Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達及相關性研究

李楊鈞　章　維.寧波市第二醫院肝膽、微創外科，浙江寧波　3500；.寧波市第二醫院消化科，浙江寧波　3500

Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達及相關性研究

李楊鈞1章維2
1.寧波市第二醫院肝膽、微創外科，浙江寧波315010；2.寧波市第二醫院消化科，浙江寧波315010

目的探討Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達，并探討二者之間的相關性。方法選擇2013年12月～2015年12月在我院手術治療的膽管細胞癌患者40例（A組）手術標本作為研究對象，同時取癌旁膽管組織30例（B組）。另外選取同期手術的10例正常組織（肝血管瘤旁正常肝內膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常肝內膽管組織）作為對照（C組）。比較各組Survivin與Caspase-3表達的陽性率與臨床病理參數的關系，及Survivin在膽管細胞癌中的表達與Caspase-3的相關性。結果Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的陽性率分別為75.0%、40.0%，其中Survivin在A組中的陽性率顯著高于B組、C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而Caspase-3在A組中的陽性率低于B組、C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Survivin、Caspase-3在膽管細胞癌中的表達與分化程度及淋巴結轉移有密切關系，差異有統計學意義（P＜0.05）。膽管細胞癌中Survivin陽性30例，Caspase-3陽性16例，二者均為陽性7例，二者均為陰性1例，應用相關分析顯示，Survivin在膽管細胞癌中的表達與Caspase-3呈負相關（r=-0.723，P＜0.05）。結論Survivin在膽管細胞癌中的陽性表達率較高，但Caspase-3較低，二者呈負相關，考慮可能是Survivin抑制了Caspase-3介導的細胞凋亡，對Survivin與Caspase-3的研究有助于深入了解膽管細胞癌的發生、發展機制。

膽管細胞癌；Survivin；Caspase-3；相關性

［Abstract］Objective To investigate the expression of Survivin and Caspase-3 in cho1angiocarcinoma and to exp1ore the corre1ation between the two.Methods 40 cases（group A）with cases of bi1e duct carcinoma were se1ected as the study subjects，and 30 cases（group B）were co11ected from the surgica1 treatment of cho1angiocarcinoma in our hospita1 during December 2013 to December 2015.In addition，10 cases of norma1 1iver tissue（norma1 intrahepatic bi1e duct tissue or 1iver injury after 1iver trauma）were se1ected as contro1 group（group C）.The re1ationship between the expression of Survivin and in each group，the re1ationship between the positive rate of Caspase-3 expression and the c1inicopatho-1ogica1 parameters，and the corre1ation between the expression of Survivin and the expression of Caspase-3 in cho1angiocarcinoma were compared.Results The positive rates of Survivin and Caspase-3 in cho1angiocarcinoma were 75.0% and 40.0%，respective1y.The positive rate of Survivin in group A was significant1y higher than that in group B and group C（P＜0.05）.And the positive rate of Caspase-3 in group A was 1ower than that of group B and group C（P＜0.05）. The expression of Caspase-3 and Survivin was c1ose1y re1ated to the degree of differentiation and 1ymph node metastasis，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.Bi1e duct ce11 carcinoma survivin in 30 cases of positive，caspase-3 was positive in 16 cases，both were positive in 7 cases，two were negative in 1 case，the app1ication corre1ation ana1ysis showed that survivin in bi1e duct carcinoma and the expression of Caspase-3 was negative1y corre1ated （r=-0.723，P＜0.05）.Conclusion The positive expression of Survivin in ce11s of bi1e duct cancer rate is high，but caspase-3 is 1ow，the second is negative1y re1ated，consider possib1e is by inhibition of caspase-3 apoptosis mediated by Survivin.The research of Survivin and Caspase-3 he1ps to understanding the deve1opment mechanism of cho1ahgiocarcinoma.

