高效液相色譜法測定骨傷復元合劑中羥基紅花黃色素A的含量*

譚姣章，石　雕（湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院，湖南株洲412000）

高效液相色譜法測定骨傷復元合劑中羥基紅花黃色素A的含量*

譚姣章，石雕
（湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院，湖南株洲412000）

目的建立高效液相色譜法測定骨傷復元合劑中羥基紅花黃色素A含量的方法。方法采用色譜柱為Agilent 300StableBond-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長403 nm；進樣量10 μL。結果羥基紅花黃色素A在4.8～48.0 μg/mL內線性關系良好，回歸方程Y= 3 148X-34.2，r=0.999 8（n=6）；平均加樣回收率為98.51%，相對標準偏差（RSD）為0.53%（n=6）。結論高效液相色譜法簡便快速、結果準確、重復性好，可用于測定骨傷復元合劑中羥基紅花黃色素A的含量。

紅花；色素類；色譜法，高壓液相；骨傷復元合劑

骨傷復元合劑為本院自制制劑，由紅花、土鱉蟲、當歸、三七、丹參等藥組成，其主要功效為化淤止血、活血止痛、解毒消腫，臨床用于跌打損傷、創傷出血等證，具有良好的療效。方中紅花為君藥，具有活血通經，散淤止痛的功效，其主要有效活性成分為羥基紅花黃色素A。為了有效地控制骨傷復元合劑的質量，本研究采用高效液相色譜法測定羥基紅花黃色素A含量，以建立該藥品的含量測定方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（G1354A四元梯度泵、G1328B手動進樣器、G1314B紫外檢測器、G2170BA色譜工作站，美國Agilent公司）；KQ-1000DE型超聲波清洗器（江蘇省昆山超聲儀器有限公司）；FA1004N電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.1.2試藥羥基紅花黃色素A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-201106）；甲醇和乙腈溶液為色譜純；水為雙蒸水；其余實驗中試劑均為分析純；骨傷復元合劑（規格：100 mL/瓶，為本院自制，批號：130701、130702、130703）。

1.2方法

1.2.1色譜條件色譜柱：Agilent 300StableBond-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長403 nm；進樣量10 μL，按羥基紅花黃色素A色譜峰計算理論塔板數應大于或等于3 000。

1.2.2溶液的制備

1.2.2.1對照品溶液的制備取干燥至恒重的羥基紅花黃色素A對照品1.20 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，即得含羥基紅花黃色素A 48.0 μg/mL的溶液。該溶液作為線性關系考察和加樣回收試驗中的貯備液使用。

1.2.2.2樣品溶液的制備精密量取骨傷復元合劑1.0mL，置25 mL量瓶中，加25%甲醇定容，超聲器中處理15 min，3 000 r/min高速離心5 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.2.3陰性樣品溶液的制備按骨傷復元合劑制備工藝制備缺紅花的陰性樣品合劑，依照“1.2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。

1.2.3線性關系考察取“1.2.2.1”項下的貯備液，精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻。依次精密吸取各溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄測得的羥基紅花黃色素A色譜峰面積，以進樣量為橫坐標（X，μg）、以峰面積為縱坐標（Y，mAU）繪制標準曲線。

1.2.4精密度試驗吸取“1.2.2.1”項下的羥基紅花黃色素A對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄羥基紅花黃色素A對照品色譜峰面積，連續進樣6次。

1.2.5重復性試驗取骨傷復元合劑（批號：130701）適量，按照“1.2.2.2”項下方法平行制備6份樣品溶液，進樣10μL，記錄供試品中羥基紅花黃色素A色譜峰面積。

1.2.6穩定性試驗取骨傷復元合劑（批號：130701）供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24 h測定供試品中羥基紅花黃色素A的含量。

