高效液相色譜法測定胃舒顆粒中柚皮苷的含量

劉曉麗

(泰安市中醫醫院藥劑科，山東 泰安　271000)

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高效液相色譜法測定胃舒顆粒中柚皮苷的含量

劉曉麗*

(泰安市中醫醫院藥劑科，山東 泰安271000)

目的：建立高效液相色譜法測定胃舒顆粒中柚皮苷含量的方法。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=18 ∶82)，檢測儀器為紫外檢測器，檢測波長為283 nm；進樣量為10 μl。結果：柚皮苷質量濃度在0.123 9～1.239 4 μg范圍內線性關系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.97%，RSD為0.66%。結論：本法測定柚皮苷簡便、準確、重現性好，可用于胃舒顆粒中柚皮苷的含量測定。

胃舒顆粒； 柚皮苷； 高效液相色譜法； 含量測定

胃舒顆粒是由枳殼、柴胡、醋香附等18味中藥材經提取、濃縮、加工制成的顆粒制劑，具有疏肝和胃、制酸止痛、健脾護胃的功效。檢索文獻及《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)，枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的作用，用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、臟器下垂[1]。枳殼為胃舒顆粒方中要藥，藥量較大，其所含成分主要為柚皮苷等黃酮類、生物堿類及揮發油類成分[2]。本研究以柚皮苷作為質控成分，采用高效液相色譜法測定胃舒顆粒中柚皮苷的含量。

1　材料

1.1儀器

島津ATY124型電子天平、高效液相色譜儀(LC-20 AB 泵、SIL-20 A 自動進樣器)(日本島津公司)；PQ3120型超聲儀(上海楚定分析儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑

胃舒顆粒(泰安市中醫醫院醫院制劑，批號：150525)；柚皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110722-201312，純度：94.7%)；乙腈(美國Sigma公司，色譜純)；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS-3)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測器：紫外檢測器；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=18 ∶82)；檢測波長：283 nm；進樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數以柚皮苷計≥3 000。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液：取本品適量，研細，精密稱定2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇溶液25 ml，密塞，稱定質量，超聲處理(功率為250 W，頻率為50 kHz)30 min，放冷，用30%甲醇溶液補足質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2對照品溶液：取柚皮苷對照品適量，精密稱定16.36 mg，置于50 ml容量瓶中，加30%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得柚皮苷對照品儲備液；精密量取上述儲備液5 ml，置于25 ml容量瓶中，加30%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得，含量為61.97 μg/ml。

2.2.3陰性對照溶液：取處方中除去枳殼的其他藥味，按處方比例制成缺枳殼陰性對照樣品，按照“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。

2.3 測定條件的考察

2.3.1測定波長的選擇：取柚皮苷對照品溶液加30%甲醇溶液稀釋后于190～400 nm光譜掃描，其最大吸收波長為283 nm，同時參考《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)“藥材”項下及文獻中柚皮苷含量測定檢測波長為283 nm[3]，經驗證樣品在波長為283 nm時吸收最大，雜質最少，因此確定283 nm為檢測波長。

2.3.2流動相的考察：以方中枳殼的質控成分柚皮苷為考察對象，參照《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)，以柚皮苷分離度、保留時間、對稱因子、理論塔板數等進行考察。精密吸取2份“2.2.2”項下對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，分別采用乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=18∶82)和乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=20∶80)洗脫[4]，其他色譜條件與“2.1”項下條件相符，觀察高效液相色譜圖，記錄峰面積，見表1。結果表明，選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=18∶82)為流動相的效果更好。

表1　流動相考察結果

2.3.3提取溶劑的考察：本品為原粉入藥制劑，參考《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)及文獻，柚皮苷在甲醇溶液、乙醇溶液中的溶解性較好[5]。采用30%甲醇溶液、100%甲醇溶液分別作為柚皮苷對照品的提取溶劑[6]，其他制備方法按照“2.2.2”項下方法制備柚皮苷甲醇溶液。精密吸取上述2種柚皮苷甲醇溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，采用“2.1”項下色譜條件，觀察高效液相色譜圖，記錄峰面積。結果顯示，采用30%甲醇溶液提取的樣品含量為0.791 4 mg/g、峰面積為1 144 917，采用100%甲醇溶液則分別為0.776 8 mg/g、1 123 803。表明采用30%甲醇溶液作為溶劑進行樣品提取，效果最佳。

