辛基酚聚氧乙烯醚混合菌的構(gòu)建及響應(yīng)面優(yōu)化

劉文斌,張海濤,楊海君,劉亞賓,許云海

?

辛基酚聚氧乙烯醚混合菌的構(gòu)建及響應(yīng)面優(yōu)化

劉文斌,張海濤,楊海君*,劉亞賓,許云海

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為提高辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)的生物降解效果,在本實(shí)驗(yàn)室已篩選出的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株OPnEO高效降解菌的基礎(chǔ)上,首次從構(gòu)建OPnEO混合菌的角度,著重探究了四菌株等比例不同組合降解OPnEO的效果.結(jié)果表明,混合菌L9(H1∶TXBc10∶TXBa23為1∶1∶1)培養(yǎng)7d后對(duì)初始濃度500mg/LOPnEO的降解率最高,達(dá)到56.44%,比各單一菌株降解效果有較明顯提高.運(yùn)用單因素試驗(yàn)考察了影響L9的相關(guān)因素,初步確定L9降解OPnEO的最適外加碳源和氮源分別為葡萄糖和胰蛋白胨,最適初始pH值為7.0,最適溫度為28 ℃,最適接種量為4%. Plackett-Burman試驗(yàn)篩選獲得影響OPnEO降解率的3個(gè)顯著因子為L(zhǎng)9接種量、溫度及初始pH值.最陡爬坡試驗(yàn)逼近3個(gè)顯著因子的最大響應(yīng)區(qū)域,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法分析,確定L9的最優(yōu)降解條件為50mL反應(yīng)體系中接種量4.16%、溫度28.20 ℃、初始pH值7.13、葡萄糖與胰蛋白胨濃度均為2%、OPnEO初始濃度500mg/L、180r/min培養(yǎng)7d,該條件下混合菌L9對(duì)OPnEO降解率達(dá)62.15%,比未優(yōu)化條件提高了5%左右.

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)；混合菌；響應(yīng)面法；生物降解

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)是繼脂肪醇聚氧乙烯醚之后,性能優(yōu)異的第二大類(lèi)非離子表面活性劑.廣泛用于洗滌、紡織、皮革、造紙、農(nóng)藥等領(lǐng)域.然而,OPnEO自然降解性較差[1],生物積累性強(qiáng)[2-3],加之其降解產(chǎn)生的低分子量低聚物具有很強(qiáng)的環(huán)境雌激素效應(yīng)[4-6],使其在使用過(guò)程中不可避免地產(chǎn)生了系列嚴(yán)重的環(huán)境污染.目前已在城市污水、地面水和飲用水、工業(yè)廢水、河流及其底泥沉積物、海洋及其沿岸沉積物中檢測(cè)到OP及其OPEO1和OPEO2的存在[7].

就目前的研究報(bào)道來(lái)看,對(duì)非離子表面活性劑污染治理的研究主要集中在烷基酚和壬基酚,且研究重點(diǎn)均放在該類(lèi)表面活性劑的危害、吸附行為、測(cè)定方法、降解菌的篩選與鑒定以及應(yīng)用方面[8-16].而作為產(chǎn)量高、環(huán)境雌激素效應(yīng)強(qiáng)的OPnEO污染的生物治理技術(shù)最近才發(fā)展起來(lái),且主要集中在OPnEO高效降解菌的篩選及分離菌對(duì)OPnEO降解能力等理論研究方面[17-20].大部分降解菌雖可直接應(yīng)用,但這些分離、篩選得到的降解菌往往在實(shí)際污染環(huán)境中的耐受性差、可利用性低,甚至某些降解菌在實(shí)際利用中失活.雖然優(yōu)勢(shì)混合菌在廢水污染物的降解及廢物資源化中已有較多報(bào)道[21-22],但其在降解表面活性劑特別是OPnEO污染的研究才剛剛開(kāi)始,鮮有報(bào)道.

本研究將在前期實(shí)驗(yàn)已篩選的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)高效降解菌的基礎(chǔ)上,通過(guò)等比例組合實(shí)驗(yàn),構(gòu)建出高效降解OPnEO的混合菌.并利用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化混合菌降解OPnEO的條件以提高其降解效率.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種來(lái)源 醋酸鈣不動(dòng)桿菌H1 (H1)[18]、氣單胞菌TXBc10(sp. TXBc10)、檸檬酸細(xì)菌OPQb11(sp. OPQb11)、假單胞菌TXBa23(sp. TXBa23)[19]均由本實(shí)驗(yàn)室從湖南裳海迪瑞特服裝有限公司污水處理的曝氣池和排污口廢水中篩選獲得.

