發光二極管光源照射日本大耳白兔皮膚的安全性評價

李彥紅，張繼剛，徐艷峰，韓云林，黃　瀾，江彬彬，朱　華，徐玉環，楊維玲*，秦　川*

(1.中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京　100021；2.中國人民解放軍火箭軍總醫院,北京　100088)

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發光二極管光源照射日本大耳白兔皮膚的安全性評價

李彥紅1，張繼剛2，徐艷峰1，韓云林1，黃瀾1，江彬彬2，朱華1，徐玉環1，楊維玲2*，秦川1*

(1.中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京100021；2.中國人民解放軍火箭軍總醫院,北京100088)

目的通過LED白色光源照射日本大耳白兔皮膚組織，對LED光源照射的安全性進行初步的評價。方法動物隨機分成照射組和對照組。照射組動物剔除背部毛發，LED光源照射，強度為50 mw/cm2，對照組動物以普通日光燈光源照射，兩組均每天照射5 h，連續3個月。觀察動物皮膚有無紅腫，測量動物進食、體重、體溫等改變情況；照射完畢采集外周血測量常規、生化指標；Elisa分析免疫細胞及細胞因子改變情況；臟器組織病理檢測，及分析皮膚彈力纖維變化情況；皮膚免疫組織化學分析C-myc、P53、細胞周期蛋白D1(CCND1)等癌基因及抑癌基因的表達變化。結果照射組兔皮膚未見紅腫表現，體重在6周后稍高于對照組，體溫3周、6周有差別，進食未見異常；血常規有白細胞增多，生化檢測尿素、肌酐水平有增高,但在正常范圍內；ELISA分析血免疫細胞CD3T細胞、細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平在兩組無明顯差別，照射組動物CD19B細胞，IL-4水平升高；照射組動物臟器組織病理未見明顯異常結構改變，皮膚彈性纖維分布無異常；皮膚組織內細胞周期蛋白(CCND1)，C-Myc蛋白，P53蛋白表達與對照組相比沒有差異。結論LED光源照射日本大耳白兔3個月后，未引起體內明顯的組織病理學改變，也未引起皮膚腫瘤相關因子的改變。

發光二極管；日本大耳白兔；皮膚；安全評價

發光二極管(light emitting diode, LED)為半導體固體發光器件，兩端加壓后，注入半導體中的載流子發生復合，引起光子發射而產生光[1]。隨著半導體工藝的快速發展，新型LED光源不斷推出，而且技術日益成熟，功率、發光效率不斷提高，光譜從紫外到紅外均已實現。LED光源具有冷光源、工作電壓低、功耗低、波長可調、綠色環保、壽命長等特點，已廣泛應用于信號指示、裝飾照明、液晶背光燈領域，而且在醫學方面也開始應用，如醫用照明、醫學診斷和醫學治療等方面[1]。但是關于LED光源的安全性問題研究的并不是很多，而且長時間照射是否會對機體造成潛在性的危害，均未見有明確報道。本文擬用LED光源照射日本大耳白兔3個月，觀察其生理生化及病理指標，對LED光源照射的安全性進行初步的評價。

1　材料和方法

1.1實驗動物

普通級日本大耳白兔，6～8周齡，體重2.4～2.6 kg，雌雄各6只，購自北京富龍騰飛養殖中心[SCXK(京)2013-0004]，動物在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所新藥安全評價中心普通級動物房[SYXK(京)2010-0030]飼養及管理，每天光照明暗各12 h，相對濕度40%～60%，溫度18～25℃，每籠1只，自由攝食和飲水。實驗操作已經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(ILAS-PL-2014-005)。

1.2實驗材料

LED白色光源(GY225型，由山西光宇半導體照明股份有限公司提供)，功率50 mw/cm2，光通量4.5l m，距離2～2.5 m，光源可懸吊屋頂相當于普通照明的方式連續照射。

1.3實驗方法

1.3.1光源照射

動物隨機分成兩組：實驗組：接受LED光源照射；對照組：以普通日光燈光源照射作為對照。動物剔除背部毛發，LED光源照射，距離2～2.5 m, 每天5 h，連續3個月；對照組動物以普通日光燈光源照射。每天5 h，連續3個月。