［Key words］Cho1angiocarcinoma；Survivin；Caspase-3；Corre1ation

膽管細胞癌（cho1angiocarcinoma）是常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來發病率逐年升高。膽管細胞癌的發生發展與其他腫瘤一樣，其發生發展是多因素、涉及多基因改變和多階段致病的復雜過程［1］。隨著膽管細胞癌發病機理研究的深入，已發現膽管細胞癌的發生、發展與細胞凋亡密切相關。Survivin是近年來發現的凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAps）家族中的一個新成員，是調控細胞凋亡的凋亡抑制因子之一，具有抑制細胞凋亡，并通過有絲分裂促進轉化細胞異常增殖的作用［2］。Survivin在人體內幾乎所有的惡性腫瘤中均有表達，而在正常分化的成人組織中除子宮內膜、胎盤和胸腺組織外無表達［3］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）是ICE家族重要成員，是細胞凋亡信號通路下游最主要的執行分子之一，研究證實，Caspase-3廣泛分布于各種不同類型的細胞中，表達在多種正常組織中，包括淋巴結、骨髓、上皮等：在某些惡性腫瘤組織中也有表達［4］。近年來關于二者間的關系研究顯示，Survivin通過與微管蛋白形成復合物抑制凋亡蛋白酶Caspase-3的活性，從而抑制凋亡，同時具有抑制凋亡效應蛋白酶Caspase-3活性、參與細胞周期調控及調節細胞有絲分裂等作用［5］。目前臨床關于二者在腫瘤中入胃癌、結腸癌、肝癌中表達的情況及相關性研究較多，但關于二者在膽管細胞癌中的表達研究報道較少，本研究旨在通過免疫組織化學（免疫組化）SP法檢測Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達，并探討二者之間的相關性，現報道如下。

1　對象與方法

1.1研究對象

選擇2013年12月～2015年12月在我院手術治療的膽管細胞癌患者40例手術標本作為研究對象（A組），術前未行放化療，其中男22例，女18例，年齡28～78歲，平均（61.3±7.2）歲；其中≤60歲者10例，＞60歲者30例，分化程度：高分化6例，中分化10例，低分化24例。伴周圍淋巴結轉移29例，轉移部位包括肝、膽囊、腸系膜、胰腺，十二指腸等。同時取癌旁膽管組織30例（B組），其中男16例，女14例，年齡28～76歲，平均（61.2±6.8）歲。另外選取同期手術的10例正常組織（肝血管瘤旁正常肝內膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常肝內膽管組織）作為對照（C組），其中男6例，女4例，年齡28～72歲，平均年齡（52.8±6.7）歲；三組間的性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2試劑與方法

1.2.1試劑濃縮型鼠抗人Survivin單克隆抗體、濃縮型兔抗人Caspase-3多克隆抗體、免疫組化S-P試劑盒（即用型），購自于北京中山生物技術有限公司。1.2.2免疫組化方法 常規脫蠟水化，采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法，均經檸檬酸緩沖液高壓抗原熱修復預處理，經顯色，蘇木素復染。用已知陽性的癌組織切片做陽性對照，代替一抗作陰性對照。脫蠟及水化：

1.3結果判定

Survivin陽性：膽管細胞漿或核呈棕黃色細顆粒：Caspase-3陽性：膽管細胞漿呈棕黃色顆粒。采用半定量積分法：每項指標隨機選取10個高倍視野，陽性細胞數≤10%為陰性（-）；11%～25%為弱陽性（+）；26%～50%為中等陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）；后三者視為陽性［6］。

1.4統計學處理

應用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析，其中計數資料采用四格表χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗，檢驗水準 α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的陽性表達情況

見表1。Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的陽性率分別為75.0%、40.0%，Survivin與Caspase-3在膽管癌的癌旁組織中的陽性率率分別為3.3%、80.0%，Survivin與Caspase-3在正常組織中的陽性率率分別為0、90.0%。其中Survivin在A組中的陽性率顯著高于B組、C組，差異有統計學意義（χ2=4.398、4.562，P＜0.05）。而Caspase-3在在A組中的陽性率低于B組、C組，差異有統計學意義（χ2=5.238、5.142，P＜0.05）。但Survivin和Caspase-3在B組、C組中的陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=0.334、0.762，P＞0.05）。

表1　Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的陽性表達情況［%（n/n）］

2.2Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達及與臨床病理因素間的關系

見表2。Survivin、Caspase-3在膽管細胞癌中的表達與分化程度及淋巴結轉移有密切關系，差異有統計學意義（P＜0.05）。而與患者的年齡無關（P＞0.05）。

2.3膽管細胞癌中Survivin與Caspase-3表達的相關性分析

見表3。膽管細胞癌中Survivin陽性30例，Caspase-3陽性16例，二者均為陽性7例，二者均為陰性1例，應用相關分析顯示，Survivin在膽管細胞癌中的表達與Caspase-3呈負相關（r=-0.723，P＜0.05）。