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:酵母浸出物 5.0g,胰蛋白胨 10.0g,NaCl 10.0g,TX-100(OPnEO, n=9- 10)0.5g,H2O 1000mL,pH7.0,若配制固體培養(yǎng)基,則加1.5-2%瓊脂.無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MS):K2HPO40.4g,KH2PO40.4g,NaCl 0.1g,(NH4)2SO40.04g, MgSO4·7H2O 0.1g,MnSO4·H2O 0.01g, Fe2(SO4)3·H2O 0.01g,NaMoO4·2H2O 0.01g, H2O1000mL,pH7.0.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辛基酚聚氧乙烯醚高效降解菌的活化 將保存在-80 ℃冰箱中的OPnEO高效降解菌H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23取出溶化后,分別接種到50mL LB培養(yǎng)基中,28 ℃、180r/min 振蕩培養(yǎng)14~16h后,挑選部分茁壯的菌落接種到新的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),重復(fù)此步驟2~3次,從而得到生長(zhǎng)良好的菌落.

1.2.2 混合菌的構(gòu)建 將LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的菌液離心(10000r/min)后,用生理鹽水(NaCl 0.85%)重懸制成菌懸液,并在600nm下測(cè)其光密度,并加入適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌濃度,使4菌株OD600均為1.0左右,然后將濃度一致的4種菌等比例混合,構(gòu)建不同的混合菌,并將其按4%接種到50mL含500mg/L OPnEO的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)(28℃、pH7.0、180r/min)7d后取樣,用高效液相色譜法(AGILENT 1100)測(cè)定OPnEO含量[23-24],計(jì)算OPnEO的降解率.選取降解率最高的混合菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

1.2.3 環(huán)境因素對(duì)混合菌降解效率的影響 通過(guò)單因素試驗(yàn),分別研究溫度、pH值、底物濃度、接種量、外加碳源和氮源對(duì)混合菌降解OPnEO的影響.將混合菌接種到含500mg/L OPnEO的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,180r/min振蕩培養(yǎng)7d后取樣,并用高效液相色譜法(AGILENT 1100)測(cè)定OPnEO含量,計(jì)算OPnEO的降解率.標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn):接種量為4%、28℃、pH7.0、180r/min、50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基反應(yīng)體系.溫度分別為15、20、25、28、30、35和40℃;pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;底物濃度分別為50、100、200、500、800、1000和1500mg/L;接種量分別為0.5%、1%、2%、4%、8%和10%;外加碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、檸檬酸、乳糖、乙酸鈉、山梨醇、明膠和木糖,外加氮源分別為牛肉膏、尿素、硝酸鉀、胰蛋白胨、硝酸銨、酵母粉、乙酸銨、氯化銨和硫酸銨,添加量均為2%.

1.2.4 L9降解OPnEO的最優(yōu)條件研究 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用N=12Placket-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究溫度、pH值、底物濃度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、外加碳源和氮源7個(gè)因素對(duì)混合菌降解OPnEO的影響(表1),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果,利用最陡爬坡路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍[25],并根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),利用Design-Expert.8.05b軟件分析最優(yōu)值.

表1 Placket-Burman試驗(yàn)因素及水平 Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels

注:Dummy1~4為空白因素.

2 結(jié)果與分析

2.1 混合菌降解OPnEO效率

不同混合菌降解OPnEO的效率明顯不同.與單一菌株相比,有些混合菌能在一定程度上提高OPnEO的降解率,另一些混合菌的降解率卻下降.由此可見(jiàn),單純的把各單菌株簡(jiǎn)單的組合在一起,降解效果并不一定都會(huì)提高,這可能是菌株間的拮抗作用所致.在所有混合菌組合中,9號(hào)混合菌(命名為L(zhǎng)9, H1:TXBc10:TXBa23=1:1:1)的降解率最高,為56.44%,比單菌株高8.63%~ 15.44%,選其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表2 混合菌降解OPnEO的效率 Table 2 Effect of OPnEO degradation by the mixed bacteria

注:表中"1" 代表接種菌株,"0" 代表未接種菌株.各菌株間等比例投加,總接種量為4%.