1.3.2臨床觀察

照射過程中觀察動物局部皮膚有無紅腫情況；觀察進食，每周記錄動物體重、體溫的改變，并比較。

1.3.3動物血液免疫學檢測

照射結束后，耳源靜脈采集動物外周血，檢測血常規 (Rayto RT-7600S, USA)、生化(谷丙轉氨酶-ALT，尿素，血肌酐，膽固醇，甘油三脂，葡萄糖)[2]；ELISA分析兔外周血免疫細胞CD3(cluster differentiation 3) (QT-T98065, Qiyibio) T、CD19 (Ml027955,Mlbio) B細胞； 細胞因子IL(interleukin)-4 (CSB-E08745Rb,Cusabio)、IL-6(CSB-E06903Rb,Cusabio)、IFN(interferon)-γ(ER5400，solarbio)、TNF(tumor necrosis factor)-α(CSB-E06998Rb, Cusabio)等水平以明確動物免疫狀態的變化。1.3.4病理及免疫組織化學分析

照射結束后，動物用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)過量麻醉并放血致死，解剖取皮膚及其它組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，進行病理檢測；皮膚彈力纖維染色分析真皮內彈力纖維變化情況；免疫組織化學分析C-myc、P53、細胞周期蛋白D1(CCND1)等癌基因及抑癌基因的表達變化。

蘇木素-伊紅(HE)染色：切片脫蠟至水，經蘇木素染色,鹽酸酒精分化，氨水反藍后伊紅染色, 脫水透明封片,觀察組織病理改變。

皮膚彈性纖維染色(Gomori’s醛品紅)：切片脫蠟至水，經高錳酸鉀溶液氧化，草酸漂白，水洗入染液(配制：堿性品紅1 g，70%酒精98 mL，三聚乙醛1 mL，濃鹽酸1 mL)15 min，70%酒精分化，0.5%橙黃G對比染色后脫水透明封片。

免疫組織化學染色：切片脫蠟至水，抗原修復，封閉后加一抗C-myc(MD645-B,MDL),P53(ab194404,abcam),CCND1(ARP33370_P050,AVIVA SYSTEM BIOLOGY) ,4℃過夜，加相應二抗(PV9001,PV9002,購自中杉金橋)，DAB顯色，蘇木素復染，流水沖洗后，脫水透明封片。觀察這些因子在兩組動物皮膚的表達水平。

1.4數據分析

2　實驗結果

2.1臨床觀察

動物在照射過程中，皮膚未見紅腫異常表現。兩組動物的進食、體重測量結果未見明顯異常；動物的體溫除第3周、6周改變有差異(P< 0.05)外，其余時間段比較無差異。(圖1)

注：*:P<0.05，與對照組相比。圖1　動物體重、飲食和體溫隨時間改變Note. *:P<0.05,compared with control group.Fig.1　The weight, diet and body temperature of animals changed with time

2.2常規生化檢測

血常規檢測照射組白細胞較對照組增多(P< 0.05)，中間細胞(白細胞中的嗜酸、嗜堿、單核細胞)、淋巴細胞、中性粒細胞也增多，但差別無統計學意義。平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)和平均紅細胞容積(MCV)有所下降(P< 0.01)，但平均紅細胞血紅蛋白濃度并沒有異常改變，紅細胞分布變異系數(RDW-CV)升高(P< 0.01)。其余均未見異常改變。(圖2)

血生化檢測兩組動物血清谷丙轉氨酶(ALT)，血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)沒有明顯差異；血清尿素(UREA)和肌酐(CR)水平在照射組有所升高(P< 0.01)。(圖3)

2.3血液免疫學檢測

動物血液學檢測免疫細胞CD3T細胞含量兩組無差異，CD19B細胞在照射組升高(P< 0.05)；細胞因子檢測IL-4水平在照射組升高(P< 0.01)，IL-6,TNF-α，IFN-γ水平在兩組無明顯差別。(圖4)

注：*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組相比。圖2　血常規檢測Note. *：P<0.05；**：P<0.01, Compared with control group.Fig.2　Blood routine test

注：*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組相比。圖3　血生化檢測Note. *：P<0.05；**：P<0.01, Compared with control group.Fig.3　Hemorheological biochemical detection

