF，Arranz PG，etal.Alterations in the expression of p53，KLF4，and p21 in neuroendocrine lung tumors［J］.Arch Pathol Lab Med，2014，138（7）：936-942.

［11］崔晉峰，趙晨燕，曹立勇，等.食管胃交界腺癌和遠端胃癌KLF4 SP1及Cyclin D1表達的對比研究［J］.中國腫瘤臨床，2014，41（2）：108-111.

［12］張志平，王洲，劉相燕，等.食管癌組織KLF4和Survivin蛋白表達及其相關性研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19（6）：406-409.

［13］陳琛，孟凡榮，萬海粟，等.MicroRNAs與OCT4基因之間的相互作用［J］.中國肺癌雜志，2015，18（1）：55-58.

［14］Li Y，Zhao W，Bao P，et al.miR-339-5p inhibits cell migration and invasion and may be associated with the tumor-node-metastasisstagingandlymphnode metastasis of non-small cell lung cancer［J］.Oncol Lett，2014，8（2）：719-725.

［15］Rani S，Gately K，Crown J，et al.Global analysis of serum microRNAs as potential biomarkers for lung adenocarcinoma［J］.Cancer Biol Ther，2013，14（12）：1104-1112.

［16］Gong M，Ma J，Guillemette R，et al.miR-335 inhibits small cell lung cancer bone metastases via IGF-IR and RANKL pathways［J］.Mol Cancer Res，2014，12（1）：101-110.

［17］Li L，Chen YY，Li SQ，et al.Expression ofmiR-148/152 family as potentia l biomarkers in non-small-cell lung cancer［J］.Med SciMonit，2015，23（21）：1155-1161.

［18］Roth C，Stückrath I，Pantel K，et al.Low levels of cellfree circulating miR-361-3p and miR-625*as bloodbased markers for discriminating malignant from benign lung tumors［J］.PLoSOne，2012，7（6）：e38248.

［19］Chang L，Guo F，Huo B，et al.Expression and clinical significance of the microRNA-200 family in gastric cancer［J］.Oncol Lett，2015，9（5）：2317-2324.

［20］Tan M，Wu J，Cai Y.Suppression ofWnt signaling by the miR-29 family ismediated by demethylation of WIF-1 in non-small-cell lung cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，438（4）：673-679.

Expression of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4，K lf4

ZHU Jie1,2XU Chi1YANG Jingrong1ZENG Zhiyong1▲
1.Department of Cardiothoracic Surgery，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command，Fujian Province，Fuzhou350001，China；2.Graduate School，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China

Objective To study the expression of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4，Klf4.Methods 50 cases of patients received lung resection in Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command from April 2013 to August 2014 were enrolled.Lung cancer tissue and adjacent normol tissues were collected.Then mRNA contents of Oct4，Klf4 andmiR-335，miR-339，miR-361，miR-200，，miR-148，miR-29 expression levels were detected，the correlation betweenmRNA contents of Oct4，Klf4 and miRNAs expression were analyzed.Results mRNA contents of Oct4 （231.12±29.49）in lung cancer were higher than those（100.00±13.49）in adjacent normal tissue（t=16.965，P＜0.05）；mRNA contents of Klf4（34.58±5.59）were lower than those（100.00±15.02）in adjacent normal tissue（t=21.344，P＜0.05）；the higher the TNM stage，the higher the Oct4 mRNA contents and the lower the Klf4 mRNA contents in lung tissue，F value was 18.812，20.193 separately（P＜0.05）；the lower the differentiation degree，the higher the Oct4mRNA contents and the lower the Klf4mRNA contents in lung tissue，F valuewas 16.877，23.485 separately（P＜0.05）；miR-335，miR-339，miR-361 contents［（25.68±3.42），（34.15±4.85），（18.49±1.95）］in lung cancer were lower than those［（100.00± 12.38），（100.00±11.69），（100.00±14.04）］in adjacentnormal tissue（P＜0.05）and negatively correlated withmRNA contents of Oct4；miR-200c，miR-148，miR-29 expression levels［（243.45±30.45），（313.68±36.58），（278.69±32.48）］in lung cancer were higher than those［（100.00±13.59），（100.00±15.02），（100.00±13.48）］in adjacent normal tissue（P＜0.05）and negatively correlated with mRNA contents of Klf4.Conclusion miR-335，miR-339，miR-361 and miR-200c，miR-148，miR-29 may participate in the occurrence of lung cancer by reducing the expression of Oct4 and Klf4. ［Key words］Lung cancer；MicroRNA；Oct4；Klf4

R730.21

A

1673-7210（2016）01（b）-0100-04

2015-09-08本文編輯：趙魯楓）

朱捷（1986.7-），男，第二軍醫大學、南京軍區福州總醫院聯合培養2014級外科學（心胸外科）專業在讀碩士：研究方向：肺癌的基因治療。