2.4專屬性試驗

分別精密吸取同一批號樣品制備的供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀進行測定[7]。結果顯示，色譜圖中供試品溶液與對照品溶液在相同的位置上有相應色譜峰，陰性對照溶液上無相應色譜峰，說明處方中其他藥味對測定結果無干擾，見圖1。

A.對照品溶液； B.供試品溶液； C.陰性對照溶液A.reference substance solution； B.test sample solution；C.negative control solution圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatogram

2.5耐用性試驗

將檢測波長及色譜柱類型進行微小變動，其他參數不變，以含量為依據,考察方法耐用性。結果，不同檢測波長和色譜柱條件下測定RSD分別為0.502 0%、0.098 4%，表明本方法耐用性良好，見表2～3。

表2　檢測波長考察

表3　色譜柱考察

2.6線性范圍考察

精密吸取“2.2.2”項下對照品儲備液溶液2、5、10、15、20 ml分別用甲醇稀釋至50 ml，各取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，進樣質量(X，μg)為橫坐標進行線性回歸[8]，回歸方程為：Y=1 820 405.91X-6 403.21，相關系數r=0.999 9，結果表明柚皮苷溶液在0.123 9～1.239 4 μg呈良好的線性關系，見圖2。

圖2　柚皮苷標準曲線Fig 2　Standard curve of naringin

2.7精密度考察

精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，柚皮苷峰面積的RSD=0.048%(n=6)，表明儀器精密度[9]良好。

2.8中間精密度考察

取本品，研細，精密稱定樣品2 g，根據“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，在同一實驗室，考察不同操作人、不同時間、不同儀器的精密度，分別連續進樣3次，測得峰面積，計算含量。結果表明中間精密度良好，見表4。

2.9穩定性考察

精密量取“2.2.1”項下供試品溶液10 μl，分別于3、4、5、6、7、8 h，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。結果，柚皮苷峰面積的RSD=0.1645%，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好[10]，滿足測定需要。

2.10重復性考察

取同一批樣品(批號：150601)，平行取6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，每份平行進2針，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。結果柚皮苷峰面積的RSD=1.38%，表明本方法重復性良好。

表4　中間精密度考察

2.11加樣回收考察

經過查閱大量文獻[11-15]，加樣回收實驗如下：取本品適量，研細，平行取6份樣品約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入“2.2.2”項下柚皮苷對照品儲備液5 ml、30%甲醇溶液20 ml，密塞，稱定質量，超聲處理(功率為300 W，頻率為50 kHz)30 min，放冷，用30%甲醇補重，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。精密吸取上述6份供試品溶液及“2.2.2”項下對照品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果見表5。

表5　加樣回收率考察

2.12樣品含量測定

取各批次樣品適量，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別精密吸取樣品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算柚皮苷含量，見表6。

表6　樣品含量測定結果(n=6，mg/g)

3　討論

流動相考察中，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=20∶80)為流動相時，色譜圖出峰時間較短，且峰形較差，后有肩峰，分離度較差；采用乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=18∶82)為流動相時，色譜圖的出峰時間適中，分離度較好，主峰無拖尾現象，可以滿足檢測需求，因此選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液(V∶V=18∶82)為流動相。

按照《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)“藥材”項下質量進行折算：處方中藥材飲片質量×(1-含水量)×飲片中成分含量/處方質量×藥材成分測定轉移率×70%，暫定本品含量為每克含枳殼以柚皮苷(C27H32O14)計，不少于0.6 mg，經過對不同批次樣品含量測定，此限度合理。

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Content Determination of Naringin in Weisukeli by HPLC

LIU Xiaoli

(Dept.of Pharmacy, Taian Traditional Chinese Medicine Hospital, Shandong Taian 271000, China)

To establish the HPLC method for content determination of naringin in Weishukeli. METHODS: ODS-3 C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm)was used and the mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid solution (V∶V=18 ∶82) with UV detector，the detection wavelength was 283 nm and the sample size was 10 μl. RESULTS: The Linear range of the naringin in concentration was 0.123 9-1.239 4 μg(r=0.999 9). The average recovery rate was 99.97%,RSDwas 0.66%. CONCLUSIONS: The method is simple, accurate, and reproducible. It can be used to determine the content of naringin in Weishukeli.

Weishukeli; Naringin; HPLC; Content determination

R927.2

A

1672-2124(2016)08-1073-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.025

2016-01-15)

*主任藥師。研究方向：中藥制劑與中藥質量控制。E-mail：lxllvj@163.com