2.2 環(huán)境因素對(duì)L9降解效率的影響

2.2.1 溫度對(duì)L9降解效率的影響 由圖1可知,溫度對(duì)L9降解OPnEO有顯著性影響.隨著溫度的升高,L9的降解效率先升高后降低.在25~30℃時(shí),L9的降解率較高;當(dāng)溫度低于25℃或高于30℃時(shí),L9的降解率顯著下降.當(dāng)溫度為28℃時(shí), L9的降解率最高,為56.24%,分別為15℃和40℃的2倍和4倍,這表明L9與大多數(shù)環(huán)境微生物對(duì)溫度的敏感程度一致,過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)嚴(yán)重影響菌株體內(nèi)相關(guān)酶的活性,從而導(dǎo)致菌株代謝能力降低、生長(zhǎng)受到抑制.

2.2.2 pH值對(duì)L9降解率的影響 由圖2可知,pH5~10時(shí)L9對(duì)OPnEO的降解率出現(xiàn)了較大的起伏.當(dāng)pH在7~9時(shí), L9對(duì)OPnEO具有較高的降解率,且當(dāng)pH為7.0時(shí),L9對(duì)OPnEO降解效果達(dá)到最佳,此時(shí)OPnEO的降解率為55.68%,故初步判斷最適pH為7.0.而當(dāng)pH為5或10時(shí),L9對(duì)OPnEO的降解能力急劇降低,這與過(guò)高或過(guò)低的pH值會(huì)使微生物體內(nèi)酶失活,不利于微生物生長(zhǎng)繁殖有關(guān).總之,L9適應(yīng)中性偏弱堿性環(huán)境,與大多數(shù)微生物對(duì)pH的適應(yīng)范圍基本一致.

2.2.3 底物濃度對(duì)L9降解效率的影響 由圖3可知,在OPnEO濃度低于200mg/L時(shí),L9對(duì)OPnEO的降解速率隨OPnEO初始濃度的增加而迅速下降,變化十分明顯.說(shuō)明混合菌L9在低濃度的OPnEO環(huán)境中迅速生長(zhǎng),并能有效利用OPnEO;當(dāng)OPnEO濃度為200~800mg/L時(shí),L9對(duì)OPnEO的降解率受濃度的影響不大,降解率基本保持在50%左右,說(shuō)明L9能夠適應(yīng)較高OPnEO濃度環(huán)境.考慮到L9的實(shí)際應(yīng)用環(huán)境和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,選擇底物濃度為500mg/L作為后續(xù)研究;而當(dāng)OPnEO濃度高于1000mg/L時(shí),L9對(duì)OPnEO的降解率又開(kāi)始出現(xiàn)大幅下降,到1500mg/L時(shí),降解率下降到31.3%.

2.2.4 接種量對(duì)L9降解效率的影響 由圖4可知,接種量對(duì)于L9降解OPnEO的影響比較明顯,隨著L9接種量的增加,L9對(duì)OPnEO的降解率大幅增加,但并不成簡(jiǎn)單線性關(guān)系.當(dāng)接種量達(dá)到4%時(shí),此時(shí)L9對(duì)OPnEO的降解效果達(dá)到最佳,降解率為51.8%.再繼續(xù)增加接種量, L9的降解效率并沒(méi)有明顯增加,反而有少許下降.

2.2.5 外加碳、氮源對(duì)L9降解效率的影響 從圖5可知,添加外加碳源對(duì)L9降解OPnEO的效果有一定的促進(jìn)作用,且葡萄糖能有效提高L9對(duì)OPnEO的降解,其次蔗糖、麥芽糖和乙酸鈉也對(duì)L9的降解效果有一定促進(jìn)作用.而檸檬酸和乳糖的存在則會(huì)抑制L9對(duì)OPnEO的降解效果,這可能與菌株體內(nèi)酶活受到影響有關(guān).從圖6中可以看出,胰蛋白胨能提高L9對(duì)OPnEO的降解能力,且有機(jī)氮源對(duì)L9降解能力的促進(jìn)作用均高于無(wú)機(jī)氮源.