注：*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組相比。圖4　血液免疫學改變Note. *：P<0.05；**：P<0.01, Compared with control group.Fig.4　Hemorheological immunologic changes

圖5　皮膚蘇木素-伊紅(HE)和彈性纖維染色(Bar=100 μm)Fig.5　The htoxylin-eosin(HE)and elastic fiber staining of skin

2.4病理檢測

組織病理蘇木素-伊紅染色顯示，兩組動物皮膚各層結構未見異常改變，層次清楚，少數皮膚真皮少量炎細胞浸潤；皮膚彈性纖維染色顯示分布無異常(圖5)；其余各臟器病理改變未見異常。

皮膚免疫組化檢測結果為細胞周期蛋白(Cyclin D1，CCND1)，C-Myc癌基因蛋白，P53抑癌基因表達蛋白兩組均無明顯差異。(圖6,7)

圖6　皮膚免疫組化染色(Bar=50 μm)Fig.6　The immunohistochemical staining of skin

圖7　皮膚免疫組化染色統計結果Fig.7　The statistical results of immunohistochemical staining in skin

3　討論

LED光源目前已在某些領域被廣泛應用，甚至未來會替代傳統照明光源用于室內照明，但我們應該對LED光源的長時間使用的安全性進行初步的認識和評價。本研究用LED白光照射日本大耳白兔3個月，觀察其生理、生化、免疫、病理指標及致癌作用等方面進行初步觀察，或以后進行更長時間，更深入、系統的檢測來確定其使用系數的絕對安全性。

實驗組動物在照射過程中，LED光源對其體重、進食未引起明顯異常改變，體溫雖在某個階段與對照組存在差別，但體溫的測量值均在兔的體溫波動正常范圍內[3]，因此改變無意義。

血常規檢測照射組動物白細胞增多，但據文獻報道兔的血白細胞正常值變化范圍為(5.5～12.5)×109/L[4],所測結果包含在此范圍內，屬于正常。血常規中平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)是反映紅細胞形態特征的指標，獨立的指標改變不能作為疾病診斷的依據，需結合紅細胞體積分布寬度(RDW)相互參照才能用來判斷機體生理生化狀況[5]，而本研究中MCHC并未發現異常，MCV，MCH，RDW雖然兩組比較后有差異，但根據文獻[3，5]報道的這些指標的參考值范圍，本實驗所測結果基本正常，所以改變的意義不大。照射3月后的實驗組兔血生化檢測肌酐、尿素氮水平較對照組增高，但文獻[5-7]報道的這些指標參考值范圍均包含該實驗所測結果，因此兔的這些常規生化指標的改變雖波動范圍大但正常。血液免疫細胞及細胞因子檢測結果CD19B淋巴細胞增多，IL-4增多，其余檢測指標結果與對照組無差別。B淋巴細胞主要作用是產生抗體，參與體液免疫應答并清除抗原，而IL-4可以促進B淋巴細胞增殖[8]，這說明動物體內可能存在B細胞免疫反應，該免疫反應是機體的一種適應和防御反應。結合組織病理學結果，對照及實驗組動物均有皮膚、肺臟等少數組織出現輕度炎癥反應，考慮原因可能為實驗操作、動物的應激[9]、加之動物的個體差異，而引起動物機體的不同程度的炎癥反應及表現。例如動物接受毛發修剪的過程中，固定架對動物身體的固定，及剃毛器對皮膚的刺激等，雖手法和其它條件一致，但不可避免會引起動物不同程度的掙扎、損傷及生理反應改變，進而造成機體不同程度的免疫功能紊亂及炎癥反應。