1.2.7加樣回收試驗吸取已知含量的骨傷復元合劑樣品（批號：130701）6份，每份約0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，各份精密加入一定量羥基紅花黃色素A對照品溶液，按“1.2.2.2”項下方法制得供試品溶液，依法測定羥基紅花黃色素A的含量，計算回收率。

1.2.8樣品含量測定取骨傷復元合劑樣品3批，根據測得的羥基紅花黃色素A峰面積計算樣品中羥基紅花黃色素A的含量。

2　結　果

2.1干擾性試驗在“1.2.1”色譜條件下，羥基紅花黃色素A色譜峰與其他組分色譜峰達基線分離，且分離度大于1.5；陰性對照品測定無干擾，方法專屬性好。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1　羥基紅花黃色素A色譜圖

2.2線性關系考察回歸方程為Y=3 148X-34.2，r= 0.999 8（n=6），結果表明羥基紅花黃色素A含量在4.8～48.0 μg/mL內線性關系良好。

2.3精密度試驗峰面積相對標準偏差（RSD）為0.67%，結果表明儀器具有良好的精密度。

2.4重復性試驗羥基紅花黃色素A的平均含量為0.5648mg/g，其RSD為1.12%，表明本方法的重復性良好。

2.5穩定性試驗RSD為0.85%，表明骨傷復元合劑供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.6加樣回收率試驗平均回收率為98.51%，RSD為0.53%，見表1。

表1　加樣回收試驗結果

2.7樣品含量測定樣品批號130701、130702、130703的羥基紅花黃色素A平均含量分別為：0.272 8、0.2707、0.266 4 mg/g，見表2。

表2　3批樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結果

3　討　論

羥基紅花黃色素A是紅花藥理功效最有效的水溶性部位，藥理實驗表明，其可抑制血小板激活因子誘發的血小板聚集與釋放，可競爭性地抑制血小板激活因子與血小板受體的結合，是紅花黃色素活血化瘀的有效成分。紅花是骨傷復元合劑的處方主藥，因此羥基紅花黃色素A的含量可正面反映該制劑質量的優劣。

本試驗在流動相選取過程中，比較了甲醇-乙腈-磷酸溶液系統［1-5］、甲醇-水-冰醋酸溶液系統［6-7］、乙腈-磷酸溶液系統［8-12］，并試驗了不同配比的流動相，最后選定甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液為流動相，既有適宜的保留時間，也得到較高的塔板數和分離度。

本試驗建立了高效液相色譜法測定骨傷復元合劑中羥基紅花黃色素A的方法，該方法快速簡便、分離效果好、結果準確、重復性好，可有效控制骨傷復元合劑中羥基紅花黃色素A的含量。

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Content determination of hydroxysafflor yellow A in Gushang Fuyuan Mixture by HPLC*

Tan Jiaozhang，Shi Diao（FirstAffiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College，Zhuzhou，Hunan 412000，China）

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of hydroxysafflor yellow A content in Gushang Fuyuan Mixture.MethodsThe chromatographic column Agilent 300StableBond-C18column（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）was used and the mobile phase was methanol-acetonitrile-0.7%phosphoric acid solution（26∶2∶72）.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 25℃and the detection wavelength was 403 nm.The injection volume was 10 μL.ResultsHydroxysafflor yellow A had good linear relation over the range of 4.8-48.0 μg/mL.The regression equation Y=3 148X-34.2，r=0.999 8（n=6）. The average recovery rate was 98.51%with RSD 0.53%（n=6）.ConclusionThe method is rapid and simple with accurate result and good reproducibility，and can be used for the content determination of hydroxysafflor yellow A in Gushang Fuyuan Mixture.

Carthamus tinctorius；Pigments；Chromatography，high pressure liquid；Gushang fuyuan mirture

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.006

A

1009-5519（2016）05-0654-02

湖南中醫藥管理局資助項目（201498）。

譚姣章（1972-），本科，副主任藥師，主要從事中藥新制劑研究與開發方面的研究。

（2015-11-11）