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化L9降解性能

2.3.1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析 運(yùn)用Design- Expert.8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果如表3和表4所示.從表3中可以看出,試驗(yàn)組3對(duì)OPnEO的降解率最高,達(dá)到60.83%;試驗(yàn)組9的降解率最低,僅有11.22%.將試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert.8.05b軟件分析后,可得方程為

=40.91+0.972-1.183+4.575-1.596- 6.027-0.888+11.1910

式中,2為葡萄糖含量,%3為OPnEO濃度,mg/L5為L(zhǎng)9接種量,%;6為胰蛋白胨含量,%;7為溫度,℃;8為培養(yǎng)時(shí)間,d;10為初始pH.得到模型的為0.0042,表明所得回歸方程顯著,即該模型在研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合性很好;復(fù)相關(guān)系數(shù)2=0.9765,表明相關(guān)性比較好;校正決定系數(shù)Adj2=0.9355,表明93.55%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋;通常情況下變化系數(shù)(v)越低,試驗(yàn)的精確度和可信度越高,v值等于9.00%,表明此PB試驗(yàn)的精確度和可信度較好;精密度指有效信號(hào)和噪聲的比值,大于4.0即視為合理,在本試驗(yàn)精密度為16.508,遠(yuǎn)大于4.0.從回歸分析結(jié)果表4可知,L9的接種量(L9菌懸液與培養(yǎng)液體積比)、溫度以及初始pH值對(duì)L9降解OPnEO的效率存在顯著影響,其中初始pH的值最小(=0.0005),說(shuō)明其對(duì)L9降解OPnEO的效率影響最顯著,其次是溫度(=0.0048),再次為L(zhǎng)9的接種量(=0.0127).而其他4個(gè)因素,葡萄糖濃度、OPnEO濃度、胰蛋白胨濃度以及培養(yǎng)時(shí)間的值均大于0.05,對(duì)L9降解OPnEO的效率沒(méi)有明顯影響.由此可知,初始pH、溫度和L9的接種量為影響L9降解OPnEO效率的關(guān)鍵因素.

表3 Placket-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 Table 3 Design and its response value of Plackett- Burman experiment

注:1~11含義同表1.

表4 Placket-Burman試驗(yàn)分析結(jié)果 Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

注:1~11含義同表1.

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)Placket-Burman 試驗(yàn)篩選出的3個(gè)顯著因素估計(jì)系數(shù)的正負(fù)效應(yīng),依次增大或減小,其他因素根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分別取最佳值,設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn).結(jié)果如表5所示,隨著L9接種量、初始pH的增加和溫度的減小,L9對(duì)OPnEO的降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)L9接種量為4%,初始pH為7.0,溫度為28℃時(shí),L9對(duì)OPnEO的降解效率達(dá)到最大.因此,序號(hào)3的試驗(yàn)為最大響應(yīng)值區(qū)域,故以此為中心點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面分析.

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3.3 響應(yīng)面分析法確定最佳降解條件 通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)確定3個(gè)顯著因子的最適范圍后,以L9接種量4%、溫度28℃、初始pH值7.0為中心點(diǎn)實(shí)施響應(yīng)面分析,各因素水平見(jiàn)表6.以O(shè)PnEO降解率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7和表8.

表6 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因子及水平 Table 6 Factors and levels of Box-Behnken design

運(yùn)用Design Expert 軟件對(duì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面值進(jìn)行回歸分析,得二次多項(xiàng)式方程

=61.29+0.97+2.03+4.52-0.84+0.33+

0.89-2.812-5.342-9.262

式中:為OPnEO降解率;、、分別為L(zhǎng)9接種量、溫度、初始pH的編碼值.相關(guān)系數(shù)2= 0.9530,說(shuō)明方程的擬合度比較好,可以用該方程進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè).

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Table 7 Box-Behnken experimental design and result

運(yùn)用Design-Expert.8.05b軟件對(duì)該模型進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn),得到模型值為0.0007,遠(yuǎn)小于0.01,表明該模型極顯著,即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合性很好;模型的變異系數(shù)(v)為4.39%,說(shuō)明模型的精密度較好,試驗(yàn)的可信度較高.結(jié)合響應(yīng)面分析3維圖(圖7),可直觀的看出各因素之間的交互作用,表明響應(yīng)值與各因素間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,且響應(yīng)值存在1極值點(diǎn).

分析表8數(shù)據(jù)可知,3個(gè)顯著因子對(duì)響應(yīng)值的影響排序?yàn)?初始pH值()>溫度()>L9接種量().其中,、2對(duì)的影響差異極顯著,、2和2對(duì)的影響高度顯著,而、、和對(duì)的影響不顯著.