病理學檢測對照及實驗組動物除皮膚、肺臟等少數組織出現輕度炎癥反應外，其余臟器均未見明顯異常器質性病變。皮膚腫瘤相關因子的免疫組化檢測顯示兩組動物無明顯差別。細胞周期蛋白Cyclin D1是細胞周期中短暫出現的原癌基因表達產物，具有嚴格的周期順序性，主要功能是促進細胞增殖，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化[10]，實驗證明在照射組和對照組表達無明顯差別，照射并未引起其過度表達；C-Myc癌基因是myc基因家族的重要成員之一，c-myc基因既是一種可易位基因，又是一種多種物質調節的可調節基因，C-myc基因的表達一般與細胞的生長狀態有關，C-myc與許多惡性腫瘤的發生、發展密切相關，其蛋白高表達在細胞惡性轉化和增殖中起到重要作用[11],實驗表明兩組動物C-myc癌基因的表達也無明顯差異；P53是最重要的抑癌基因，對腫瘤細胞的凋亡具有促進作用，還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能[12]。正常條件下，P53蛋白在細胞內的含量維持在一個較低的水平，當細胞發生DNA損傷或原癌基因突變激活時，細胞內含量隨即升高，引發一系列下游段應激反應[13]。在各種腫瘤及細胞轉化過程中會高表達，P53突變和過度表達對腫瘤的發生發展起到一定的作用[14]。本實驗研究表明兩組動物皮膚P53蛋白均低表達或不表達。

綜上，LED白色光源照射日本大耳白兔3個月，某些常規生化指標較對照組有差別，但不具有生理學意義；血液免疫指標部分也存在差別，但不能排除動物因個體差異、操作及應激致炎性病變后引起的免疫反應，而且屬于輕度炎性反應；組織學觀察未見明顯的病理性損傷；皮膚腫瘤學觀察未見相關腫瘤分子相對的異常表達；這些實驗表明LED光源照射3個月，未對動物身體造成明顯的病理損傷。但是將LED燈取代照明燈后更長時間的照射安全性問題，仍需進行深入系統的實驗研究。

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The safety assessment on the light emitting diode (LED) resource through irradiating the skin of Japanese big-ear white rabbits

LI Yan-hong1, ZHANG Ji-gang2, XU Yan-feng1, HAN Yun-lin1, HUANG Lan1,JIANG Bin-bin2, ZHU Hua1, XU Yu-huan1, YANG Wei-ling2*, QIN Chuan1*

(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health; Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine；Beijing key Laboratory for Animal Models of Emerging and Reemerging infectious Disease;Peking Union Medicine College, Beijing 100021, China; 2.The General Hospital of the PLA Rocket Force, Beijing 100088, China)

ObjectiveTo evaluate the safety of Light emitting diode (LED) source through irradiating the skin of Japanese big-ear white rabbits. Methods Animals were randomly divided into irradiated group and control group. Animals in the two groups were irradiated with LED light source after eliminating back hair (50mw/cm2) and the ordinary fluorescent lamp, respectively. The animals were irradiated for 5 hours every day for 3 months. The changes of animal skin symptoms, feeding, body weight, and temperature were observed and detected; the blood routine and biochemical indexes were tested; the changes of haematological immune cells and cytokines were analyzed by ELISA; histopathology and elastic fibers of skin were detected; the levels of C-myc, P53, and cyclin D1 in skin were tested by immunohistochemistry. ResultsThe skin of rabbits in irradiated group showed no abnormal change; the weight was higher than the control group animals at the 6th week, and the temperature had difference at the 3rd and 6th week, the diet showed no abnormal. Blood routine showed white blood cells increased; biochemical detection manifested urea and creatinine levels increased, but the indexes are in normal range; the hematological CD3T cells, cytokines IL-6,TNF-α and IFN-γ in the two group animals had no significant difference. The levels of CD19B cell and IL-4 level increased in irradiated group; The viscera histopathology structure and skin elastic fibers distribution in irradiated group animals showed normal; the expression of cell cycle protein 1 (CCND1), c-myc protein and P53 protein in skin of irradiated group had no difference with control. ConclusionsAfter irradiating 3 months, the LED light source had not caused the obvious pathology damage of tissues and change of skin tumor related factors to the rabbits.

Light emitting diode; Japanese big-ear white rabbit; Skin; Safety assessment

十二五重大科技專項(2012ZX10004-501)；國家高技術研究發展計劃(863計劃)課題子任務(2003AA123310)。

李彥紅(1983-)，女，碩士，研究方向：病理學與病理生理學。E-mail:liyanhong8408@163.com；張繼剛，男，副主任醫師。Email:jigang_zhang@sina.com。

秦川，女，教授。Email:qinchuan@pumc.edu.cn；楊維玲，女，主任醫師。Email:ywlderma@sina.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0024-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.004

2016-01-06