表2　Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達及與臨床病理因素間的關系

表3　膽管細胞癌中Survivin與Caspase-3表達的相關性分析（n）

3　討論

膽管細胞癌的發生是多因素參與、多步驟、多階段的過程。研究發現，膽管細胞癌解剖位置特殊，惡性度高，且起病隱匿，預后差，與肝細胞肝癌相比更容易發生早期淋巴結轉移與術后復發。近年來有數據表明：膽管細胞癌的發病率和死亡率逐年增高［7］。

Survivin是新近發現的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）基因家族的新成員。Survivin的表達具有高度特異性，在胚胎組織高表達，而在正常成體組織，除了胎盤和胸腺之外，幾乎檢測不到［8］。在膽管細胞癌的發生發展過程中，Survivin基因處在細胞凋亡和細胞分裂的交叉路口，可以同時控制這兩個在腫瘤發病中重要的細胞生命活動過程［8］。目前已有研究者［9-15］證實Survivin參與了多種人類腫瘤如肺、胃癌、食管癌［5］、膀胱癌、肝細胞癌、宮頸癌等的發生，但是目前國內外對其與膽管細胞癌關系的研究較少。本研究應用免疫組化方法檢測40例膽管細胞癌中Survivin的表達，結果顯示，Survivin在膽管細胞癌中的陽性率達75.0%，顯著高于癌旁組織和正常組織（P＜0.05）且Survivin在膽管細胞癌中的表達與分化程度及淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。與石曉巖等［16］報道的觀點是一致的，說明Survivin參與了膽管細胞癌的發生發展過程，極有可能在膽管上皮出現異常增生和分化時就已表現出活性。Caspase-3是細胞凋亡通路中最重要的執行分子，是凋亡級聯反應的最終效應蛋白，被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵酶［17］。正常狀況下，胞質中的Caspase-3無活性，當細胞接受凋亡刺激時，它被系列反應激活，進而誘導細胞發生凋亡［5］。有研究證實Caspase-3與胃癌的發生、發展密切相關，是腫瘤惡性轉移的重要原因［8］。

本研究中，Caspase-3在膽管細胞癌中陽性率40.0%，低于癌旁組織和正常組織（P＜0.05）。且Caspase-3在膽管細胞癌中的表達與分化程度及淋巴結轉移有密切關系（P＜0.05），說明 Caspase-3的表達與膽管細胞癌的發生、發展密切相關，Caspase-3在膽管細胞癌中的低表達促進了膽管癌細胞的增殖，阻礙了其凋亡［19-21］。本研究同時對二者在膽管細胞癌中的相關性進行分析，結果顯示，Survivin在膽管細胞癌中的表達與Caspase-3呈負相關（r=-0.723，P＜0.05），說明Survivin和Caspase-3可能共同參與了膽管細胞癌的過程，Survivin是Caspase-3的直接抑制劑，通過抑制Caspase-3的活性而阻斷各種刺激誘導的凋亡過程［22-24］。許鵬等［25］也證實了上述觀點。

綜上，Survivin在膽管細胞癌中的陽性表達率較高，但Caspase-3較低，二者呈負相關，考慮可能是Survivin抑制了Caspase-3介導的細胞凋亡，對Survivin 與Caspase-3的研究有助于深入了解膽管細胞癌的發生、發展機制。

［1］許鵬，黃強.膽管癌組織CIP2A和Survivin蛋白表達及其與預后相關性的探討［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18 （24）：1933-1937.

［2］秦興雷，薛煥洲，王作仁，等.Survivin蛋白在肝外膽管癌組織中的表達及其與預后的關系［J］.中華外科雜志，2009，47（24）：1852-1856.

［3］Kama P，Sharp SM，Yates C，et a1.EM011 activates a survivin-dependent apoptotic program in humannon-sma11 ce11 1ung cancer ce11s［J］.Mo1ecu1ar Cancer，2009，8（30）：93.

［4］Liu J，Enomoto S，Lancto CA，et a1.Rutherford.inhibition of apoptosis in cryptosporidium parvum-infected intestina1 epithe1ia1 ce11s is dependent on survivin［J］.Infect Immun，2008，76（8）：3784-3792.

［5］孫智勇，智緒亭.Survivin在膽管癌組織中的表達及其與VEGF關系的相關研究［J］.中國現代普通外科進展，2009，12（2）：106-107.

［6］黃輝，耿小平弘，熊奇如.Survivin與Caspase-3在膽管細胞癌中的表達及相關性研究［J］.肝膽胰外科雜志，2008，20（6）：403-404.