對(duì)模型構(gòu)建的方程進(jìn)行偏導(dǎo)微分處理,得到方程的3個(gè)解:=4.16,=28.20,=7.13,即:L9接種量4.16%、溫度28.20℃、初始pH7.13.此時(shí),L9對(duì)OPnEO降解率達(dá)到最大預(yù)測(cè)值,為62.15%.

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 由模型可知,三個(gè)顯著因素L9接種量4.16%、溫度28.20℃、初始pH7.13時(shí),L9對(duì)OPnEO降解率達(dá)到最大預(yù)測(cè)值62.15%.為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性,按照優(yōu)化后的OPnEO降解條件進(jìn)行搖瓶試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)3次.結(jié)果顯示,實(shí)際檢測(cè)OPnEO的降解率分別為61.95%、60.81%、61.02%,平均值為61.26%,與預(yù)測(cè)值62.15%接近,兩者之間具有良好的擬合性,表明該模型能比較真實(shí)的預(yù)測(cè)各因素對(duì)L9降解OPnEO的影響.同時(shí),與未優(yōu)化試驗(yàn)組之前結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),優(yōu)化后的最佳降解條件可使L9對(duì)OPnEO的降解率提高4.82%.

3 討論

雖然在多數(shù)領(lǐng)域中高效混合菌的作用已得到肯定,部分成果也已經(jīng)在實(shí)踐中得到應(yīng)用[27-30],但在降解表面活性劑,特別是OPnEO污染的研究報(bào)道尚不多見(jiàn).故本實(shí)驗(yàn)選擇在前期已篩選的H1、TXBc10、OPQb11、TXBa23四株辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)高效降解菌的基礎(chǔ)上,采用等比混合的方式構(gòu)建混合菌.結(jié)果發(fā)現(xiàn),混合菌對(duì)OPnEO的降解效果并不一定都比單菌株高,甚至有些混合菌比各單菌株的降解率還低,這與何麗媛等[31]的研究結(jié)果相一致.由此可見(jiàn),如果只是簡(jiǎn)單的把能利用同一底物的單菌株組合在一起,不一定會(huì)取得理想的效果.這是由于當(dāng)前對(duì)于具有協(xié)同作用關(guān)系的混菌篩選還停留在一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程上,對(duì)混合菌體系中各菌間相互關(guān)系和作用機(jī)理缺乏深入研究,從而不能有效地協(xié)調(diào)各菌株之間的關(guān)系,使其達(dá)到最佳水平,發(fā)揮最大效應(yīng).上述問(wèn)題都嚴(yán)重地阻礙了混合菌的發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用.

因此,從生理、代謝和遺傳角度深入研究菌株間的關(guān)系和協(xié)同作用機(jī)理,對(duì)提高混合菌的穩(wěn)定性和協(xié)同作用效率具有重要作用.在此基礎(chǔ)上引入一些新興的生物技術(shù),如利用細(xì)胞融合技術(shù)和基因工程技術(shù)把具有互利協(xié)同關(guān)系的微生物構(gòu)建工程菌,可使其既具有混菌培養(yǎng)的功能,又擁有純培養(yǎng)菌株?duì)I養(yǎng)要求單一、易于調(diào)控、生理代謝穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn);采用固定化微生物技術(shù)固定高效優(yōu)勢(shì)混合菌,以使其可多次重復(fù)使用,降低成本,增加效率,提高環(huán)境耐受能力,這些都對(duì)混合菌的理論發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用有重要意義.

4 結(jié)論

4.1 通過(guò)對(duì)四菌株(H1、TXBc10、OPQb11和TXBa23)進(jìn)行等比例組合實(shí)驗(yàn),獲得了一組高效降解OPnEO的混合菌L9(H1:TXBc10:TXBa23= 1:1:1),其在總接種量4%,28℃,pH7.0,180r/min培養(yǎng)7d對(duì)初始濃度為500mg/L的OPnEO降解率達(dá)到56.44%,比降解效果最好的單一菌株(表1試驗(yàn)組15TXBa23,47.81%)提高了8.63%.

4.2 運(yùn)用單因素試驗(yàn)考察了影響混合菌L9降解的相關(guān)因素,初步確定混合菌L9降解OPnEO的最適外加碳源和氮源分別是葡萄糖和胰蛋白胨,最適pH值7.0,最適溫度28℃,最適接種量4%.應(yīng)用響應(yīng)面法分析,確定混合菌L9的最優(yōu)降解條件為50mL反應(yīng)體系中接種量4.16%、溫度28.20℃、初始pH值7.13、葡萄糖濃度2%、胰蛋白胨濃度2%、OPnEO初始濃度500mg/L、180r/min培養(yǎng)7d,該條件下混合菌L9對(duì)OPnEO的降解率達(dá)62.15%,通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢測(cè)的平均值為61.26%,比未優(yōu)化條件下提高了4.82%.

