產細菌纖維素菌培養基的研究探討

應以堅，周丹丹，王雪奇（.臺州市環境監測中心站； .臺州市環境科學設計研究院，浙江 臺州 8000；.杭州友源環保科技有限公司，杭州 0000）

產細菌纖維素菌培養基的研究探討

應以堅1，周丹丹2，王雪奇3
（1.臺州市環境監測中心站； 2.臺州市環境科學設計研究院，浙江 臺州 318000；3.杭州友源環保科技有限公司，杭州 310000）

本文研究產了纖維素菌培養基的優化，選取葡萄糖為碳源，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀為不同氮源，選擇最佳pH值。通過分析培養基的纖維素膜重、pH值、總酸、殘糖、OD值，發現以葡萄糖為碳源，以牛肉膏為氮源，pH值為5時，纖維素菌生長情況比較好，而且纖維素產量也比較高。

纖維素菌；培養基；研究探討

0　引言

細菌纖維素的生物合成是一個復雜的過程，為了提高其產量可以從多方面人手，找尋其它適合的菌株和比較合適的有利于菌體生長的條件以及發酵方式是一個比較可行的途徑。在發件培養基培養條件的優化方面，我們采取了Placket.Burrnan試驗設計和響應面分析方法。在本次試驗中通過培養基條件的優化，來提高細菌纖維素的產量。在培養基條件優化方面選取了幾個不同的因素，以葡萄糖為碳源時，分別選取氮源、培養基的PH值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

菌種：木醋桿菌，為本實驗室的保藏菌種。

1.1.2試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸鎂、氫氧化鈉、生理鹽水、冰醋酸、醋酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鈉、濃鹽酸、亞甲基藍、甲基紅、酚酞、蒸餾水、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀。

1.1.3儀器

MJX型生化培養箱、恒溫恒濕培養箱、無菌操作臺、立式高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、烘箱、水浴鍋、UV752型紫外分光光度計、pHS-3CA型pH計、PB303-N型電子精密天平等。

1.2實驗方法

種子培養基的配制：用分析天平準確稱取葡萄糖3g，蛋白胨0.75g，酵母浸膏0.75g，十二水合磷酸氫二鈉1.022g，一水檸檬酸0.189g，硫酸鎂0.0375g，配制成150ml的種子培養基，PH調至5，配置后放入滅菌鍋，在120℃下滅菌20min。

菌體接種培養：在150ml種子培養基中接入少量紅茶菌，在28℃的搖床中震蕩培養，待種子培養液出現少量渾濁情況即可進行種子液的接種。

配制不同氮源培養基：用分析天平準確稱取葡萄糖1g，酵母浸膏0.250g，十二水合磷酸氫二鈉0.341g，一水合檸檬酸0.062g，硫酸鎂0.0124g，以不同的氮源為變量，分別加入酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀各0.250g，配制成50ml的培養基，并把pH調至5，平行三組。

配制不同pH值的培養基：用分析天平準確稱取葡萄糖1g，蛋白胨0.250g，酵母浸膏0.250g，十二水合磷酸氫二鈉0.341g，一水合檸檬酸0.062g，硫酸鎂0.012g，配制成50ml的培養基，并把pH分別調至3，4，5，6，平行三組。

把配制好的培養基放入滅菌鍋，在120℃下滅菌20min。滅完菌后在無菌操作臺進行種子液的接入，接種量為培養基含量的8%，即4ml。全部接好后，統一放入28℃恒溫培養箱中培養7天。

2　纖維素菌各理化指標測定

纖維素膜干重的測定：將平行組前兩組的纖維素膜從培養基中挑出然后用蒸餾水洗凈放進平板中用4.0%的NaOH浸末，在82℃下浸泡2h。用蒸餾水將纖維素膜洗至pH為7，放進烘箱干燥用差重法測干重。

pH的測定：用pH計測定培養液的pH值并記錄。

OD值的測定：平行組第三組的纖維素膜用蒸餾水洗凈，放入錐形瓶中加50ml醋酸鈉-醋酸緩沖液，再加2ml纖維素酶液放進搖床內振蕩，待纖維素膜全部溶解后過濾取濾液用紫外分光度計在600nm波長下測其吸光度并記錄。

總酸的測定：用10ml移液管取10ml培養液于100ml錐形瓶中，然后加50ml無二氧化碳水再加兩滴酚酞作指示劑，用NaOH標準液滴定至出現微紅色且30s內不褪色即為滴定終點，記錄堿式滴定管的始末讀數。

總糖的測定：用亞鐵氰化鉀法測定總糖的含量。分別配制好斐林甲液、好斐林乙液以及1g/L葡萄糖標準溶液。先做空白試驗。

3　結果與分析

3.1不同氮源對產纖維素菌的影響

表1　不同氮類對培養基總酸的影響

從圖可以看出以酵母膏為氮源的培養基，產纖維素菌生長比較出色，但是產生的膜并沒有以牛肉膏為氮源的重，說明菌體長得越出色并不能代表它所產生的菌膜越多。培養基的pH值相差不多，總體來說，以牛肉膏為氮源的培養基更有利于產纖維素菌產膜。

3.2不同pH值對產纖維素菌的影響

表2　不同pH值對培養基總酸的影響

當培養基pH值為3時，產纖維素菌沒有生長，所以也沒有產膜，當pH值逐漸上升至5時，產纖維素菌生長最為旺盛，產生的膜也最多，消耗的糖也最多，pH升到6時，產纖維素菌生長情況開始下降。說明適合產纖維素菌生長的最佳pH是5。

4　結論

以葡萄糖為碳源時，以不同氮源，培養基pH值的條件為變量，培養產纖維素菌，通過測量分析各培養基的理化指標：膜干重，菌體濃度，總酸，殘糖，pH值。綜上所述，以葡萄糖為碳源時，產纖維素菌最適生長和產膜的最適氮源是牛肉膏，最適pH值是5。

［1］茍金霞.醋酸菌生產細菌纖維素的研究［C］.陜西科技大學，2005：1-2.

［2］王淑芳，馬桂珍，石桐磊，暴增海.接種量和酸堿度對滑菇菌絲生長量的影響［J］.2011（21）：152-154.

10.16640/j.cnki.37-1222/t.2016.14.209