［7］崔東旭，朱立君，劉寶林，等.膽管癌中Livin蛋白和血管內皮生長因子的表達及與Caspase-3的相關性研究［J］.現代腫瘤醫學，2010，18（6）：1165-1166.

［8］Friman S.Cho1angiocarcinoma-current treatment options［J］. Scand J Surg，2011，100（1）：30-34.

［9］Hink1e JL.Re1iabi1ity and va1idity of the Nationa1 Institutes of hea1th stroke sca1e for neuroscience nurses［J］. Stroke，2014，45（3）：e32-e34.

［10］Varfo1omeev E，Vucic D.Inhibitor of apoptosis proteins：Fascinating bio1ogy 1eads to attractive tumor therapeutic targets［J］.Future Onco1，2011，7（5）：633-648.

［11］朱紅霞，劉爽.抗凋亡基因Survivin促進細胞轉化的作用機制［J］.中華醫學雜志，2002，82（5）：338-340.

［12］盧昕，肖新波.Survivin抑制人膽管癌細胞凋亡相關信號通路的實驗研究［J］.中國普通外科雜志，2012，21（2）：164-165.

［13］左克強，艾開興，郭興軍，等.Survivin蛋白和mRNA在膽管癌中的表達和意義［J］.華中科技大學學報（醫學版），2007，36（2）：199-201.

［14］Yamashita S，Masuda Y，Kurizaki T，et a1.Survivin expression predicts ear1y reeun′ence in ear1y-stage breast cancer［J］.Anticancer Res，2007，27（9）：2803-2808.

［15］Ponne11e T，Chapusot C，Martin L，et a1.Ce11u1ar 1oca1izationof survivin：Impact on the prognosis in eo1oreeta1 cancer［J］.J Cancer Res C1in Onco1，2005，131（7）：504-510.

［16］石曉巖，智緒亭，韓興華.Survivin基因在肝門部膽管癌組織中的表達及其與nm23和PTEN相關性研究［J］.中國現代普通外科進展，2007，10（5）：405-408.

［17］唐滔，劉輝，閻玉礦，等.Caspase-3和Bc1-2/Bax在膽管癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性研究［J］.長江大學學報（自然科學版），2009，6（4）：24-25.

［18］楊其昌，馮一中，季曉華，等.胃癌組織芯片中Survivin 與Caspase-3表達及意義［J］.中國癌癥雜志，2006，16 （10）：817-822.

［19］張苗尊，李明主，顧昕.肝內膽管結石上皮Survivin表達與肝內膽管細胞癌關系的研究［J］.現代實用醫學，2011，23（9）：1029-1030.

［20］郭欣，韓建立，裴毅，等.凋亡抑制蛋白Survivin和Bc1-2在膽管癌中的表達及意義［J］.中國藥物與臨床，2015，15（6）：765-766.

［21］Knapp CF，Sayegh Z，Sche11 MJ，et a1.Expression of CXCR4，Ecadherin，Bc1-2，and survivin in Merke1 ce11 carcinoma：An immunohistochemica1 study using a tissue microarray［J］.Am J Dermatopatho1，2012，34（6）：592-596.

［22］Tunce1 H，Shimamoto F，Kaneko H，et a1.Nuc1ear Aurora B andcytop1asmic Survivin expression is invo1ved in 1ymph nodemetastasis of co1orecta1 cancer［J］.Onco1 Lett，2012，3（5）：1109-1114.

［23］Nassar A，Sexton D，Cotsonis G，et a1.Survivin expression inbreast carcinoma：Corre1ation with apoptosis and prognosis［J］.App1 Immunohistochem Mo1 Morpho1，2008，16（3）：221-226.

［24］鄢義云，蔡軍.Survivin、MMP-9與膽管癌的相關性研究進展［J］.實用臨床醫學，2014，15（7）：130-131.

［25］許鵬，黃強，劉臣海，等.膽管癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白表達及與預后的關系［J］.山東醫藥，2011，51（35）：28-29.

ExPression and correlation of Survivin and CasPase-3 in cholangiocarcinoma

LI Yangjun1ZHANG Wei2
1.Department of Minima11y Invasive Surgery，Ningbo No.2 Hospita1，Ningbo315010，China；2.Department of Gastroentero1ogy，Ningbo No.2 Hospita1，Ningbo315010，China

R735.8

A

1673-97O1（2O16）11-OO13-O4

浙江省寧波市第二批科技項目（2012A610198）

2016-01-28）