[1] Chiu T Y, Paterakis N, Cartmell E, et al. A critical review of the formation of mono-and dicarboxylated metabolic intermediates of alkylphenol polyethoxylates during wastewater treatment and their environmental significance [J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2010,40(3):199-238.

[2] Servos M R. Review of the aquatic toxicity, estrogenic responses and bioaccumulation of alkylphenols and alkylphenol polyethoxylates [J]. Water Quality Research Journal of Canada, 1999,34(1):123-177.

[3] Tsuda T, Takino A, Kojima M, et al. 4-Nonylphenols and 4-tert-octylphenol in water and fish from rivers flowing into Lake Biwa [J]. Chemosphere, 2000,41(5):757-762.

[4] 宮向紅,徐英江,任利華,等.辛基酚對(duì)鯉的雌激素效應(yīng) [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010(3):410-414.

[5] 朱 毅,舒為群,田懷軍,等.辛基酚體外類(lèi)雌激素效應(yīng)觀察 [J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003,25(8):673-675.

[6] Nice H E, Morritt D, Crane M, et al. Long-term and transgenerational effects of nonylphenol exposure at a key stage in the development of Crassostrea gigas. Possible endocrine disruption [J]. Marine Ecology Progress Series, 2003,256:293- 300.

[7] Van Ry D A, Dachs J, Gigliotti C L, et al. Atmospheric seasonal trends and environmental fate of alkylphenols in the lower Hudson River estuary [J]. Environmental Science & Technology, 2000,34(12):2410-2417.

[8] Zhang G, Hao H U, Sun W L, et al. Sorption of Triton X-100on soil organic matter fractions: Kinetics and isotherms [J]. Journal of Environmental Sciences, 2009,21(6):795-800.

[9] Di Gioia D, Michelles A, Pierini M, et al. Selection and characterization of aerobic bacteria capable of degrading commercial mixtures of low-ethoxylated nonylphenols [J]. Journal of Applied Microbiology, 2008,104(1):231-242.

[10] Chang B V, Chiang B W, Yuan S Y. Biodegradation of nonylphenol in soil [J]. Chemosphere, 2007,66(10):1857-1862.

[11] 楊海君,楊成建,肖啟明.十二烷基聚氧乙烯醚降解菌的分離、鑒定及降解特性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2007,27(6):768-772.

[12] 楊海君,楊成建,曾清如,等.十二烷基聚氧乙烯醚Brij-30降解菌的分離及其對(duì)土壤微生物和Brij-30降解的影響 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008,27(3):953-958.

[13] 楊海君,顏丙花,范美蓉,等.土壤環(huán)境中2株典型非離子表面活性劑降解菌的應(yīng)用效果 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2009,22(5):617- 621.

[14] Yan B H, Yang H J, Wei J H, et al. Isolation from tannery wastewater and characterization of bacterial strain involved in nonionic surfactant degradation [C]//Advanced Materials Research, 2011,183:22-26.

[15] Hotta Y, Hosoda A, Sano F, et al. Ecotoxicity by the biodegradation of alkylphenol polyethoxylates depends on the effect of trace elements [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009,58(2):1062-1067.

[16] 劉 易,王 峰.辛基酚的好氧生物降解及微生物群落特征 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2012,6(8):2903-2908.

[17] 楊海君,楊成建,羅 琳.辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)和降解特性 [J]. 環(huán)境化學(xué), 2008,27(4):444-447.

[18] 關(guān)向杰,賀強(qiáng)禮,黃水娥,等.一株辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的篩選,鑒定及其降解 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2014,34(6):1556-1563.

[19] 顏丙花.制革廢水中辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的選育及其降解特性研究 [D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2010.

[20] Tasaki Y, Yoshikawa H, Tamura H. Isolation and characterization of an alcohol dehydrogenase gene from the octylphenol polyethoxylate degrader Pseudomonas putida S-5 [J]. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2006,70(8):1855-1863.

[21] 馮 樹(shù),周櫻橋,張忠澤.微生物混合培養(yǎng)及其應(yīng)用 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2001,28(3):92-95.

[22] 楊家華,郭志宏.EM技術(shù)及其在水環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2007,30(6):112-114.

[23] Loyo-Rosales J E, Schmitz-Afonso I, Rice C P, et al. Analysis of octyl-and nonylphenol and their ethoxylates in water and sediments by liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J]. Analytical Chemistry, 2003,75(18):4811-4817.

[24] Mao I F, Lu Y Y, Chen M L. A simplified method for simultaneous quantitation of alkylphenols and alkylphenol ethoxylates in meat and fish using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection [J]. International Journal of Environmental and Analytical Chemistry, 2006, 86(10):713-722.

[25] 賀強(qiáng)禮,劉文斌,楊海君,等.1株對(duì)叔丁基鄰苯二酚降解菌的篩選鑒定及響應(yīng)面法優(yōu)化其降解 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2015,(7):055.

[26] Yu-Duo C, Gao H. The Application and Function of Microbial Technology in the Process of Water Pollution Repair [J]. Guangzhou Chemical Industry, 2014.

[27] 趙碩偉,沈嘉澍,沈 標(biāo).復(fù)合菌群的構(gòu)建及其對(duì)石油污染土壤修復(fù)的研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,30(8):1567-1572.

[28] 王 鑫,王學(xué)江,劉 免,等.高效石油降解菌群構(gòu)建及降解性能 [J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2014(4):576-579.

[29] Akbar S, Sultan S, Kertesz M. Bacterial community analysis in chlorpyrifos enrichment cultures via DGGE and use of bacterial consortium for CP biodegradation [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014,30(10):2755-2766.

[30] Boonchan S, Britz M L, Stanley G A. Degradation and mineralization of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures. [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2000,66(3):1007–1019.

[31] 何麗媛,黨 志,唐 霞,等.混合菌對(duì)原油的降解及其降解性能的研究 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2010,30(6):1220-1227.

* 責(zé)任作者, 副教授, 1227677453@qq.com

Construction of mixed flora effective degrading octylphenyl polyethoxylates (OPnEO) and optimization of degrading conditions using response surface method

LIU Wen-bin, ZHANG Hai-tao, YANG Hai-jun*, LIU Ya-bin, XU Yun-hai

(College of Plant Protection ,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)., 2016,36(8)：2444~2452

In order to heighten the biodegradation effect of the non-ionic surfactant octyl phenol ethoxylates (Octylphenyl polyethoxylates, OPnEO) in the laboratory, four mixed degradation bacteria (H1, TXBc10, OPQb11, TXBa23) were screened to degrade OPnEO. The construction of OPnEO mixed flora centers on the degradation effects of four bacterial strain of different ratios on OPnEO. The degradation rate of hybrid strain L9 (H1: TXBc10: TXBa23 1: 1: 1) to OPnEO reached 56.44% (highest), slightly higher than the degradation effect of each single strain. The factors related to degradation efficiency of L9were optimized as follows: optimum carbon and nitrogen sources were sucrose and tryptone, respectively; optimum initial pH value was 7.0, the optimum temperature was 28℃; optimum inoculation amount was 4%. To further the degradation rate, three significant factors affecting the degradation OPnEO were screened in Plackett-Burman experimental design: L9mixed bacteria inoculation, temperature, and initial pH value. Then steepest ascent approached the maximum response area of the three significant factors. Using Box-Behnken experimental design and response surface analysis, the optimal conditions for the degradation of OPnEO by mixed bacteria L9were confirmed as follows: inoculation 4.16%, temperature 28.20℃, initial pH value 7.13, sucrose concentration 500mg/L, tryptone concentration 500mg/L, OPnEO initial concentration of 500mg/L,180r/min cultured 7d. Under these conditions, the degradation rate of OPnEO by L9reached 62.15%, about 5% higher than non-optimized OPnEO of experimental conditions. These results can effectively solve the current problem of environmental pollution such as tanning, washing, pesticides and other industries caused by OPnEO, and will offer new ideas to the study of other types of biodegradable surfactants pollutants.

octylphenyl polyethoxylates (OPnEO)；mixed flora；response surface methodology；biodegradation

X172

A

1000-6923(2016)08-2444-09

劉文斌(1990-),男,湖南益陽(yáng)人,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士研究生,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染與治理.

2016-01-18

湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ2079);長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃(K1403022-31)